地黃對失眠小鼠視交叉上核生物鐘基因Clock及 Bmal1表達的影響*

河北中醫學院

楊偉麗 劉艷蕊 王 芮 魯 琴 王 茜 柴天川△(石家莊 050091)

提要 目的：通過觀察地黃對小鼠學習記憶、生物鐘基因Clock及 Bmal1表達的影響，探索地黃改善失眠及學習記憶的機制。方法：將60只昆明小鼠隨機分為4組：正常組、模型組、陽性藥組、生地黃組。除正常組外，其他各組腹腔注射對氯苯丙氨酸(PCPA)以制備睡眠剝奪模型。采用翻正反射實驗檢測小鼠的睡眠潛伏期及睡眠時間；尾動脈無創血壓測量分析系統檢測小鼠收縮壓、舒張壓和心率；Morris水迷宮檢測小鼠學習記憶能力； Real time-qPCR法檢測視交叉上核(SCN)中Clock、Bmal1 mRNA的表達；免疫組化法檢測SCN中Clock、Bmal1蛋白的表達。結果：與正常組小鼠比較，模型組小鼠睡眠發生率無變化、睡眠潛伏期明顯延長(P<0.05)，睡眠時間呈現縮短的趨勢；與模型組小鼠比較，藥物治療組小鼠睡眠發生率提高，睡眠潛伏期縮短，睡眠時間延長(P<0.05)。與正常組小鼠比較，模型組小鼠逃避潛伏期延長較為顯著，航行的總路程變長，穿過平臺所在區域的次數變少(P<0.05，P<0.01)；與模型組小鼠比較，藥物治療組小鼠的逃避潛伏期和行走的總路程縮短較為顯著(P<0.05，P<0.01)，穿過平臺區域的次數增多。與正常組小鼠比較，模型組小鼠的收縮壓、舒張壓和心率有升高趨勢；與模型組小鼠比較，藥物治療組小鼠收縮壓、舒張壓和心率有降低趨勢。與正常組小鼠比較，模型組小鼠Clock和Bmal1的mRNA、蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)；與模型組小鼠比較，藥物治療組Clock和Bmal1的mRNA、蛋白表達下降(P<0.05)。結論：生地黃能夠有效縮短睡眠剝奪小鼠的睡眠潛伏期，明顯延長睡眠持續時間，進而改善學習記憶能力，具有鎮靜催眠的作用，其作用機制可能與調節SCN中Clock和Bmal1的表達有著密切關系。

失眠，又稱之為“不寐”，主要表現為睡眠時間、深度的不足，輕者入睡困難，或寐而不酣，時寐時醒，或醒后不能再寐，重則徹夜不寐[1]。失眠癥在人群中普遍可見，流行病學調查顯示，我國各類睡眠障礙者約占總人口的38%，高于世界27%的比例，失眠患者占睡眠障礙患者的95%以上[2]。生地黃的原植物為玄參科植物地黃[Rehmanniaglutinosa(Gaert.) Libosch.,]用藥部位為其干燥塊根，具有清熱涼血、養陰生津的功效[3]。現代藥理研究顯示，地黃有抗抑郁、抑制中樞神經系統，改善認知和記憶能力的作用[4-6]。生物鐘是肌體一種內源性的調控系統，與睡眠有著密切的關系[7]。視交叉上核(SCN)內的生物鐘調節基因種類繁多，其中與失眠聯系緊密的有生物鐘基因Clock、時鐘管理基因 Bmal1、晶體蛋白基因Cry1和Cry2、系列周期基因Per1、Per2、Per3等[8]。相關研究顯示[9]，睡眠剝奪小鼠SCN中生物鐘基因Clock和Bmal1表達增高。前期研究表明[10]，地黃具有鎮靜安神的功效，但其改善失眠的作用是否與調節Clock、Baml1有關尚不明確。因此，本研究采用對氯苯丙氨酸(PCPA)法復制睡眠剝奪模型，RT-qPCR法和免疫組化法檢測SCN中Clock和Bmal1的表達，來探究地黃改善失眠的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 昆明小鼠，SPF級，雄性，體質量為(20±2)g，許可證號：SCXK(冀)2018-004，由河北醫科大學動物實驗中心提供，溫度和濕度保持恒定，光照采用12 h黑白循環，自由進食進水。本實驗已通過河北中醫學院倫理委員會的審查，批準號：DWLL2019004。

