Xpert MTB/RIF 在肺結(jié)核病及耐藥結(jié)核菌檢測(cè)中的應(yīng)用價(jià)值

李 慧，閆彩霞，陳寶穎

（1.天津市西青醫(yī)院檢驗(yàn)科，天津 300380；2.聯(lián)勤保障部隊(duì)第九八三醫(yī)院檢驗(yàn)科，天津 300100；3.天津市寶坻區(qū)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，天津 301800）

結(jié)核病（tuberculosis）是臨床常見(jiàn)的傳染性疾病，并且已經(jīng)發(fā)展成為公共衛(wèi)生問(wèn)題，嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康安全[1]。結(jié)核菌的抵抗力非常強(qiáng)，可侵入人體各個(gè)器官，主要入侵肺臟，稱(chēng)為肺結(jié)核病[2]。積極預(yù)防和治療肺結(jié)核仍然是我國(guó)目前肺結(jié)核防治工作的核心。目前，肺結(jié)核病的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法較多，常見(jiàn)的方法包括痰液培養(yǎng)、藥敏試驗(yàn)[3]，其中痰涂片陽(yáng)性率相對(duì)較低，且結(jié)核桿菌培養(yǎng)條件要求較高。而藥敏試驗(yàn)周期較長(zhǎng)，容易造成漏診、誤診，會(huì)延誤患者的最佳治療[4]。隨著近年來(lái)分子生物學(xué)的發(fā)展，近年研究對(duì)結(jié)核桿菌基因組有了更深層次的認(rèn)識(shí)，出現(xiàn)了如Xpert MTB/RIF、基因芯片、分子線(xiàn)性探針技術(shù)等多種新型檢測(cè)方法[5]；其中Xpert MTB/RIF 是一種全自動(dòng)分子檢測(cè)技術(shù)，可用于肺結(jié)核菌和其耐藥性檢測(cè)[6]，但目前對(duì)肺結(jié)核菌和其耐藥性檢測(cè)的價(jià)值尚存在爭(zhēng)議，尤其是敏感度特異度等方面[7]。本研究結(jié)合2018年1月-2020年12 月我院診治的100例疑似肺結(jié)核病患者臨床資料，比較與常規(guī)檢測(cè)方法對(duì)肺結(jié)核病及耐藥結(jié)核菌檢測(cè)的情況，以期為肺結(jié)核病及耐藥結(jié)核菌檢測(cè)提供一定的參考依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018年1 月-2020年12 月在天津市西青醫(yī)院診治的100例肺結(jié)核病患者臨床資料，其中男47例，女53例；年齡23～79歲，平均年齡（54.20±3.56）歲；痰液癥狀：干酪痰樣34例，黏液痰樣50例，血痰16例。本研究經(jīng)過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者自愿參加本研究，并簽署知情同意書(shū)。

1.2 納入和排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合肺結(jié)核臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]；②依從性良好，能配合者；③隨訪(fǎng)資料完善。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并肝、腎、心、腦血管系統(tǒng)等嚴(yán)重疾病者；②合并惡性腫瘤晚期、急性冠脈綜合征、自身免疫性疾病導(dǎo)致的肺部病；③合并急性腦血管疾病。

1.3 方法 分別采用固體培養(yǎng)、抗酸染色法、Xpert MTB/RIF 檢測(cè)方法檢測(cè)患者痰液標(biāo)本，嚴(yán)格按照《結(jié)核病診斷細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)規(guī)程》[9]相關(guān)要求操作。

1.3.1 儀器和試劑 恒溫培養(yǎng)箱（SERIES 8000DH，美國(guó)Thermo Scientific 公司）、實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)儀（Gene Xpert，美國(guó)賽飛公司）、高速離心機(jī)（Z216MK，HERMLE 公司）、微量移液器（ACURA，SOCOREX公司）、電加熱箱（DHG-Ⅲ，上海圣試電子公司）、Xpert MTB/RIF 檢測(cè)系統(tǒng)（美國(guó)賽飛）、加熱凝固器（北京博奧公司）、冷藏箱（北京博奧公司）、反應(yīng)盒（北京博奧公司）、吸管（北京博奧公司）等。Xpert MTB/RIF 試劑盒、酸性培養(yǎng)基、藥敏培養(yǎng)基、肺結(jié)核分枝桿菌菌種鑒定試劑盒、菌耐藥結(jié)核菌試劑盒等，試劑盒均由廣州化學(xué)試劑公司提供。

