亞熱帶地質貧富磷立地栗實象甲種群遺傳結構特征

姬華偉,任蕊,彭明俊,惠楠,劉春江

(1.陜西省地質調查院 陜西省水工環地質調查中心,西安 710068；2.云南省林業科學院,昆明 650201；3.上海交通大學 農業與生物學院,上海 200240；4.國家林業和草原局 上海城市森林生態系統國家定位觀測研究站,上海 200240；5.上海長三角人口密集區生態環境變化和綜合治理教育部野外科學研究站,上海 200240)

磷作為一種重要的生命元素，參與多種生物化學過程，同時磷對于許多關鍵化合物合成必不可少[1].因此，磷對動物生長、發育和繁殖非常重要.核酸中磷的質量分數(約9%)比其他生物分子都高.對于廣泛的分類群，磷向核酸的分配可以說是整個有機體磷含量變異的主要原因[2].WEIDER[3]發現，在過去40年間，人類活動導致的湖泊磷富集已顯著改變盔形溞(Daphniagaleata)的基因組成.水溞群體在對磷可利用性響應上表現出豐富的遺傳變異[4-5]，包括成千上萬基因的差異表達[6].同時，FRISCH[7]發現，水溞群體的遺傳和表型變化與磷可利用性高度相關.這些研究多集中于水生生物，并且更多關注養分含量變異直接對消費者產生的影響，而對基于地質的天然土壤元素含量變異立地的消費者研究較少.本研究團隊已對生長于富磷和貧磷立地的栓皮櫟葉片、果實及果實中栗實象甲(CurculiodavidiFairmaire)進行了很多研究[8-11]，發現在富磷立地和貧磷立地間，栓皮櫟葉片元素組成和代謝物組成具有顯著差異，栓皮櫟種子寄生蟲栗實象甲也表現出一些元素和代謝物含量的顯著差異.因此，進一步研究這兩種立地條件下栗實象甲種群的遺傳結構特征，可以更好地了解天然富磷和貧磷立地環境與植物寄生蟲遺傳多樣性的關系.

本研究以亞熱帶地質富磷土壤和典型貧磷天然生境的栓皮櫟寄生昆蟲栗實象甲為研究對象，采用簡化基因組雙酶切RAD-seq(double digest restriction-site associated DNA sequencing，ddRAD-seq)技術，選用限制性核酸內切酶HindIII和BfaI對個體基因組DNA進行雙酶切，構建栗實象甲的ddRAD文庫，為后續栗實象甲種群遺傳學等研究提供基礎數據，為進一步了解土壤富磷效應在寄生食物鏈上的傳遞及其對消費者的影響提供科學參考.

1 材料和方法

1.1 研究區域及研究對象概況

滇中地區是中國西南的一個主要富磷礦區，是中國最早的磷礦開采地點[12].此區域裸露磷礦石分布廣泛，露天開采成為當地采礦特點之一，給周邊生態環境帶來了嚴重挑戰[13].這些磷礦區和周邊非磷礦區形成了具有亞熱帶土壤鐵和鋁元素富集，以及硅和鹽基離子(例如，鈣和鎂)元素淋失匱乏的土壤特征[14]，同時又具有顯著磷富集的特征.例如，作為滇中高原富磷礦區的昆明及其周邊地區，其土壤磷含量可達到非磷礦區土壤的5倍[15].昆明市及其周邊地區形成的這種天然的土壤富磷效應以及亞熱帶土壤特有的土壤磷缺乏特征，影響了動植物磷含量和化學計量特征[8-11].落葉櫟樹栓皮櫟以純林或與其他樹種混交林廣泛分布于此區域.栓皮櫟的種子(果實)俗稱橡實，具有很高的營養價值.種子中寄生有一種全變態的寄生性栗實象甲.在長期的進化過程中，栓皮櫟種子和栗實象甲形成了一種典型的寄生食物鏈[8]，是研究食物鏈不同營養級生物遺傳多樣性與土壤元素含量關系的理想對象.