1.2 實驗藥物與試劑 生地黃配方顆粒(廣東一方制藥有限公司，批號：0071943)；地西泮片(河北省中醫院，批號：20200402)；對氯苯丙氨酸(PCPA，美國Sigma 公司，批號：1001542324)；戊巴比妥鈉(德國進口分裝，批號：020402)。

1.3 實驗儀器 大鼠Moriss水迷宮視頻分析系統(北京眾實迪創科技發展有限責任公司)；動物無創血壓分析系統(美國visitech)；SHA-B恒溫振動器(常州國華電器有限公司)；1-15K高速冷凍離心機(美國Sigma公司)，MDF-382E超低溫保存箱(日本三洋)；CFX96實時熒光定量PCR儀(英國BIO-RAD公司)；TDL-5-A離心機(上海安亭科學儀器廠)；MK3FC酶聯免疫檢測儀(美國Thomer Fisher公司)。

1.4 分組、造模及給藥 昆明小鼠60只首先適應性喂養1周，隨機分為正常組、模型組、陽性藥組、生地黃組，各組15只。模型組及各給藥組每天隨機給予夾尾2 min、冷水浴3 min、晝夜顛倒24 h、鼠籠45°傾斜24 h、交替鼠籠24 h、禁食不禁水24 h等外界刺激中的2種，連續4周，于最后1周的第4 d開始，連續3 d腹腔注射PCPA混懸液(450 mg/kg)，1次/d。正常組腹腔注射等劑量的生理鹽水。生地黃組小鼠灌胃給予含生藥量為2.25 g/kg的生地黃溶液；陽性藥組灌胃給予1.38 mg/kg的地西泮溶液；正常組和模型組小鼠灌胃給予等量的生理鹽水。用藥體積為0.01 mL/g，1次/d，連續給藥7 d。

1.5 指標檢測及方法

1.5.1 翻正反射實驗：末次給藥后，隨機從各組中選出8只小鼠腹腔注射3.5 mg/mL戊巴比妥鈉水溶液，記錄30 min內小鼠入睡數量，得出睡眠發生率。各組剩余的7只小鼠腹腔注射4.5 mg/mL戊巴比妥鈉水溶液，記錄30 min內小鼠的睡眠潛伏期以及睡眠的持續時間。其中戊巴比妥鈉用藥體積為0.01 mL/g。將小鼠于仰臥位放置，超過1 min無法翻正，即認為翻正反射消失，翻正反射消失為發生睡眠，翻正反射恢復為覺醒。睡眠潛伏期為從戊巴比妥鈉注射時開始至翻正反射消失的時間，睡眠時間為翻正反射消失到翻正反射恢復的時間。

1.5.2 Morris水迷宮實驗：給藥1周后，應用Morris水迷宮實驗評價各組小鼠的空間記憶及學習能力[11-12]。

Morris水迷宮訓練分為2部分。第1部分為定位航行實驗：整個實驗區域劃分為4個象限，每個象限壁上貼有不同顏色圖案的標志性卡片，將各組小鼠分別從各象限依次入水訓練，使其能夠自由地尋找平臺區域，觀察其產生的路徑圖并記錄其到達平臺區域所用的時間，此時間命名為逃避潛伏期。時間限定為1 min，若未到達平臺區域，記錄其逃避潛伏期為1 min，并且將其引導至平臺區域停留10 s，持續訓練5 d。第2部分為空間探索實驗：在平臺區域所在象限對側象限的中點作為入水點，面向池壁入水，記錄小鼠到達平臺區域所用的時間，判斷各組小鼠的記憶能力。