1.3.2 具體方法 ①固體培養(yǎng)法：采用分枝桿菌菌種鑒定試劑盒、結(jié)核分枝桿菌耐藥檢測(cè)試劑盒檢測(cè)臨床常見(jiàn)的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群、胞內(nèi)分枝桿菌、鳥(niǎo)分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、恥垢分枝桿菌等17個(gè)種或群分枝桿菌；然后采用堿處理固體培養(yǎng)法進(jìn)行分離培養(yǎng)藥敏試驗(yàn)，無(wú)菌吸管分別吸取已準(zhǔn)備好的實(shí)驗(yàn)標(biāo)本（不同菌株的不同濃度菌懸液），保持固體培養(yǎng)基斜面水平，均勻接種至培養(yǎng)基斜面上，接種量為0.10～0.15 ml（約2～3 滴），接種時(shí)第1 滴菌液接種至培養(yǎng)基斜面中部，第2 滴接種至培養(yǎng)基斜面上部；于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每周觀察2 次并記錄試驗(yàn)結(jié)果，若結(jié)果為陽(yáng)性，則進(jìn)行比例法藥敏試驗(yàn)[10]；②抗酸染色：獲取痰液標(biāo)，在痰膜上蓋滿(mǎn)石炭酸復(fù)紅染液，火焰加熱至出現(xiàn)蒸汽后，脫離火焰，染色5 min 后洗去染色液，瀝干剩余的水加5%的鹽酸酒精脫色至無(wú)色，瀝干后加亞甲藍(lán)復(fù)染30 s，沖去復(fù)染液，自然干燥后鏡檢。參照《中國(guó)結(jié)核病防治規(guī)劃-痰涂片鏡檢標(biāo)準(zhǔn)化操作質(zhì)量保證手冊(cè)》給出光學(xué)顯微鏡檢查報(bào)告；③Xpert MTB/RIF 檢測(cè)：根據(jù)1∶2 的比例原則，將1 ml 的標(biāo)本溶于處理液中，在渦旋混合器上振蕩5 s，室溫放置15 min 后，吸取2 ml 裂解的樣品到試劑盒中即可開(kāi)始測(cè)試；利用菌吸管吸取混合液，吸取量為2 ml，緩慢轉(zhuǎn)移至一次性反應(yīng)盒中，然后立即放入Xpert MTB/RIF 檢測(cè)系統(tǒng)中進(jìn)行自動(dòng)檢測(cè)，并于2 h 后利用檢測(cè)軟件讀取數(shù)據(jù)。

1.4 觀察指標(biāo) 比較不同檢測(cè)方法檢測(cè)痰液標(biāo)本中結(jié)核桿菌及耐藥菌陽(yáng)性率以及抗酸染色法和Xpert MTB/RIF 檢測(cè)方法敏感度、特異度。敏感度[11]=真陽(yáng)性/（真陽(yáng)性+假陰性）×100%、特異度=真陰性/（真陰性+假陽(yáng)性）×100%。以傳統(tǒng)比例法藥敏試驗(yàn)為金標(biāo)準(zhǔn)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用統(tǒng)計(jì)軟件包SPSS 21.0 對(duì)本研究的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)量資料采用（）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用[n（%）]表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用受試者工作特征曲線(xiàn)（ROC）評(píng)價(jià)Xpert MTB/RIF檢測(cè)、抗酸染色法檢測(cè)法檢測(cè)肺結(jié)核病及耐藥結(jié)核菌的價(jià)值。

2 結(jié)果

2.1 不同檢測(cè)方法陽(yáng)性率比較 Xpert MTB/RIF 陽(yáng)性率高于固體培養(yǎng)法、抗酸染色法，且抗酸染色法的陽(yáng)性率低于固體培養(yǎng)法（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 不同檢測(cè)方法陽(yáng)性率比較[n（%）]

2.2 Xpert MTB/RIF 檢測(cè)和抗酸染色法敏感度、特異度比較 Xpert MTB/RIF 檢測(cè)結(jié)核桿菌敏感度、特異度均高于抗酸染色法（P＜0.05），見(jiàn)圖1、表2。

圖1 Xpert MTB/RIF 檢測(cè)和抗酸染色法敏感度、特異度ROC 曲線(xiàn)

