基于標準煎液的忘憂安神口服液量值傳遞相關性研究△

汪莉，賈妙婷，孫天雄，馮慧敏，李玥，何軍剛，羅旭東，梁婷婷，強正澤，李成義

甘肅中醫藥大學，甘肅 蘭州 730000

忘憂安神口服液是由甘肅中醫藥大學李成義教授臨床經典驗方開發而來的口服制劑，該方以經典名方甘麥大棗湯為基礎方，由甘肅地產藥材黃花菜、甘草等多味藥食同源的中藥組方而成，具有清心安神、化濁調脂的功效，在治療情緒低落、失眠多夢、食欲不振等亞健康癥狀上具有較好的臨床療效。

2017 年10 月，國家食品藥品監督管理局在《中藥經典名方復方制劑標準煎液的申報資料要求（征求意見稿）》中，提出關于中藥材、中藥飲片與物質基準之間主要物質群量值傳遞研究的概念。在研究過程中，應以浸出物、含量測定、指紋圖譜或特征圖譜等為指標，進行中藥飲片及對應實物間量值傳遞的分析[1]。近幾年，量值傳遞研究方法在經典名方物質基準的研究及質量控制方面得以廣泛應用[2-5]，但并未與成品制劑制備過程中的技術經濟指標評價相結合。研究表明，常規的提取、醇沉、濃縮、配劑等工藝過程均會導致制劑中活性成分的損失[6]。本研究遵循經典名方遵古溯源的研究思路[7]，以水為溶媒，采用水提醇沉法，制備10 批忘憂安神方標準煎液及口服液。對其指紋圖譜進行相似度評價、色譜峰指認及歸屬分析，初步確定標準煎液及口服液的出膏率、指標性成分含量及轉移率的質量控制范圍，研究忘憂安神口服液制備工藝過程中主要物質群量值傳遞相關性，探討活性成分的損失原因及減少其損失的方法，并結合口服液制備過程中的技術經濟指標，建立忘憂安神口服液制備工藝過程的評價方法，為忘憂安神口服液制備全過程的質量控制及其他復方制劑生產工藝過程的實施提供參考。

1 材料

1.1 儀器

1260 型二極管陣列檢測器高效液相色譜儀（美國安捷倫科技有限公司）；CAV214C 型電子分析天平（美國奧豪斯公司）；TGL-20B-C型高速臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）；YRE-301 型旋轉蒸發儀（鞏義市予華儀器有限責任公司）；101 型電熱鼓風干燥箱（北京科偉永興儀器有限公司）；Milli-Q Century型超純水機（德國默克公司）。

1.2 試藥

對照品梔子苷、甘草苷、槲皮苷、甘草酸銨（上海源葉生物科技有限公司，批號分別為：Y25J9C53637、Z28M10X84164、P19D10F106420、P13A9L67602）純度均≥98%；甲醇、乙腈、磷酸均為色譜純（天津市大茂化學試劑廠）。

處方中黃花菜購于各地藥材市場，其余飲片均采購于各大零售藥店。黃花菜在《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）2015 年版中未記載，經甘肅中醫藥大學藥學院李成義教授鑒定為百合科萱草屬植物黃花菜Hemerocallis citrinaBaroni的干燥花蕾；其余飲片均符合《中國藥典》2015 年版規定，10 批標準煎液及10 批口服液均為實驗室自制，各批標準煎液、口服液編號及其所對應梔子、甘草、合歡花飲片信息見表1。

表1 忘憂安神方標準煎液、口服液及其對應梔子、甘草、合歡花飲片信息

2 方法

2.1 指紋圖譜研究方法

2.1.1色譜條件 參照忘憂安神方前期研究[8]。

2.1.2供試品及對照品溶液的制備

2.1.2.1標準煎液樣品制備 分別稱取忘憂安神方處方飲片隨機組方，按忘憂安神方前期研究的最佳提取工藝提取并制備標準煎液（0.31 g·mL-1以生藥量計）T1～T10，冷藏備用。