1.5.3 小鼠血壓、心率的檢測：末次給藥30 min后，運用動物無創血壓測量分析系統測量各組小鼠的收縮壓、舒張壓及心率，此過程中需要同一人進行操作。

1.5.4 Real time-PCR檢測下丘腦SCN中Clock、Bmal1表達 取SCN組織10 mg，用Trizol提取組織樣本中總RNA，測定RNA質量和濃度。按產品說明書的操作步驟進行反轉錄。再進行PCR擴增，擴增條件為：95 ℃、10 min預變性；95 ℃ 、10 s，58 ℃ 、60 s，完成40個循環。擴增完畢，得到目的基因及內參基因β-actin的Cq值，目的基因Cq值-β-actin Cq值=ΔCq；按照公式Q=2-ΔCq計算得到各目的基因的Q值及其均值，按照公式RQ值=Q值/Q均值計算得到各目的基因表達的相對定量值(RQ值)。Clock、Bmal1及內參β-actin 序列見表1。

表1 Clock、Bmal1和β-actin的引物序列表

1.5.5 免疫組化法檢測下丘腦SCN中Clock、Bmal1表達：實驗結束后，斷頭并迅速在冰上分離出下丘腦，在4%多聚甲醛中固定48 h。石蠟包埋，切片，脫水處理；滴加一抗Clock(1∶200)和Bmal1 (1∶100)，室溫孵育1 h；然后滴加二抗(1∶1 000)，室溫孵育1 min；PBS沖洗；DAB顯色液孵育5 min；水洗、復染、脫水、透明。鏡下觀察切片，從每組切片中隨機選取5個高倍(×400)視野，用Image Pro Plus 6.0對圖像進行處理并獲取平均光密度(OD)值。

2 實驗結果

2.1 各組小鼠睡眠發生率、睡眠潛伏期、睡眠時間的比較 與正常組小鼠相比較，模型組小鼠睡眠發生率無變化、睡眠潛伏期延長較為顯著(P<0.05)，小鼠的睡眠時間呈現縮短的趨勢；與模型組小鼠相比較，藥物治療組小鼠睡眠發生率提高，睡眠潛伏期縮短，睡眠時間延長(P<0.05)。詳見表2。

表2 各組睡眠發生率、睡眠潛伏期、睡眠時間的比較

2.2 各組小鼠水迷宮逃避潛伏期、總路程、穿越平臺次數比較 與正常組小鼠比較，模型組小鼠的逃避潛伏期及總路程延長較為顯著，穿越平臺次數顯著減少(P<0.05，P<0.01)；與模型組小鼠比較，藥物治療組小鼠逃避潛伏期和總路程明顯縮短(P<0.05，P<0.01)，穿越平臺次數呈現增多的趨勢。詳見表3。

表3 各組小鼠水迷宮逃避潛伏期、總路程、穿越平臺次數比較

2.3 各組小鼠收縮壓、舒張壓以及心率的比較 與正常組小鼠比較，模型組收縮壓、舒張壓和心率有升高的趨勢；與模型組小鼠比較，給藥組收縮壓、舒張壓和心率有降低的趨勢，但差異均無顯著性(P>0.05)。詳見表4。

2.4 各組小鼠SCN中Clock和Bmal1表達的比較 與正常組小鼠相比較，模型組小鼠Clock和Bmal1兩者的mRNA、蛋白表達水平升高顯著(P<0.05)；與模型組小鼠相比較，給藥組Clock和Bmal1的mRNA、蛋白表達水平下降(P<0.05)。詳見表5～表6、圖1～圖2。

