臭氧熏蒸對玉米胚中真菌毒素的降解消除作用

劉玉蘭，鄭婷婷，馬宇翔，王戩東，王月華

（1.河南工業大學糧油食品學院，河南 鄭州 450001；2.河北玉星食品有限公司，河北 邢臺 055550；3.山東三星玉米產業科技有限公司，山東 濱州 256209）

玉米胚是玉米深加工的副產物，含有豐富的油脂、蛋白、膳食纖維及其他營養成分，是生產食用玉米油和飼用玉米粕的原料[1-2]，但玉米胚較玉米更易感染黃曲霉毒素B1（aflatoxins B1，AFB1）、玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）和嘔吐毒素（deoxynivalenol，DON）等真菌毒素[3-5]，對玉米胚及其制品的食用安全和飼用安全造成威脅[6-7]。近年來，玉米胚和食用玉米油的產量逐年提高，食用玉米油產量超過120萬 t[8]。為確保并提升食用玉米油的品質安全，研究人員已對玉米油精煉過程真菌毒素脫除技術進行了研究并取得了一定的成果[9-11]。但目前對玉米胚和玉米粕中真菌毒素控制和脫除技術的研究報道很少，因為對固體物料中真菌毒素的脫除要遠比玉米油更加困難。若能對玉米胚中真菌毒素進行消除脫毒，就可以同時兼顧玉米油和玉米粕安全品質的提升，從源頭上對真菌毒素進行有效控制，并避免玉米油精煉過程為脫除真菌毒素而采取過度精煉所造成的油脂精煉損耗和營養成分損失。本課題組前期對擠壓膨化、微波處理、濕熱蒸胚、淡堿蒸胚、臭氧水調質、臭氧熏蒸等方法消除玉米胚中真菌毒素效果進行了比較[12]，得出淡堿蒸胚法[13]和臭氧熏蒸法更具優勢。臭氧是氧氣在高壓放電下產生的同素異形體，具有極強氧化性和殺菌性能[14]。1997年美國食品藥品監督管理局就認證了臭氧應用于食品加工中的通用安全性[15]。臭氧熏蒸應用于糧食和油料中真菌毒素的降解也有不少報道[16-18]。但臭氧熏蒸對玉米胚中真菌毒素消除的研究卻鮮有報道。本實驗依據臭氧的強氧化性可破壞多種真菌毒素分子結構的機理[19]，在前期研究的基礎上，對臭氧熏蒸脫除玉米胚中真菌毒素的條件優化和脫毒效果進行較為深入的研究，以期能為玉米胚中真菌毒素脫除技術的發展提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米胚樣品取自河北玉星食品有限公司和山東三星玉米產業科技有限公司。

DON標準品（純度≥99%）、AFB標準品（純度≥99%）、ZEN標準品（純度≥99%） 美國Sigma-Aldrich公司；DON免疫親和柱、ZEN免疫親和柱、AFB1免疫親和柱 月旭科技（上海）股份有限公司；甲醇、乙腈（均為色譜純） 美國VBS公司；超純水由實驗室通過Molecular超純水機制得。

1.2 儀器與設備

2695高效液相色譜儀、2475熒光檢測器、2489紫外檢測器 美國Waters科技有限公司；COM-AD-01臭氧發生儀 鞍山安思羅斯環保有限公司；JSA9紫外臭氧檢測儀 深圳市吉順安科技有限公司；MTN-2800W氮吹濃縮儀 天津艾特賽恩斯儀器公司；FM200均質機上海弗魯克流體機械制造有限公司；FW400A高速萬能粉碎機 北京中興偉業儀器有限公司；LD5-10臺式低速離心機 北京京立離心機有限公司；RE-200A旋轉蒸發器鄭州亞榮儀器有限公司；Vortex QL-902渦旋儀 海門市其林貝爾儀器制造公司；WSL-2比較測色儀 上海精密科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 臭氧對玉米胚熏蒸處理

打開紫外臭氧檢測儀并預熱30 min，打開臭氧發生儀，待發生儀穩定后打開氧氣罐閥門，通入高純氧氣。調節氧氣罐閥門、電壓控制器、臭氧流量計等，控制生成臭氧的質量濃度穩定至150 mg/L左右（根據前期實驗，隨臭氧質量濃度升高真菌毒素降解效果呈升高趨勢，降解所需時間也會縮短，對原料品質影響也更小，因此將實驗室臭氧發生器調試至能穩定工作的最高生成質量濃度）。將30 g玉米胚樣品（水分質量分數為3.98%）放入250 mL玻璃瓶，以蒸餾水調節玉米胚水分質量分數分別至5%、10%、15%、20%、25%、30%左右（通過105 ℃恒質量法確定調節后的樣品水分質量分數）。將臭氧氣體從瓶底管道通入玻璃瓶并穿過料層對玉米胚進行熏蒸處理，之后多余的臭氧從瓶頂管道放出，熏蒸處理時間分別控制為20、30、40、50、60、80 min。將處理后的樣品在60 ℃烘箱中通風干燥1 h，取出后檢測樣品中AFB1、ZEN、DON含量，并計算3 種真菌毒素的消除率。