表2 Xpert MTB/RIF 檢測(cè)和抗酸染色法敏感度、特異度比較

3 討論

肺結(jié)核病是一種傳染性疾病，且耐藥情況較為嚴(yán)重。傳統(tǒng)的結(jié)核菌檢測(cè)方式不僅操作復(fù)雜、周期長(zhǎng)，且特異度較低，嚴(yán)重影響藥敏結(jié)果的時(shí)效性[12]。因此，尋找診斷準(zhǔn)確性高，具有良好時(shí)效性的檢測(cè)方法對(duì)肺結(jié)核的診治至關(guān)重要。Xpert MTB/RIF 采用半巢式實(shí)時(shí)熒光PCR 法技術(shù)，對(duì)rpoB 基因81bp 利福平耐藥核心區(qū)間設(shè)計(jì)引物、探針，對(duì)其是否發(fā)生突變進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)對(duì)是否為肺結(jié)核病，或者是否對(duì)利福平耐藥進(jìn)行檢測(cè)[13]。研究顯示[14]，Xpert MTB/RIF檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)快速，但其檢測(cè)肺結(jié)核桿菌的敏感度、特異度上存在爭(zhēng)議，需要臨床進(jìn)一步進(jìn)行研究。

本研究結(jié)果顯示，Xpert MTB/RIF 陽(yáng)性率高于固體培養(yǎng)法、抗酸染色法，且抗酸染色法的陽(yáng)性率低于固體培養(yǎng)法（P＜0.05），提示在3 種檢測(cè)方法中Xpert MTB/RIF 檢測(cè)肺結(jié)核病及耐藥結(jié)核菌陽(yáng)性率最高，進(jìn)一步提示對(duì)臨床肺結(jié)核病中診出率較高，該結(jié)論與劉亞芹等[15]的研究結(jié)果基本一致。分析認(rèn)為，固體培養(yǎng)法在酸堿處理樣本時(shí)，可能對(duì)痰樣本造成一定程度損傷，從而影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。同時(shí)固體培養(yǎng)法手操作手法、環(huán)境因素影響較大，并且在染色過(guò)程中會(huì)造成樣本部分成分丟失，可能會(huì)造成陽(yáng)性檢出率減小。Xpert MTB/RIF 檢測(cè)系統(tǒng)屬于全自動(dòng)運(yùn)行，可降低或避免污染和人為因素影響，最大化提高臨床檢出率，從而提高檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性。同時(shí)本研究結(jié)果顯示，Xpert MTB/RIF 檢測(cè)結(jié)核桿菌敏感度、特異度均高于抗酸染色法（P＜0.05），提示肺結(jié)核桿菌采用Xpert MTB/RIF 檢測(cè)敏感度、特異度最高，可準(zhǔn)確判斷出患者是否有結(jié)核桿菌耐藥菌的感染，該結(jié)論與伊惠霞等[16]的報(bào)道相似。分析認(rèn)為，固體培養(yǎng)法檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)，不能滿(mǎn)足臨床需求，其敏感度、特異度缺少臨床意義。而Xpert MTB/RIF 檢測(cè)方法和抗酸染色方法比較，抗酸染色方法雖然具有操作簡(jiǎn)單的優(yōu)勢(shì)，但是敏感度和特異度較低，容易造成漏診和誤診。相比Xpert MTB/RIF 檢測(cè)技術(shù)更具有優(yōu)勢(shì)，所有檢測(cè)均是全自動(dòng)進(jìn)行，不僅操作簡(jiǎn)單、快速，且敏感度和特異度較高，可提高整體診斷準(zhǔn)確率。由于Xpert MTB/RIF 將常規(guī)核酸擴(kuò)增步驟整合，以少量MTB 病原菌DNA 為模板，擴(kuò)增、檢測(cè)，故檢出率較涂片鏡檢更高。因此，該檢測(cè)方法可作為臨床診斷肺結(jié)核的首選檢測(cè)方法進(jìn)行推薦，以滿(mǎn)足臨床早期診斷、發(fā)現(xiàn)和治療需求。

綜上所述，Xpert MTB/RIF 檢測(cè)肺結(jié)核病及耐藥結(jié)核菌敏感度、特異度均較高，具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。