表4 各組小鼠收縮壓、舒張壓、心率的比較

表5 各組小鼠SCN中Clock，Bmal1 mRNA表達的比較

表6 各組小鼠SCN中Clock，Bmal1的平均OD值比較

圖1 生地黃對睡眠剝奪小鼠SCN中Clock蛋白表達的影響(×400)

圖2 生地黃對睡眠剝奪小鼠SCN中Bmal1蛋白表達的影響(×400)

3 討論

良好的睡眠覺醒周期能夠有效消除肌體疲勞、增強免疫，并且對情緒調節、學習記憶等認知功能具有不可替代的調控作用[13]。失眠不僅可以造成認知障礙，還能夠影響人的學習記憶能力。研究表明[14]，PCPA是一種5-羥色胺的合成抑制劑，腹腔注射于小鼠體內，能夠抑制小鼠大腦內5-羥色胺的合成，導致睡眠晝夜節律消失，以致完全失眠，此模型造模時間較短，可重復性較強，是目前國內外較為公認的失眠模型[15]。PCPA可損傷小鼠的空間學習記憶能力，Morris水迷宮是檢測小鼠學習記憶能力的常見評估工具，本研究結果顯示：PCPA所致的模型組小鼠逃避潛伏期較長，總路程較長，穿越平臺次數較少，說明模型組失眠小鼠的學習記憶能力減弱。給藥后，生地黃組小鼠的逃避潛伏期明顯縮短，在池中航行的總路程顯著性縮短，在平臺區域穿越的次數也呈現增長趨勢，定位航行能力有了明顯改善。因此，可以推測出失眠導致小鼠的學習記憶等認知能力下降，而生地黃能夠有效的改善失眠小鼠的學習記憶能力。

有研究表明，地黃在抗焦慮，抗抑郁[3]，鎮靜催眠[16]方面有一定的作用。戊巴比妥鈉協同實驗方法為探討中藥治療失眠作用的經典方法，該方法將小鼠翻正反射消失作為觀察的指標[17]。有關研究顯示，有鎮靜催眠功效的藥物均能有效縮短戊巴比妥鈉閾上劑量誘導的小鼠睡眠潛伏期，提高閾下劑量誘導的睡眠發生率，延長睡眠持續時間[18]。本研究結果顯示，生地黃能夠有效地提高小鼠的睡眠發生率，縮短其睡眠潛伏期，延長其睡眠時間，尤其在縮短睡眠潛伏期方面作用明顯。提示地黃能夠在一定程度上發揮促進睡眠的作用。

睡眠-覺醒活動受睡眠節律基因的調控，在哺乳動物體內，生物鐘系統的結構比較復雜，是由SCN和附屬的外周生物鐘系統組成[19]。Clock、Bmal1基因是SCN中的2類興奮性調節基因，若其表達增高，則會引起神經興奮性的增強，從而造成睡眠質量下降、睡眠時間減少[20-21]。Clock基因的主要作用是維持睡眠的穩態，是最先被發現的生物鐘基因[22-23]。當Clock基因突變時，小鼠會極度興奮、睡眠時間減少, 多巴胺能神經元活性會增加[24-25]。Bmal1基因是轉錄起始的主要調節因子，并激活晝夜節律生物鐘基因表達[22]，其缺失會導致小鼠活動節律紊亂[26-27]。本研究結果顯示，睡眠剝奪的模型復制成功后，小鼠SCN中Clock、Bmal1基因和蛋白的表達水平升高；給予生地黃進行治療后，兩者的基因和蛋白表達水平明顯降低。提示生地黃可能通過降低SCN中Clock、Bmal1兩者的基因、蛋白水平的表達來治療失眠。

綜上所述，生地黃能夠有效縮短睡眠剝奪小鼠的睡眠潛伏期，并且能夠明顯延長睡眠剝奪小鼠的睡眠持續時間，進而改善學習記憶能力，可能與調節SCN中Clock和Bmal1的表達有關，有待開展更系統、嚴謹的研究加以驗證。