1.3.2 玉米胚中真菌毒素含量測定

AFB1含量測定參照GB 5009.22—2016《食品安全國家標準 食品中黃曲霉毒素B族和G族的測定》。樣品前處理方法參照GB 5009.22—2016中高效液相色譜-柱后衍生法。

色譜條件：色譜柱：C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-水（45∶55，V/V）；流速：0.8 mL/min；柱溫：35 ℃；進樣量：20 μL；激發波長：360 nm；發射波長：440 nm。使用光化學衍生器進行衍生化。

ZEN含量測定參照GB 5009.209—2016《食品安全國家標準 食品中玉米赤霉烯酮的測定》。樣品前處理方法參照GB 5009.209—2016中的液相色譜法。

色譜條件：色譜柱：C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-水（55∶45，V/V）；流速：1 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：20 μL；檢測波長：278 nm。

DON含量測定參照GB 5009.111—2016《食品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇及其乙酰化衍生物的測定》。樣品前處理方法參照GB 5009.111—2016中的免疫親和層析凈化高效液相色譜法。

色譜條件：色譜柱：C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-水（16∶84，V/V）；流速：0.8 mL/min；柱溫：40 ℃；進樣量：50 μL；檢測波長：218 nm。

1.3.3 真菌毒素消除率計算

玉米胚中真菌毒素的消除率按下式計算。

式中：B為臭氧熏蒸對玉米胚中真菌毒素的消除率/%；X為臭氧熏蒸處理后物料中真菌毒素含量/（μg/kg）；Z為未經臭氧熏蒸前物料中真菌毒素含量/（μg/kg）。

1.3.4 玉米胚中毛油的提取

將玉米胚用高速萬能粉碎機粉碎，加入正己烷，于40 ℃水浴加熱并攪拌，萃取油脂8 h，之后通過抽濾進行固液分離，取液體（油脂與正己烷溶劑組成的混合油）于45 ℃下旋蒸脫除其中的正己烷溶劑，再在90 ℃下脫除其中殘留溶劑，即得到玉米胚毛油。

1.3.5 玉米胚及玉米油指標測定

玉米胚水分質量分數測定參照GB 5009.3—2016《食品安全國家標準 食品中水分的測定》（105 ℃恒質量法）；玉米胚毛油酸價測定參照GB 5009.229—2016《食品安全國家標準 食品中酸價的測定》；玉米胚毛油過氧化值測定參照GB 5009.227—2016《食品安全國家標準 食品中過氧化值的測定》；色澤測定參照GB/T 22460—2008《動植物油脂 羅維朋色澤的測定》。

1.4 數據處理與分析

每個指標重復測定3 次，測定的數據通過Origin 9.0軟件處理及作圖，并用SPSS軟件中的單因素方差分析進行數據統計分析，利用Duncan多重比較分析樣品間差異顯著性，以P＜0.05表示有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 臭氧熏蒸條件對玉米胚中AFB1消除效果的影響

將玉米胚水分質量分數分別調節至5%、10%、15%、20%、25%、30%，調節臭氧發生器至臭氧質量濃度檢測器示數穩定至150 mg/L，將臭氧通入反應裝置與玉米胚反應1 h，玉米胚水分質量分數對AFB1消除效果的影響見圖1。

圖1 玉米胚水分質量分數對臭氧熏蒸消除玉米胚中AFB1效果的影響Fig.1 Effect of sample moisture content on the removal of AFB1 in corn germ by ozone fumigation

