PCSK9 與缺血性腦卒中關系的研究進展

馮金妹,牛爭平,王建紅

腦卒中是具有高發病率、致殘率、致死率的疾病,全球每年有1 370 萬人受腦卒中影響,導致550 萬人死亡,表明全球腦卒中負擔沉重[1]。在全球范圍內,腦卒中仍然是2019 年第二大死亡原因、第三大致殘原因[2],成為嚴重公共衛生問題。急性缺血性腦卒中是最常見的卒中類型,占我國腦卒中的69.6%～70.8%[3],而動脈粥樣硬化是導致缺血性腦卒中的主要原因之一。有報道指出低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)降低與動脈粥樣硬化性心血管疾病的風險降低相關,包括心血管疾病和腦卒中[4]。PCSK9 屬于分泌型絲氨酸蛋白酶家族,稱為原蛋白轉換酶(PCs)[5],是由1 號染色體上的PCSK9 基因編碼的,在許多組織和細胞中普遍表達[6]。PCSK9 由31～152 個殘基的原結構域、1～30個殘基的信號肽、153～451 個殘基的C 末端結構域和153～451 個殘基的催化區組成[7]。PCSK9 與低密度脂蛋白受體(LDLR)結合,導致其在細胞內降解,從而降低受體的活性,促進血清LDL-C 水平升高[8]。PCSK9 與缺血性腦卒中存在一定的相關性,并可能通過獨立于LDL-C 之外的途徑調節缺血性腦卒中的發生發展。

1 PCSK9 與動脈粥樣硬化

1.1 PCSK9 在血脂穩態中的作用 高水平的血清LDL-C 與心腦血管疾病,特別是缺血性腦卒中的風險相關。研究發現,成熟PCSK9 的主要作用是降低LDLR 在肝臟或周圍組織中的表達水平,從而間接阻止肝細胞和組織對LDL-C 的攝取[9]。成熟的PCSK9在蛋白質合成后,介導了未成熟的LDLR 從內質網到高爾基膜的運輸,也可與成熟的LDLR 結合,并通過網狀蛋白輕鏈/溶酶體的激活誘導其降解[10]。LDLR 聚集在肝細胞表面包被網狀蛋白的凹坑中,在與LDL-C結合后,產生一個內吞囊泡[11]。在囊泡中,LDLR 可以通過構象變化導致低密度脂蛋白顆粒釋放,LDLR 被循環回到肝細胞表面,從循環中提取更多的LDL-C,低密度脂蛋白顆粒運送到溶酶體被降解[11]。PCSK9 由肝細胞分泌,與LDLR 的表皮生長因子樣重復A 結構域(EGF-A)結合,當PCSK9-LDLR 復合體內化時,PCSK9 的存在阻止了LDLR 的構象變化[12]。有研究認為環化酶相關蛋白-1(CAP-1)是PCSK9 降解LDLR所必需的,PCSK9 能夠與CAP-1 相互作用,導致蛋白復合物LDLR/PCSK9/CAP-1 通過一種小窩蛋白依賴機制進入溶酶體降解,細胞表面的LDLR 減少,對LDL-C 清除能力下降[13]。

PCSK9 主要在肝臟表達,但也在肝外組織(如腸、腎臟和血管)表達。PCSK9 由腎臟和血管分泌進入循環,下調包括肝細胞和巨噬細胞在內的其他細胞的LDLR 水平,從而降低這些細胞對LDL-C 攝取[14]。在腸道中,PCSK9 主要通過減少血清LDL-C 的分泌而不是攝取來上調膽固醇水平[15]?；谶@些機制,使LDL-C在血漿中積聚,導致動脈粥樣硬化的發展。越來越多的研究表明,PCSK9 對血脂和動脈粥樣硬化的影響涉及的機制超出了對LDL-C 清除的調節。PCSK9 不僅能夠影響細胞LDLR 水平和對LDL-C 的攝取,還可與其他受體相互作用,如LDLR 相關蛋白1(LRP1)、載脂蛋白E 受體2(ApoER2)和CD36 等[16],其對膽固醇穩態的貢獻尚不清楚,可能與富含三酰甘油的脂蛋白代謝有關[17]。PCSK9 不僅通過減少肝臟脂蛋白清除,還通過促進肝臟脂肪生成來影響血脂和脂蛋白水平[18]。

