羽毛針禾根部內生假單胞菌XG11在小麥上的定殖動態及促生效應

李全芬， 張婷婷， 馬 磊

(石河子大學生命科學學院，新疆石河子 832000)

荒漠在地球上分布廣泛，荒漠化問題會影響人類的生產生活，危害地球的生態系統。羽毛針禾()是新疆沙漠上的先鋒植物，在與環境的長期斗爭中，形成了抗旱、耐高熱嚴寒、耐沙埋等沙生適應特性，其根鞘內的微生物及分泌物，能與根毛共同黏結沙粒，保水固沙。筆者所在課題組前期在羽毛針禾根部分離獲得了1株具有良好特性的內生假單胞菌XG11。研究羽毛針禾根部微生物的作用機制，對防治沙漠化和保護生物多樣性等方面有著重要意義。

假單胞菌()分布廣泛，在土壤細菌群落中占比可高達34%，定殖能力強，對多種植物病原菌有較明顯的拮抗作用，能夠有效促進植物生長和增產，是一類具有較大應用價值的植物根際促生菌，常用于植物來提高其抗逆性及增產。其中，熒光假單胞菌應用最廣泛。熒光假單胞菌不僅能抑制多種土傳病害病原真菌、卵菌、霉菌和線蟲，甚至通過分泌堿性磷酸酶在內的抗病毒蛋白抑制煙草花葉病毒(TMV)侵染；還能改善植物營養促進生長，提高品質，增加產量。

植物根際促生菌的作用機制主要包括生物固氮、磷溶作用、產生鐵載體(嗜鐵素)、產生促生物質、誘導抗性系統等，而且功能菌株在發揮作用機制時與其屬性、植物屬性、環境等情況相關。假單胞菌的誘導抗病性主要表現在提高寄主植株防御酶活性和影響寄主的次生代謝通路。逆境脅迫會使植物產生過量的活性氧自由基，同時植物會啟動自身的保護酶系統來調節抗氧化酶、抗氧化劑活性等生理生化過程，清除活性氧自由基，減輕或消除其毒害。鎘脅迫時，接種銅綠假單胞菌，增強了水稻抗氧化酶活性，提高了類黃酮和總酚等抗氧化物質含量，從而緩解逆境脅迫，促進水稻生長。熒光假單胞菌FP7菌液也能提高根莖組織中過氧化物酶、過氧化氫酶等防御酶的活性，增強根莖抗病性，具有促生和增產效果。

目前，利用功能微生物促生和防治的研究較多，而促生和防治效果與其在根際的定殖能力有關，菌株發揮作用的前提和關鍵就是其在作物根際建立起一定的種群密度。研究表明，功能菌株對21種抗生素的敏感值與其在土壤中的定殖能力具有相關性，這表明采用抗生素法能夠定性地探究菌株的定殖動態。

本研究采用抗生素標記法標記荒漠植物羽毛針禾根部內生假單胞菌XG11，通過盆栽試驗檢測該菌株在小麥植株根部、葉片及根際土壤中的定殖動態；比較不同培養方式下的定殖規律，同時通過測定株高、丙二醛含量、過氧化物酶活性等指標，鑒定該菌株對小麥植株生長發育的促生作用，旨在評價該菌株的應用潛力，為菌株有效提高植物的抗逆性提供理論依據，為解決荒漠化問題，改善生態環境提供新思路。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗時間及地點：本試驗于2020年在新疆石河子大學生命科學學院進行。

供試菌株：羽毛針禾根部內生假單胞菌XG11，該菌株為筆者所在課題組前期研究分離獲得。

受試植株：津農6號小麥，由石河子大學農學院惠贈。

供試培養基：牛肉膏蛋白胨培養基，LB培養基，含四環素、鏈霉素、羅紅霉素等抗生素的LB培養基。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株的天然抗藥性檢測 分別配制含濃度為20、50、100、200、300 μg/mL的四環素、鏈霉素、羅紅霉素的抗性LB培養基平板，對供試菌株XG11進行天然抗藥性檢測。取100 μL菌懸液(1環原始菌株溶于2 mL無菌水)均勻涂布在抗性平板上，以無抗生素的LB培養基平板為對照，重復3次，于 28 ℃ 培養24 h后觀察結果，以確定抗生素的標記種類及濃度。