2.1.2.2單味飲片制備 按照各單味藥在全方中的配比，分別稱取各單味藥，按2.1.2.1項下方法制備，備用。

2.1.2.3陰性對照制備 分別稱取除去各單味藥的其余飲片，按2.1.2.1項下方法制備缺失各單味藥的陰性對照溶液，備用。

2.1.2.4成品口服液樣品制備 分別稱取忘憂安神方處方飲片，10 批飲片隨機組方，按口服液制備工藝制備得10批成品口服液S1～S10，精密量取成品口服液0.62 mL，加水定容至10 mL（0.31 g·mL-1以生藥量計），備用。

2.1.2.5混合對照品溶液制備 分別精密稱取對照品梔子苷、甘草苷、槲皮苷、甘草酸銨適量，加甲醇配制成分別含梔子苷614 μg·mL-1、甘草苷92 μg·mL-1、槲皮苷195 μg·mL-1、甘草酸銨210 μg·mL-1的混合對照品母液。吸取對照品母液1 mL，加甲醇定容至5 mL，制成分別含梔子苷122.8 μg·mL-1、甘草苷18.4 μg·mL-1、槲皮苷39 μg·mL-1、甘草酸銨46.4 μg·mL-1的混合對照品溶液，即得。

2.1.2.6供試品溶液制備 依次精密吸取2.1.2.1項下的10批標準煎液樣品溶液、2.1.2.2項下的8個單味藥材樣品溶液，2.1.2.3項下的8 個陰性對照溶液，2.1.2.4項下的10 批成品口服液樣品溶液，各2 mL，置于10 mL量瓶中，加入水定容至刻度，搖勻，5000 r·min-1離心10 min（離心半徑為8 cm），取上清液，過0.45 μm 濾膜，即得標準煎液供試品溶液T1～T10、各單味藥供試品溶液、缺各單味藥的陰性對照溶液和成品口服液供試品溶液S1～S10。

2.1.3方法學考察

2.1.3.1精密度試驗 精密吸取同一供試品溶液（S1），按2.1.1項下色譜條件連續進樣6 次，記錄色譜圖，導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”（2012年版），計算指紋圖譜相似度。

2.1.3.2穩定性試驗 精密吸取同一供試品溶液（S1），按2.1.1下色譜條件分別于0、2、4、8、12、24 h 進樣，記錄色譜圖，導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”（2012 年版），計算指紋圖譜相似度。

2.1.3.3重復性試驗 精密吸取6 份S1 的樣品溶液，按2.1.2.6項下方法制備供試品溶液6份，再按2.1.1項下色譜條件進樣，記錄色譜圖，導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”（2012 年版），計算指紋圖譜相似度。

2.1.4指紋圖譜相似度評價、色譜峰歸屬及指認 分別精密吸取10 批全方標準煎液、10 批成品口服液、各單味藥、各陰性樣品和對照品供試品溶液，按照2.1.1項下色譜條件測定，記錄圖譜。測定結果以AIA 格式依次導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”（2012年版）。分別以T1、S1為參照圖譜，時間窗寬度為0.2 s，通過多點校正后，采用平均數相關系數法進行圖譜自動匹配，根據峰匹配結果，以峰面積和保留時間為參數，分別計算出10 批標準煎液、10 批口服液及口服液與標準煎液的相似度；將各單味藥、陰性對照、全方共有模式色譜峰進行匹配，同時比對各共有峰保留時間及紫外光譜圖，確定各共有峰歸屬；對比標準煎液、口服液、混合對照品指紋圖譜的出峰信息，進行色譜峰的指認。

2.2 指標成分轉移率研究方法

2.2.1忘憂安神方含量測定色譜條件 參照前期文獻研究忘憂安神方含量測定色譜條件[8]。

2.2.2供試品及對照品溶液制備

2.2.2.1供試品溶液制備 依次精密吸取2.1.2.1項下的10 批標準煎液樣品溶液、2.1.2.4項下的10批成品口服液樣品溶液各2 mL，置于10 mL 量瓶中，加入70%甲醇溶解并定容至刻度，超聲處理（180 W，35 kHz）30 min，冷卻至室溫；70%甲醇再定容至刻度，搖勻，5000 r·min-1離心10 min（離心半徑為8 cm），取上清液，過0.45 μm 濾膜，即得標準煎液含量測定供試品溶液T1～T10、成品口服液含量測定供試品溶液S1～S10。