1.2 樣地選擇

貧磷和富磷地區間形成了化學成分組成差異明顯的磷礦石和非磷礦石，并且形成了土壤磷含量差異顯著的富磷立地和貧磷立地[8].貧磷和富磷兩種立地類型之間的氣候相似，其中年平均溫度是15.4 ℃，年平均降水量是936.5 mm.在這個研究區域，栓皮櫟成純林存在，或與麻櫟成混交林存在，或與麻櫟及其他樹種成混交林存在.遵循居群生態學的原理和方法[16]，且基于前期研究基礎[8]，在貧磷和富磷地區各選取3個栓皮櫟天然居群樣地，富磷立地樣地(形成于富含磷的磷礦石上)位于富磷磷礦石分布的昆明市，貧磷立地樣地(形成于非磷礦石上)位于楚雄市，富磷立地采樣點為植物園(ZW)(25°8′47″ N，102°44′57″ E)、黑龍潭公園(LT)(25°8′52″ N， 102°45′25″ E)和林科院(LKY)(25°8′57″ N， 102°45′11″ E)，貧磷立地采樣點為福龍村(FL)(25°14′49″ N， 101°32′6″ E)、桃園村(TG)(25°4′21″ N， 101°34′59″ E)和情人谷公園(QR)(25°4′30″ N， 101°37′16″ E).

1.3 栗實象甲幼蟲樣品采集

在貧磷和富磷立地選取的6個栓皮櫟天然居群樣地中，每個居群選取10棵生長良好的植株，每棵樹之間的水平距離或垂直距離不小于30 m.在秋季栓皮櫟種子成熟和凋落高峰期，采集每棵樹樹冠下(距樹干1.5 m內)自然掉落的種子1 kg，帶回實驗室后放于盆子中.待象甲幼蟲從種子中一爬出來立即放入裝有無水乙醇的離心管中，并存放于-80 ℃冰箱中待測.

栗實象甲在各種群櫟樹種子中的寄生率不同，每個種群中各選取6～10個象甲樣品.同時，根據前期的分析(主要是主成分分析、系統發生樹以及STRUCTURE聚類分析等)結果去掉了一些樣品，因此，可能造成了每個種群象甲數量不一致的情況，但同時主要選取形態一致且具有代表性的象甲幼蟲，可進行后續分析.

1.4 象甲幼蟲DNA提取，ddRAD-seq建庫，高通量測序

象甲幼蟲DNA提取方法為酚/氯仿/異戊醇提取法[17].測序文庫的制備參考PETERSON[18]描述的方法.對構建好的文庫使用派森諾公司的Illumina HiSeq 2000平臺進行高通量測序.

1.5 統計與分析

對于來自多個群體的樣本，采用stacks程序包中的populations命令進行群體遺傳多樣性分析(包括：觀測雜合度、期望雜合度以及核苷酸多樣性等)以及單倍型多樣性分析，然后進行Pairwise Fst統計.根據WRIGHT[19]建議，Fst值小于0.05時，群體間遺傳分化很小，可以不考慮；Fst值為0.05～0.15時，群體間存在一定程度的遺傳分化；Fst值為0.15～0.25時，群體間遺傳分化有顯著差異.基于所有個體的SNPs，利用Arlequin(version 3.5.2.2)軟件對種群分子變異進行分子方差分析.隨機選取2 500個SNPs位點，并采用Population(version 1.2.32)軟件進行Nei標準遺傳距離計算[20].Mantel檢驗采用R的外在軟件包vegan進行分析，迭代次數等于10 000.采用GCTA(http://www.complextraitgenomics.com/software/gcta/)軟件利用SNPs數據(去除MAF小于0.05的SNPs)進行主成分分析.采用Raxml(極大似然法)進行系統發育樹的構建，Raxml建樹的時候使用的模型為GTR GAMMA.建樹完成后，對系統發育樹分支的可靠性進行驗證(bootstrap，1 000 replications).采用MIGRATE-N軟件(http://popgen.sc.fsu.edu/Migrate/ Migrate-n.html)中Bayesian inference的策略估算群體間基因流流向，該軟件假設群體符合海島模型，隨機選取2 860個SNPs，遷移率M計算公式為Mij=mij/μ(Mij為種群i向種群j或種群j向種群i的擴散率)[21].最后，采用STRUCTURE軟件(http://pritch.bsd.uchicago.edu/structure.html)對6個栗實象甲群體中的38個個體進行SNPs差異性以及聚類分析，基于貝葉斯聚類方法[22].使用混合祖先模型進行預先分組(K)，預先分組數K設為2～10，每次重復8次，設置100 000次Burn-In，馬爾可夫鏈MCMC的長度為1 000 000.計算ΔK并確定最適遺傳分組數是依據EVANNO的方法[23].