1.2.2 抗生素標記菌株的篩選及穩定性分析 通過對菌株的抗藥性檢測，篩選出四環素作為抗藥性突變體的標記抗生素。逐步誘導菌株能在濃度為300 μg/mL的四環素抗性平板上穩定生長。將抗性菌株連續純化8次后，將其在無抗生素LB培養基平板上連續接種19次，再接入300 μg/mL四環素抗性平板，若菌株能夠生長，說明獲得的抗生素標記菌株具有良好的抗藥穩定性。把穩定性菌株純化，保存到 4 ℃，備用。

挑取原始菌株和單抗菌株單菌落，分別接入裝有5 mL LB培養基的試管中(編號分別為0、4、8、12、16、20、24 h)，于28 ℃、180 r/min振蕩培養，以未接菌的LB培養液為空白對照。按時間取出對應的試管，4 ℃冷藏保存，直到取完24 h的樣品后，在600 nm波長處測定吸光度()，以時間為橫軸、為縱軸繪制生長曲線，比較原始菌株和抗性菌株的生長速率。

1.2.3 抗性菌株在小麥根際的定殖動態 將標記菌株接種至LB液體培養基中培養3 d，10 000 r/min離心10 min，收集沉淀，配制成為1.0的菌懸液，4 ℃低溫保存備用。

挑選籽粒飽滿、健康、大小均勻、無霉變的小麥種子，用無菌水反復清洗3遍，置于無菌的9 cm培養皿中，加入15 mL無菌水，于30 ℃黑暗培養16 h，吸取代謝物后，CK加無菌水4 mL，其他的處理組加菌懸液4 mL，繼續黑暗培養8 h，待其露白。

培養皿試驗：在鋪有濾紙的11 cm培養皿中，加3 mL無菌水濕潤整張濾紙，挑選10粒露白發芽的小麥種子，種植方向、間隔保持一致，重復3次。置于人工氣候培養箱中，在白天28 ℃ 14 h、晚上22 ℃ 10 h的條件下培養。種下第1 天，CK組、菌懸液組都加6 mL無菌水，直到小麥全部發芽，CK組加 6 mL 無菌水，菌懸液組加6 mL菌懸液，此后不加菌懸液，根據實際情況，適當增加澆水量。于接種第7天采集根、葉子，用清水清洗，吸水紙吸干后，稱取根與葉組織0.5 g，在無菌環境下，用75%無水乙醇浸泡30 s，用無菌水清洗3次后，置于無菌研缽中，加入9 mL無菌水研磨充分，裝入10 mL無菌離心管振蕩30 min，充分混勻后，靜置10 min后用無菌水進行梯度稀釋，選擇10、10、10的土樣 200 μL 均勻涂布在含300 μg/mL四環素的LB培養基平板上，37 ℃培養48 h，記錄每皿菌落數，并計算每克鮮組織中的菌落數(CFU/g)。

盆栽試驗：在長4.8 cm、寬4.8 cm、高5.0 cm的無菌種植盤中裝入滅過2次菌的沙土，種植 10粒/孔露白發芽的小麥種子，種植方向、深度保持一致，每個處理重復5次。培養條件同培養皿試驗。于接種7、14、21、28 d后采集土壤(1.0 g)、根(0.5 g)與葉(0.5 g)，測定菌株的定殖含量，方法同培養皿試驗的菌株定殖測定。

1.2.4 菌株XG11對小麥的促生作用 參照“1.2.3”節中的方法制備=0.3的菌懸液和萌發小麥種子，并進行小麥盆栽試驗。每隔2 d澆灌菌懸液5 mL，根據實際情況，適當增加澆水量。在幼苗生長7、14、21、28 d后采樣，測定株高、丙二醛含量、過氧化物酶(peroxidase，POD)活性，并記錄發芽率。

1.3 數據分析

利用Excel 2019、GraphPad Prism 8.02軟件進行數據統計分析并作圖，采用單因素方差分析(one-way ANOVA)和Duncun’s法進行方差分析和多重比較(<0.05)。圖中數據形式為平均值±標準誤差。

2 結果與分析

2.1 菌株天然抗藥性篩選結果

由表1可知，羽毛針禾根部內生菌XG11對四環素、鏈霉素、羅紅霉素均具有天然抗性。在一定程度上，四環素具有較好的抗藥可控性。接種24 h，菌株可在含低濃度四環素的LB培養基平板上生長，而在較高濃度(200、300 μg/mL)下不生長。因此，本研究選用四環素對菌株進行標記。