2.2.2.2對照品溶液制備 精密量取2.1.2.5項下混合對照品母液適量，逐級稀釋成質量濃度分別為30.7、61.4、12.8、245.6、491.2、614.0 μg·mL-1的梔子苷；4.6、9.2、18.4、36.8、73.6、92.0 μg·mL-1的甘草苷；11.6、23.2、46.4、92.8、185.6、232.0 μg·mL-1的甘草酸銨；9.75、19.50、39.00、78.00、156.00、195.00 μg·mL-1的槲皮苷的混合對照品溶液。

2.2.3方法學考察

2.2.3.1標準曲線的建立 取2.2.2.2項下混合對照品溶液，按2.2.1項下色譜條件進樣，測定梔子苷、甘草苷、甘草酸、槲皮苷色譜峰面積，進行線性回歸。

2.2.3.2精密度試驗 取S1 供試品溶液，連續進樣6 次，按2.2.1項下色譜條件進樣檢測，考察精密度。

2.2.3.3穩定性試驗 取S1 供試品溶液，分別在0、4、8、12、24、36 h，按2.1.1項下色譜條件進樣檢測，考察穩定性。

2.2.3.4重復性試驗 取S1 供試品溶液6 份，按2.2.1項下色譜條件進樣檢測，考察重復性。

2.2.3.5加樣回收率試驗 精密量取已知含量的S1 標準煎液2 mL，加入適量的各對照品溶液，按2.2.2.1項下方法制備，按2.2.1項下色譜條件進樣檢測，計算4種指標成分的加樣回收率。

2.2.4指標成分含量測定方法 按照《中國藥典》2015 年版（一部）梔子、甘草、合歡花的含量測定方法測定其對應飲片中梔子苷、甘草苷、甘草酸、槲皮苷的含量[9]。根據2.2.1項下色譜條件測定標準煎液及口服液樣品中梔子苷、甘草苷、槲皮苷、甘草酸含量。

2.2.5指標成分轉移率 根據2.2.4項下測定結果，計算各指標成分轉移率。

其中，A為飲片中指標成分質量分數；B為全方標準煎液中指標成分質量分數；C為全方口服液中指標成分質量分數。

2.3 出膏率及傳遞率研究方法

取2.1.2.1 項下的10 批標準煎液樣品溶液，2.1.2.4項下的10 批成品口服液樣品溶液測定出膏率。

其中，Y為飲片投料量（g），V為全方標準煎液、口服液總體積，v為取樣體積，W為所得干膏量；傳遞率為口服液出膏率與標準煎液出膏率的比值。

3 結果與討論

3.1 指紋圖譜研究

3.1.1方法學考察 精密度、穩定性、重復性試驗中，得到的指紋圖譜的相似度均在0.9以上，表明儀器精密度、樣品在24 h內穩定性、方法重復性均良好。

3.1.2相似度評價 生成10 批標準煎液的高效液相色譜法（HPLC）指紋圖譜及其共有模式圖譜（R1，圖1），10 批口服液的HPLC 指紋圖譜及其共有模式圖譜（R2，圖2），進行相似度計算（表2～3）。結果顯示，10 批標準煎液、10 批次口服液供試品色譜圖與各自對照指紋圖譜相似度分別為0.943～0.995、0.952～0.994，說明本品的各工序樣品質量穩定性較好。以標準煎液的共有模式作為10批口服液S1～S10的參照圖譜，10 批口服液指紋圖譜與標準煎液共有模式圖譜R1 相似度為0.760～0.889，兩者之間的相似度差異主要由25號峰引起。經核對，口服液中25號峰為制劑成型過程中加入的防腐劑苯甲酸鈉，即成品口服液中的苯甲酸鈉，若在兩者相似度評價時屏蔽25 號峰，則兩者的相似度可達到0.9 以上，表明標準煎液主要藥效物質群基本傳遞到了成品口服液中，成型工藝穩定可靠，可用于口服液生產。