1.2 PCSK9 在線粒體功能障礙中的作用 線粒體是參與誘導氧化應激的主要細胞成分。既往研究證實,過量的線粒體源性活性氧(mtROS)可誘導DNA、RNA、蛋白質和脂質過氧化損傷,導致線粒體功能障礙,從而促進動脈粥樣硬化的發展[19]。Ding 等[20]發現,用siRNA 敲除PCSK9 可抑制平滑肌細胞和內皮細胞中mtROS 的產生且PCSK9 以近線性的劑量依賴方式增加mtROS 的生成和mtDNA 損傷。這些作用共同促進細胞損傷,從而導致動脈粥樣硬化。

1.3 PCSK9 在細胞凋亡中的作用 血管內皮細胞和巨噬細胞的凋亡是動脈粥樣硬化的標志,內皮細胞過度凋亡改變了內皮的完整性,增加了通透性,從而促進了內皮功能障礙和動脈粥樣硬化的發生[21]。PCSK9通過Bcl-2/Bax-Caspase9-Caspase3 線粒體通路和p38/c-Jun 氨基端激酶(JNK)-有絲分裂原激活蛋白激酶(MAPK)信號通路誘導內皮細胞凋亡,改變內皮完整性,最終促進內皮功能障礙和動脈粥樣硬化的發生發展[15]。有研究發現細胞凋亡與PCSK9 在血管平滑肌細胞(VSMCs)中的表達有關。通過檢測Caspace-3、Bax 和Bcl-2 的表達,重組PCSK9 作用于VSMCs 會增加細胞凋亡,作為PCSK9 直接促凋亡作用的證據,用合成的PCSK9 抑制劑Pep2-8 作用于VSMCs 可減弱這一過程,提示存在因果關系[22]。

2 PCSK9 與炎癥

近年來,研究發現炎癥也是導致缺血性腦卒中的危險因素,治療炎癥可以降低缺血性腦卒中風險[23]。多區域正電子發射斷層-磁共振成像研究表明,亞臨床動脈粥樣硬化的中年個體存在動脈炎癥,提示動脈粥樣硬化早期存在炎癥狀態[24]。一些臨床試驗表明,循環中的PCSK9 水平可以作為無癥狀成年人頸動脈粥樣硬化的預測因子,并可能與頸動脈粥樣硬化的進展有關[25-26]。研究發現,全身炎癥反應綜合征和敗血癥病人血清PCSK9 水平升高[27],腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和內毒素可促進血管內皮細胞PCSK9 的表達[22]。PCSK9 的血清水平與促炎因子[白細胞介素(IL)-6、IL-1β、TNF-α、巨噬細胞集落刺激因子(MCSF)及超敏C 反應蛋白(hs-CRP)]之間存在顯著相關性[22],提示促炎環境增強PCSK9 的表達和釋放。PCSK9 本身也可增強炎癥。Tavori 等[28]發現脂多糖(LPS)處理后的PCSK9 基因缺失小鼠血清IL-1β水平顯著降低。重組PCSK9 能夠促進LPS 刺激巨噬細胞中促炎因子TNF-α和IL-1β 的 轉 錄,并 抑 制 抗 炎 因 子 mRNA 水 平。PCSK9 主要通過刺激炎性細胞因子的分泌、介導清道夫受體表達調控及誘導單核細胞遷移能力增強等機制促進炎癥的發展[15]。Tang 等[29]發現PCSK9 在動脈粥樣硬化斑塊中的表達水平增加,PCSK9 基因沉默的小鼠主動脈粥樣硬化斑塊較野生型少,以及病變中血管炎癥調節因子如IL-1β、TNF-α、單核細胞趨化蛋白1(MCP-1)、Toll 樣受體4(TLR4)和核轉錄因子-κB(NF-κB)的表達減少,表明PCSK9 似乎通過TLR4/NF-κB 信號通路加重血管炎癥而發揮炎癥介質的作用。有研究報道,用PCSK9 處理的巨噬細胞中,清道夫受體A(SR-A)、CD36 和凝集素樣氧化低密度脂蛋白受體1(LOX-1)的水平以及氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)攝取增加[30]。與PCSK9+/+細胞相比,PCSK9-/-小鼠平滑肌細胞的增殖和遷移能力較低[31]。Giunzioni 等[32]發現PCSK9在動脈粥樣硬化病變中逐漸積聚,導致炎性單核細胞的浸潤比對照組增加32%,從而促進炎癥的發展。