表1 菌株XG11的天然抗藥性測定結果

2.2 標記菌株的穩定性檢測

進一步篩選出能耐300 μg/mL四環素的標記菌株。由圖1可知，經19次傳代培養后，其仍能在含抗生素的平板上穩定生長，而且標記菌株(XG11)和原始菌株(XG11)的生長曲線趨勢一致。標記菌株生長曲線略低于原始菌株，這可能是在誘變菌株時，有一定的損耗，但是不影響后續試驗的定殖檢測，說明標記菌株具有良好的抗藥穩定性。

2.3 標記菌株的定殖動態

利用含300 μg/mL四環素的LB培養基平板，檢測菌株XG11在小麥根際土壤、根與葉中的定殖數量及其動態變化規律。由圖2可知，隨著培養時間的延長，菌株在根際土壤和葉中的定殖量均呈現下降的趨勢；菌株在小麥根系中的定殖量呈現先降低后升高的趨勢，但是低于起初(7 d后)的定殖量。

在不同部位定殖具有一定差異。在7d后，葉中的定殖量略高于根際土壤和根(2.70×10CFU/g>2.33×10CFU/g>4.50×10CFU/g)；其他時間，菌株在不同部位中的定殖量呈現出根際土壤>根>葉。菌株在土壤和根部能夠定殖28 d，此時含量分別為 1.70×10、1.45×10CFU/g，而在葉片中只能定殖14 d。

2.4 2種培養方式下的菌株在小麥根與葉中的定殖量差異

采用土培(盆栽試驗)和水培(培養皿試驗)2種方式培養小麥。在小麥根部與葉片中的XG11定殖量及其定殖動態不同(圖3)。在相同培養時間(7 d)土培方式下根與葉中的XG11定殖量遠高于水培方式的定殖量。水培時，菌株XG11在根中的定殖量大于葉中；而土培時，定殖情況則相反，葉中的定殖量略高于根中。

2.5 菌株對小麥幼苗生長的影響

由圖4可知，接種假單胞菌XG11能夠促進小麥發芽、增加株高、提高葉片POD 活性，降低丙二醛含量，對小麥幼苗生長具有促生作用。處理3 d后，菌株XG11處理組和對照組的小麥發芽率一致，此后，隨著培養時間延長，菌株XG11處理的小麥發芽率均高于對照組，且菌株XG11處理組的小麥發芽率接近100%。除在14 d后外，菌株XG11處理的小麥株高均高于對照組。28 d后小麥的株高低于21 d后，可能是由于干旱脅迫加劇(沙土中利于植物生長的營養物質耗盡)，小麥植株開始死亡。

隨著培養時間延長，小麥葉片中丙二醛含量呈現先升高后降低的趨勢。接種菌株XG11，在7、28 d后，小麥葉片的丙二醛含量低于對照組，28 d后的丙二醛含量高于7 d后；14、21 d后與7、28 d后小麥葉片的丙二醛含量變化規律相反，菌株XG11處理組丙二醛含量高于對照組；21 d后的丙二醛含量最高，為0.030 4 μmol/g，比CK高12%；其次是28 d后的丙二醛含量，為 0.022 2 μmol/g，比CK低5%；7 d后的丙二醛含量最低，為0.013 3 μmol/g，比CK低2%(圖4)。

隨著培養時間延長，接種菌株XG11處理組，小麥葉片POD活性呈現先降低后升高的趨勢。在7、28 d后，小麥葉片POD活性高于對照組，28 d后的POD活性高于7 d后；14、21 d后與7、28 d后小麥葉片POD活性變化規律相反，POD活性低于對照組；28 d 后的POD活性最高，為13 860 U/(g·min)，比CK高2%；14 d后的POD活性最低，為 8 980 U/(g·min)，比CK低9%；7 d后的POD活性為9 860 U/(g·min)，比CK高45%(圖4)。