2 結果和分析

由表1可知，在富磷和貧磷立地的6個栗實象甲種群中，遺傳多樣性度量值，如觀測雜合度、期望雜合度、核苷酸多樣性、單倍型數量以及單倍型多樣性等，表現出差異一致的變化.其中，除了觀測雜合度，富磷立地LKY,LT和ZW種群各個指標值均大于貧磷立地FL,QR和TG種群；并且富磷立地3個象甲種群期望雜合度和核苷酸多樣性的值均顯著大于貧磷立地3個象甲種群(p<0.001).以貧磷和富磷立地兩個群體為對象，在所有個體中共檢測到30 967個SNP.對貧磷立地種群和富磷立地種群進行多樣性分析表明，富磷立地種群觀測雜合度、期望雜合度以及核苷酸多樣性都顯著高于貧磷立地種群(p<0.001)(表2).

表1 栗實象甲6個種群的遺傳多樣性參數

表2 貧磷立地和富磷立地2個栗實象甲種群的遺傳多樣性參數

結果表明，富磷立地LKY,LT和ZW種群間分化程度較小，而貧磷和富磷立地大部分種群間有一定程度的分化(表3).Nei's標準遺傳距離分析結果(表4)與Fst結果相似，富磷立地3個種群間Nei氏標準遺傳距離(Ds)值相對較小，即遺傳距離較近，而貧磷和富磷立地各種群間遺傳距離相對較遠.群體間遺傳距離似乎與群體間地理距離有一定相關性.通過Mantel檢測，栗實象甲種群間遺傳距離和地理距離呈顯著正相關，表明栗實象甲種群間距離愈遠，種群間分化可能就愈大.基于隨機選取的2 860個SNPs，估算得到栗實象甲貧磷立地種群和富磷立地種群間的遷移率值.據此可以發現，貧磷立地種群和富磷立地種群之間的遷移明顯不對稱，貧磷立地種群向富磷立地種群的遷移率遠大于他們反方向的遷移率(表5).

表3 6個栗實象甲種群間的遺傳分化系數(Fst)

表4 6個栗實象甲種群間的Nei's標準遺傳距離

表5 種群間突變尺度的有效遷移率M估算值

由表6可知，當不考慮地理種群時，對分布于貧磷和富磷立地兩個象甲種群進行AMOVA分析，結果表明，3.21%的總體分子方差歸因于貧富磷立地之間，96.79%歸因于貧富磷立地內差異，分化系數Fst值為0.032 05；雖然貧磷和富磷立地兩個種群間的Fst值不高，但遺傳分化顯著(p<0.05).當考慮地理種群時，對貧磷立地3個種群和富磷立地3個種群進行Hierarchical AMOVA分析，結果表明，4.49%的總體分子方差歸因于貧磷和富磷立地間但分化不顯著，99.49%歸因于種群內個體間，但是差異不顯著.

表6 基于SNPs的栗實象甲在貧富磷立地間和立地內的AMOVA結果

基于13 940個SNPs位點數目，對6個種群38個栗實象甲個體進行主成分分析.結果表明，第一主成分(5.32%)將貧磷立地FL,QR和TG種群與富磷立地LKY,LT和ZW種群分成兩個顯著區分開的集群，并且富磷立地3個種群的集群內具有相對較高的遺傳變異水平(圖1).

依據種群間遺傳分化系數(Fst)構建的6個栗實象甲種群系統發育樹(圖2)顯示，貧磷立地QR和TG遺傳分化較小，富磷立地ZW和LT遺傳分化較小，而富磷立地種群與貧磷立地種群間遺傳分化水平相對較高.另外，基于Raxml的系統發育樹分析表明，富磷立地種群和貧磷立地種群明顯區分開，但是bootstrap值均較小；而富磷立地種群被顯著分成兩枝(bootstrap值等于83)，說明這兩枝個體間親緣關系相對較近(圖3).