表2 10批忘憂安神標準煎液與其共有模式的相似度

圖1 10批忘憂安神方標準煎液指紋圖譜及對照圖譜

圖2 10批忘憂安神口服液指紋圖譜及對照圖譜

表3 10批忘憂安神口服液與其共有模式及標準煎液共有模式的相似度

3.1.3共有峰確立及指標成分標定 將標準煎液的共有模式、口服液共有模式圖譜以及混合對照品圖譜進行比較，見圖3。通過與混合對照品圖譜比對，確定17號峰對應梔子苷、24號峰對應甘草苷、26號峰為槲皮苷、35 號峰對應甘草酸。10 批標準煎液確定了36 個共有峰，10 批成品口服液確定了36 個共有峰，標準煎液中的各峰在口服液指紋圖譜中均有體現，表明忘憂安神口服液成型工藝未造成標準煎液主要物質群丟失，標準煎液中各物質基本傳遞到口服液。同一批口服液中除25 號峰外，其他峰的峰面積整體＜標準煎液，原因可能是口服液成型過程中濃縮純化、pH 的改變等導致部分成分含量有一定損失。后期研究中可進一步對濃縮、純化、pH 等關鍵工藝參數進行考察，通過優化調整工藝參數減少藥效成分的損失，提高忘憂安神口服液有效成分含量與穩定性。

圖3 忘憂安神方標準煎液、口服液與混合對照品HPLC 圖

3.1.4色譜峰歸屬分析 各單味藥對共有峰的貢獻程度有所差異，其中君藥黃花菜及梔子、甘草、合歡花4 味中藥對共有峰貢獻較大，共有峰中13、14號單獨來源于黃花菜，16、23、24、30～36 號單獨來源于甘草，11、15、17、28、29 號單獨來源于梔子，26 號單獨來源于合歡花，其他各味藥雖然對共有峰貢獻不大，但在標準煎液及口服液中也均有體現，提示忘憂安神口服液主要藥效物質群從飲片-標準煎液-口服液能逐級完整傳遞。

3.2 指標成分含量及轉移率

3.2.1含量測定方法學考察 方法學考察內容及結果見表4。結果顯示，忘憂安神方中梔子苷、甘草苷、槲皮苷、甘草酸含量測定方法線性、儀器精密度、方法重復性、樣品穩定性及方法加樣回收率均良好。

表4 忘憂安神方中指標成分含量測定方法學考察結果

3.2.2含量測定 飲片、標準煎液、口服液含量測定結果見表5～9，結果顯示，不同批次梔子、合歡花飲片中梔子苷、槲皮苷平均質量分數分別為59.74、20.29 mg·g-1，RSD 分別為13.85%、25.58%，表明不同批次梔子、合歡花飲片質量存在差異；不同批次甘草飲片中甘草苷、甘草酸平均質量分數分別為7.44、32.87 mg·g-1，RSD 分別為3.82%、3.87%，表明不同批次的甘草飲片質量差異較小。10 批標準煎液中4 種指標成分的平均質量分數分別為45.90、5.16、19.01、9.96 mg·g-1，RSD 分別為14.61%、16.16%、7.90%、30.00%，10 批口服液中4 種指標成分的平均質量分數分別為38.47、3.86、14.24、9.18 mg·g-1，RSD 分別為19.41%、14.41%、10.13%、34.55%。

表5 10批梔子飲片中梔子苷含量測定結果（， n=3）mg·g-1

表5 10批梔子飲片中梔子苷含量測定結果（， n=3）mg·g-1

根據《古代經典名方復方制劑物質基準申報資料要求（征求意見稿）》，不同批次標準煎液及口服液的指標性成分含量及轉移率應控制在其均值的70%～130%[10]，在進行指標性成分的含量及轉移率研究的過程中發現，部分批次標準煎液及成品口服液中槲皮苷的含量不在要求范圍內（70%～130%），表明不同批次合歡花飲片質量差異較大，這與10 批合歡花飲片含量測定結果相符，建議在后續進行標準煎液及成品口服液的制備時，采取不同批次飲片混批投料的方式，以減小成品制劑批次間差異，確保忘憂安神口服液質量的穩定。