3 討論

植物根際促生菌在實際應用時，效果不穩定。造成不穩定的因素主要是植物根際促生菌的定殖能力存在差別。本試驗結果表明，菌株XG11在不同采集部位的定殖時間和定殖量及變化規律不同，在根際土壤和植株根內的定殖時間最長，均在28 d以上，而在葉片中只能夠定殖14 d左右，說明該菌株能在小麥植株體內和土壤中長期有效定殖。定殖量表現為根際土壤>根>葉，差異顯著，與姚錦愛等的研究結果一致。菌株XG11接種至小麥 21 d 內，在根際土壤、小麥根與葉中的定殖規律一樣，均呈現下降趨勢，這表明菌株的活性在降低，從而導致對植株的作用減弱。有研究表明，枯草芽孢桿菌在胡椒葉片上能夠定殖長達21 d，且定殖量呈現下降趨勢。熒光假單胞菌能在楊樹根際和菌根際長期穩定定殖，定殖規律一樣呈現下降態。

采用不同的培養方式，菌株XG11在小麥根與葉片中的定殖量差異顯著，定殖量表現為土培>水培，與劉東平等的研究結果相似。有研究表明，在進行菌株接種時采用灌根方式優于涂莖方式。因此，本研究發現在利用功能菌株XG11提高植物的抗逆性、抗病能力的最好方式是土壤培養植物，將菌株菌懸液澆灌到植物根圍。

種子發芽率是測試種子萌發能力強弱的一個指標，為選擇優勢種子提供理論基礎，甚至在逆境中，種子萌發率的高低與植株后來的生長狀況也密切相關。菌株XG11處理下，小麥發芽率趨近于100%，高于對照組，這表明菌株能提高小麥發芽率，和湯麗斯等的研究結果一致。

植物株高是描述植物形態性狀的指標，它能夠直觀地表現出植物的生長狀況，并且直接影響著植物的抗逆性和抗倒伏性，甚至嚴重影響著植物高產、穩產等狀況，也是一個衡量植物長勢、健康程度的重要指標。在7、21、28 d后，接種菌株XG11的小麥株高均高于對照組，表明菌株XG11利于植物生長。隨著培養時間延長，株高降低，可能是由于干旱脅迫加劇以及土壤養分減少所致，應須額外補充養分。

丙二醛是植物細胞膜在逆境脅迫下發生膜脂過氧化的產物，其可以交聯脂類、核酸、蛋白質、糖類等大分子結構物質，從而損害細胞質膜的結構和功能，能夠指示植物受到逆境脅迫的傷害程度。丙二醛含量越高，受到迫害越大，抗逆性越低。本研究結果表明，隨著培養時間延長，小麥葉片的丙二醛含量呈現先升高后降低的趨勢，28 d后的丙二醛含量低于21 d后，這表明隨著培養時間延長，植物受到的干旱脅迫加劇。施加菌株后，在7、 28 d 后，葉片丙二醛含量下降，說明菌株通過降低丙二醛的含量，從而緩解脅迫。

丙二醛含量與抗氧化酶活性呈現負相關，能反映小麥的品種特性。本研究發現接種菌株XG11后，小麥葉片POD活性與丙二醛含量變化規律呈現相反的趨勢，即小麥葉片POD活性呈現先降低后升高的趨勢，這可能是由于干旱脅迫加劇，植物體內產生了過量的活性氧自由基，需要更多的POD，從而抵抗逆境對植物的傷害。有研究表明，低濃度的硒可提高POD活性，增加青花菜幼苗的抗氧化能力，保護植物細胞膜穩定性，從而提高植物的抗逆性。本試驗中在根部接入菌株XG11使得小麥的POD活性增高，提高了植物的耐旱性與之相一致。內生細菌與氧化應激酶有一定的聯系，在鹽濃度下番茄的POD、過氧化氫酶(CAT)、多酚氧化酶(PPO)的活性降低，而經過內生細菌處理后，POD等這些酶活性提升3倍，并且內生細菌可以像植物生長調節劑一樣作用于植物，從而起到保護植物的作用。

綜上，接種菌株XG11，小麥的發芽率、株高、POD活性均高于對照組(28 d后)，丙二醛含量低于對照組(28 d后)，這可能都是由于菌株XG11在植物體內定殖成功，從而提高了植物的抗逆性、促進植物生長，高毓晗等的研究結果有力地支撐了此結論。

4 結論

荒漠植物羽毛針禾根部內生菌假單胞菌XG11能在小麥根部土壤及幼苗組織中定殖，在土壤和根內定殖時間長達28 d以上，且定殖量表現為根際土壤>根>葉，土壤盆栽>培養皿水培；能提高小麥發芽率、株高和POD活性，降低丙二醛含量，從而提高小麥的抗旱性，促進小麥幼苗的生長發育，是一株有潛力的促生菌。