根據過濾后8 281個SNPs信息，利用STRUCTURE軟件對6個栗實象甲種群進行群體聚類分析(圖4).從遺傳結構STRUCTURE圖上看，從K=2到K=10，貧磷立地3個種群始終聚在一起，顯示出單一的祖先來源，并且貧磷立地群體明顯與富磷立地群體相間隔開；而富磷立地3個種群的每個個體在每個組分中的概率分布表現出明顯的變化.結果和AMOVA分析結果相一致，種群遺傳差異主要來自個體間，也可以解釋為什么象甲6個種群間以及富磷貧磷立地間遺傳分化不顯著.根據DeltaK分布推測K=3時最可信.當K=3時，象甲6個種群沒有形成相互獨立的種群，貧磷立地3個種群明顯聚成了一組，富磷立地3個種群內部個體間出現了差異.

3 討 論

3.1 天然磷變異立地栗實象甲種群遺傳多樣性

鞘翅目昆蟲種類多，以多種植物為食，地理分布廣泛，具有較強生態適應性，形成了不同地理種群[24].同時，這類昆蟲也是農林作物的重要害蟲，對農林果業生產具有重要影響，栗實象甲即是典型代表.本研究發現，生長于富磷立地的栗實象甲種群遺傳多樣性水平普遍高于貧磷立地種群.貧磷和富磷立地相距120 km，氣候條件相似，而土壤母質基巖(富磷磷礦石和非磷礦石)化學成分組成不同，土壤營養元素(磷、氮、鈣、鎂、鐵、錳和鋁)含量差異顯著并影響到栓皮櫟葉片的生態化學計量和代謝物組成特征[8, 10]，同時也顯著影響栗實象甲的元素含量特點和代謝物組成[8- 9].在富磷和貧磷立地，栓皮櫟種子磷質量以及碳質量與磷質量的比值在兩種立地間差異顯著[8].有研究表明，海藻食物質量能影響水溞的覓食行為[25]，進而可能會影響其適應度.同時，這些效應反過來對這些種群的動態和微進化軌跡有潛在影響[26-27].因此，富磷和貧磷立地象甲種群遺傳多樣性的差異，可能是對土壤營養元素引起的食物質量差異的響應.這與前人的一些研究結果相似，ELSER等[28]認為，磷是核苷酸合成中必不可少的元素，長期磷缺乏環境會使得生物大分子表現出磷缺乏現象.WEIDER等[29]研究認為，植食性動物(水溞)物種間遺傳多樣性可能不僅受到不同食物數量還有不同食物質量的影響.在過去40年間，人類活動引起的湖泊磷富集已顯著改變了盔形溞(Daphniagaleata)的基因組成.由于對磷可利用性的響應，水溞群體表現出豐富的遺傳變異[4-5].FRISCH等[7]也發現，水溞群體的遺傳和表型變化與磷可利用性高度相關.在SCHADE等[30]的研究中，將磷生物地球化學與陸生食物鏈聯系起來，發現土壤磷通過改變寄主食物磷供給從而影響了植食性昆蟲的繁殖和生長能力.因此，長期的地質富磷和貧磷效應可能通過食物鏈對栗實象甲種群遺傳多樣性產生了影響.

另外，一些旨在評估金屬污染對動物種群遺傳多樣性影響的研究，得出的結果是不確定和矛盾的.有研究認為金屬污染物會降低種群遺傳多樣性[31]，有的則認為會增加種群遺傳多樣性[32]，也有認為不影響種群遺傳多樣性[33].GISKA等[34]分析了長期生長在重金屬(鎘、鉛、鋅)濃度梯度污染下的隱翅蟲種群遺傳多樣性，發現遺傳多樣性與金屬污染以及其他土壤特性都不存在相關性，但污染最嚴重地區隱翅蟲的遺傳多樣性相對最高，并且認為污染地區可能充當一個生態匯，從鄰近群體接收許多遷移個體.污染物可以通過4種進化過程來影響種群遺傳多樣性：遺傳漂變、選擇、遷移和突變[34]，因此，受污染影響的個體擴散可能導致污染地區由于個體遷入而遺傳多樣性水平增高[35].這和本研究結果一致，基因流分析表明，貧磷立地種群向富磷立地種群的遷移率遠大于他們反方向的遷移率，這說明貧磷立地栗實象甲種群為基因流的“源”，而富磷立地栗實象甲種群為基因流的“匯”，同時有研究發現“匯”種群比“源”種群具有更高的遺傳多樣性[36].因此，富磷地區可能是“污染地區”[37-38]，并且充當一個生態匯，而富磷地區栗實象甲種群遺傳多樣性高的原因則可能正是由于大量個體遷入導致的.