表6 10批甘草飲片中甘草苷、甘草酸含量測定結果（，n=3）mg·g-1

表6 10批甘草飲片中甘草苷、甘草酸含量測定結果（，n=3）mg·g-1

表7 10批合歡花飲片中槲皮苷含量測定結果（， n=3）mg·g-1

表7 10批合歡花飲片中槲皮苷含量測定結果（， n=3）mg·g-1

表8 10批忘憂安神方標準煎液4種成分含量測定結果（， n=3）mg·g-1

表8 10批忘憂安神方標準煎液4種成分含量測定結果（， n=3）mg·g-1

表9 10批忘憂安神口服液4種成分含量測定結果（， n=3）mg·g-1

表9 10批忘憂安神口服液4種成分含量測定結果（， n=3）mg·g-1

3.2.3指標成分轉移率 口服液生產過程中，飲片-標準煎液-口服液指標成分轉移率結果見表10。結果顯示，各生產環節間梔子苷、甘草苷、甘草酸、槲皮苷的平均轉移率分別為飲片-標準煎液：77.35%、69.45%、57.95%、48.67%；標準煎液-口服液：83.60%、75.92%、75.08%、91.69%；飲片-口服液：64.30%、51.82%、43.48%、44.43%，其中，除了合歡花飲片-標準煎液槲皮苷的轉移率偏低外，其他各成分在各產環節間的轉移率均較高。有研究表明，槲皮苷在70%的甲醇或乙醇中具有較好的溶解性[11]。本研究為了盡可能保持傳統工藝的完整性，在融合現代制備工藝特點的基礎上，按照古代醫籍記載方法，以水為溶媒制備標準煎液，這是導致槲皮苷從飲片至標準煎液的轉移率偏低的主要原因，后期可考慮對提取工藝進一步優化，以提高槲皮苷轉移率。而不同批次標準煎液及成品口服液中的梔子苷、甘草苷、甘草酸、槲皮苷的轉移率均在要求范圍內（70%～130%），說明實驗前期標準煎液制備工藝及口服液的成型工藝可以實現梔子苷、甘草苷、甘草酸、槲皮苷含量的穩定傳遞。因此，暫定飲片-標準煎液4 種成分的轉移率分別為61.65%～90.75%、49.99%～85.33%、51.35%～67.22%、40.26%～56.76%，標準煎液-口服液轉移率分別為68.08%～93.58%、58.61%～95.81%、67.00%～89.75%、81.15%～111.20%。

表10 飲片-標準煎液-口服液4種成分轉移率%

3.3 出膏率及傳遞率

飲片-標準煎液-口服液出膏率及傳遞率結果見表11，10 批標準煎液、口服液的平均出膏率分別為31.56%、20.04%，RSD 分別為7.99%、7.94%；標準煎液-口服液出膏平均傳遞率為63.54%，RSD 為4.49%，均未出現離散數據（平均值的70%～130%以外）。說明忘憂安神方標準煎液及口服液制備過程的出膏率波動不大，出膏傳遞穩定，暫定標準煎液及口服液出膏率分別為28.79%～37.45%、18.30%～23.18%。

表11 飲片-標準煎液-口服液出膏率及傳遞率（， n=3）%

表11 飲片-標準煎液-口服液出膏率及傳遞率（， n=3）%

4 結論

忘憂安神口服液制劑處方由多種中藥組成，化學成分復雜，要同時建立其指標成分含量測定方法及指紋圖譜難度較大，為了最大程度反映其轉移率高低及其藥效物質群，本課題組前期研究反復考察了提取溶劑、檢測波長、流動相系統，分別建立了其指標成分含量測定方法與指紋圖譜研究方法，采用“出膏率+指標成分轉移率+指紋圖譜”與制備過程中技術經濟指標相結合的模式，實現了指標成分及其他未知成分的全面控制。本研究對口服液生產的原料飲片-中間體-成品口服液的一系列生產環節進行量值傳遞規律分析及標準煎液和成品口服液的質量一致性評價，實時、全面地監控口服液生產過程中各成分的變化特征，明確了關鍵生產環節，保證了成品制劑的質量均一性及可溯源性，實現了口服液生產工藝的全過程質量控制，整體說明了忘憂安神口服液制備工藝具備較好的科學性與合理性，為口服液生產工藝過程的實施、成品口服液的質量控制及質量標準的研究提供了參考。后期研究可進一步對提取、醇沉、濃縮等影響活性成分轉移率的工藝參數進行優化調整，減少活性成分的損失，提高忘憂安神口服液有效成分含量與穩定性。