3 PCSK9 與血栓形成

血栓形成是缺血性腦卒中的主要病理過程,血小板活化、在血管損傷部位的聚集以及隨后血栓閉塞是動脈血栓性疾病的關鍵步驟[33]。最近的研究表明,PCSK9 可能也會影響止血系統[34]。Magwenzi 等[35]認為PCSK9 通過提高ox-LDL 水平導致血小板反應性增強,ox-LDL 通過CD36-PKC 信號通路增強煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶2(NOX2)依賴性活性氧(ROS)的生成,促進血小板活化。而Qi 等[36]研究發現,血漿中的PCSK9 直接促進血小板激活和體內血栓形成,PCSK9 與血小板CD36 受體結合,從而激活酪氨酸蛋白激酶(Src)、細胞外調節蛋白激酶(ERK)5 和JNK,增加ROS 的產生,并激活CD36 下游的p38/胞漿型磷脂酶A2(cPLA2)/環氧酶-1(COX-1)/血栓素A2(TXA2)信號通路,從而促進血小板激活,PCSK9 抑制劑或阿司匹林可消除PCSK9 對血小板激活和體內血栓形成的增強作用,預防血栓形成。該研究使用敲除CD36 的小鼠為模型發現PCSK9 對血小板活化的增強作用是CD36 依賴性的。

血小板也是PCSK9 的來源之一。血小板在激活時具有儲存PCSK9 和釋放儲存的PCSK9 的能力,釋放的PCSK9 可促進血小板聚集和血栓形成[37]。這些發現表明,循環中的血小板可能對血漿中PCSK9 的水平有影響,血小板源性PCSK9 的釋放可能參與調節血漿LDL-C 水平,并可能對血栓形成和血管炎癥產生影響,從而導致動脈粥樣硬化及血栓形成。

4 PCSK9 與糖尿病

多項研究表明,作為一種新的膽固醇代謝調節因子,PCSK9 也可能在2 型糖尿病(T2DM)的發生發展中發揮重要作用。既往研究表明,T2DM 病人血漿PCSK9 水平較高,循環PCSK9 濃度與血糖和T2DM風險呈正相關[38],下調PCSK9 可以改善脂肪和葡萄糖代謝[39]。Hamamura 等[40]研究了日本普通人群血清PCSK9 水平與脂代謝和胰島素抵抗的關系,認為在冠心病風險相對較低的日本人群中,高血清PCSK9 水平與血清三酰甘油和脂蛋白(a)水平以及胰島素抵抗有關。Shi 等[41]在以人群為基礎的隊列研究中發現在糖尿病前期女性受試者中,循環PCSK9 水平與發生2型糖尿病的風險呈正相關,在糖尿病前期男性受試者中沒有觀察到明顯的相關性。Momtazi-Borojeni 等[42]認為通過脂質體IFPT 疫苗抑制PCSK9 可以改善糖尿病病人的血糖、胰島素抵抗以及血脂譜。但亦有研究認為血漿PCSK9 水平與新發糖尿病風險無相關性[43]。目前關于PCSK9 和糖尿病之間的關系還沒有普遍的共識。