3.2 天然磷變異立地栗實象甲種群遺傳結構及變異特征

有關昆蟲遺傳多樣性和種群分化的研究表明，種群間遺傳分化取決于地理隔離作用和生境異質性，距離越遠分化越明顯，生境異質性越高遺傳分化程度越高[39].不同地理種群的遺傳距離與地理距離有一定的相關性[40-41]，這和本研究相符.本研究中，6個象甲種群間遺傳分化系數Fst值在0.041～0.081 8間，平均值為0.061，分化最大的FL和LT種群間地理距離達到123.5 km，分化最小的LKY和ZW地理距離達到7.3 km.同時，Mantel分析結果顯示，遺傳分化和地理距離顯著相關.這表明栗實象甲種群間的遺傳變異可能是由于地理隔離造成的，種群間存在著地理隔離效應.同時，環境選擇作用對昆蟲遺傳多樣性有重要影響[42-44]，即生境條件差異是造成昆蟲種群遺傳多樣性和種群分化的重要原因，其中非生物環境因子包括溫度、光照、白晝長度、濕度、土壤特性及營養狀況等.在本研究中，雖然6個栗實象甲種群間總體遺傳分化水平在整個基因組水平中較低，例如,平均群體間分化系數Fst值僅為0.061(范圍從0.041到0.082)，但貧磷立地和富磷立地各種群間存在一定程度的分化.并且structure聚類分析結果顯示，貧磷和富磷立地種群間遺傳來源組成差異較大，貧磷立地象甲種群祖先來源始終單一，只有富磷立地每個種群內部個體間出現了差異.這似乎解釋了為什么AMOVA分析中，考慮地理種群時，6個栗實象甲種群在貧富磷立地間、種群間以及種群內個體間遺傳分化都不顯著，但不考慮地理種群時，貧磷和富磷兩種立地兩個象甲種群間遺傳分化顯著的原因.

另外，主成分分析、系統發育樹、structure聚類分析等結果也表明，富磷立地象甲種群遺傳多樣性水平較高，貧磷立地種群與富磷立地種群間遺傳距離較遠，群體遺傳差異性大.這顯示了貧磷和富磷兩種立地間顯著的生境差異對栗實象甲種群遺傳結構的顯著影響.同時，這似乎也與象甲的擴散能力相關.有研究指出，栗實象甲幼蟲寄生于櫟樹種子中，并且在土壤中完成蛹化和羽化發育[45].而且，象蟲雖有翅膀，但是后翅退化，靠爬行移動，行動十分緩慢[46].此外，由于被象蟲產卵的櫟實等種子擴散距離較近，不能很好地促進象蟲擴散[47].因此，象甲生活史特征以及有限的擴散能力可能對其種群間遺傳分化產生了一定的促進作用.

4 結 論

生長于富磷立地的栗實象甲種群遺傳多樣性水平高于貧磷立地象甲種群，栗實象甲種群在貧富磷立地間、種群間以及種群內個體間分化都不顯著，但是貧磷和富磷兩種立地兩個栗實象甲群體間分化顯著.貧磷立地象甲種群與富磷立地象甲種群間遺傳距離較遠，群體遺傳來源組成差異較大.同時，栗實象甲種群間遺傳距離和地理距離顯著相關，群體間存在著地理隔離效應.因此，基于地質的貧磷和富磷效應影響下的立地生境差異可能與栗實象甲種群遺傳變異顯著相關；生長于富磷立地的栗實象甲種群遺傳多樣性水平高于貧磷立地象甲種群，可能是兩種立地引發的分化和選擇的結果，也可能是周邊大量個體遷入富磷立地導致的.