5 PCSK9 與其他腦血管病危險因素

PCSK9 除了影響脂蛋白的合成過程和促進動脈粥樣硬化的特性外,還在葡萄糖代謝、血壓調節、脂肪生成、血管舒縮功能等方面發揮作用[42,44]。PCSK9 可以通過促進腎小管上皮細胞的Na+通道降解,有助于血壓調節,有研究表明PCSK9 缺乏和PCSK9 抑制劑不會導致血壓的顯著變化,PCSK9 對血壓調節的影響似乎可以忽略不計[45]。有研究發現,在女性中,循環PCSK9 與高三酰甘油、高血壓和代謝綜合征呈正相關[46]。這表明循環PCSK9 升高與腦卒中危險因素顯著相關。一項研究報道,在使用PCSK9 抑制劑進行短期治療后,頸動脈-股動脈脈搏波速度有了顯著改善,這一結果是在LDL-C 升高的情況下實現的[44],提示PCSK9 可能通過獨立于LDL-C 之外的途徑對缺血性腦卒中多種危險因素產生影響。

6 PCSK9 抑制劑與腦卒中

PCSK9 抑制劑是一種新型的降脂藥物,通過與PCSK9 分子結合來減少LDLR 的降解。最近的研究表明,PCSK9 抑制劑可以降低高達60%的LDL-C 水平,并預防心腦血管事件[47]。降低PCSK9 的方法包括減少PCSK9 基因表達的小干擾RNA 和反義寡核苷酸,阻止PCSK9-LDLR 復合體形成的單克隆抗體,以及阻礙PCSK9 與LDLR 相互作用的高親和力模擬肽或合成蛋白[48]。

FOURIER 試驗是第一個成功完成的PCSK9 抑制劑的心腦血管結局試驗,共有27 564 例動脈粥樣硬化性心腦血管疾病病人(特別是有心肌梗死、缺血性腦卒中或有癥狀的外周動脈疾病的病人)參加,與安慰劑組相比,PCSK9 抑制劑依洛尤單抗治療顯著降低了主要終點(定義為心血管死亡、心肌梗死、腦卒中、冠狀動脈血運重建或因不穩定心絞痛住院)的風險和次要終點(心血管死亡、心肌梗死或腦卒中的綜合結果)的風險[49]。奧德賽試驗表明,PCSK9 抑制劑阿利西尤單抗與缺血性心腦血管事件的顯著減少有關[50]。一項包括ODYSSEY 結果和FOURIER 結果的薈萃分析得出結論,與安慰劑相比,PCSK9 抑制劑與腦卒中的相對風險降低相關。這種效果不受既往腦卒中史或基線LDL-C 水平的影響[51]。Qin 等[52]研究顯示,PCSK9 抑制劑使腦卒中的相對危險度(RR)降低23%,使缺血性腦卒中的RR降低24%,表明PCSK9 抑制劑與缺血性腦卒中相關,可有效降低缺血性腦卒中的發生率,且不增加出血性腦卒中和神經認知障礙的風險,安全性較好。

7 小結與展望

PCSK9 不僅通過增加肝臟表面LDLR 的降解,在調節膽固醇穩態方面發揮著重要作用,且通過LDLR以外的其他機制調節缺血性腦卒中的發生發展,在動脈粥樣硬化、炎癥、血栓形成、葡萄糖代謝等方面發揮重要作用。有研究表明,PCSK9 在血壓調節、脂肪生成、血管舒縮功能等方面有不同的作用,因此,有關PCSK9 在缺血性腦卒中產生的作用及其機制仍有待深入研究。PCSK9 作為降脂治療的新靶點目前受到廣泛的關注,PCSK9 抑制劑有效降低了未來發生包括缺血性腦卒中和短暫性腦缺血發作在內的心腦血管事件的風險,具有良好的安全性,可能是預防缺血性腦卒中的一種很好的策略和方法。