由圖1可見，玉米胚水分質量分數對AFB1的消除效果影響顯著，隨樣品水分質量分數的增加，玉米胚中AFB1含量減少，AFB1消除率提高。水分質量分數15%時，AFB1的消除率為66.61%，水分質量分數為25%時，AFB1的消除率達到最高（73.10%），此時AFB1含量由初始的77.29 μg/kg降低至20.69 μg/kg。當樣品水分質量分數高于25%時，消除率不再增加，這可能是因為臭氧在水中極易形成·OH和·OOH等具有很強氧化性的含氧自由基，適當增加玉米胚水分質量分數可提高含氧自由基數量，有利于AFB1的降解[20-21]；但當水分質量分數過高時，發現玉米胚在處理過程中易結團粘壁，影響玉米胚與臭氧的均勻接觸反應，從而不利于AFB1的降解，這與文獻[22]結果相似。因此可選擇玉米胚水分質量分數25%作為優化條件。

將玉米胚水分質量分數調節至25%，調節臭氧質量濃度穩定至150 mg/L，將臭氧通入反應裝置與玉米胚分別反應20、30、40、50、60、80 min，反應時間對AFB1消除效果的影響見圖2。

圖2 臭氧熏蒸時間對玉米胚中AFB1消除效果的影響Fig.2 Effect of ozone fumigation time on the removal of AFB1 in corn germ

由圖2可見，玉米胚中AFB1消除率隨熏蒸時間的延長而提高。60 min時的消除率為69.29%，AFB1含量降至23.64 μg/kg，時間延長至80 min時消除率達到最高（72.27%），AFB1含量降至21.36 μg/kg，但與60 min時的AFB1含量差異并不顯著（P＞0.05），表明60 min時臭氧熏蒸對AFB1的氧化降解反應基本達到了平衡。

2.2 臭氧熏蒸條件對玉米胚中ZEN消除效果的影響

維持臭氧熏蒸條件同2.1節，玉米胚水分質量分數對ZEN消除效果的影響見圖3。玉米胚水分質量分數對ZEN消除效果有顯著影響，水分質量分數為10%時，ZEN消除率為70.07%，此時玉米胚ZEN含量由初始的354.44 μg/kg減少至106.09 μg/kg，水分質量分數超過10%之后，隨水分質量分數升高，ZEN含量變化不顯著（P＞0.05），在水分質量分數15%時ZEN的消除率最低，為69.44%。綜合考慮可選擇玉米胚水分質量分數10%作為消除ZEN的優化條件。

圖3 玉米胚水分質量分數對臭氧熏蒸消除玉米胚中ZEN效果的影響Fig.3 Effect of sample moisture content on the removal of ZEN in corn germ by ozone fumigation

將玉米胚水分質量分數調節至10%，臭氧質量濃度調節至150 mg/L，分別對玉米胚進行20、30、40、50、60、80 min臭氧熏蒸處理，臭氧熏蒸時間對ZEN消除效果的影響見圖4。

圖4 臭氧熏蒸時間對玉米胚中ZEN消除效果的影響Fig.4 Effect of ozone fumigation time on the removal of ZEN in corn germ

從圖4可以看出，在20～50 min內玉米胚中ZEN含量隨熏蒸時間延長而顯著降低（P＜0.05），在50 min時消除率可達68.88%，此時ZEN含量由初始的354.44 μg/kg減少至110.31 μg/kg，此后再延長熏蒸時間消除率不再明顯變化。王軼凡[23]通過超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質譜對ZEN及其臭氧降解產物進行的檢測分析結果證明，臭氧降解ZEN的過程主要遵循臭氧與烯烴雙鍵加成的Criegee反應機制，同時細胞毒性實驗結果表明降解產物毒性降低且無突變性。

2.3 臭氧熏蒸條件對玉米胚中DON消除效果的影響

維持臭氧熏蒸條件同2.1節，玉米胚水分質量分數對DON消除效果的影響見圖5。玉米胚水分質量分數對臭氧熏蒸消除玉米胚中DON含量有顯著影響。低水分質量分數（5%）時玉米胚中DON消除率較低，當水分質量分數提高至10%時消除率明顯提高，達到78.07%；水分質量分數提高至15%時，DON消除率達到90.96%，消除效果最好，此時DON含量由初始的6.68 mg/kg降低至0.60 mg/kg，顯著低于GB 2761—2017《食品安全國家標準 食品中真菌毒素限量》規定限量。隨水分質量分數繼續增加，DON消除率呈總體降低趨勢，這可能是因為過高的水分含量使玉米胚結團，影響了臭氧與樣品的充分接觸。

圖5 玉米胚水分質量分數對臭氧熏蒸消除玉米胚中DON效果的影響Fig.5 Effect of sample moisture content on the removal of DON in corn germ by ozone fumigation

將玉米胚水分質量分數調節至15%，調節臭氧質量濃度為150 mg/L，臭氧熏蒸時間分別為20、30、40、50、60、80 min，臭氧熏蒸時間對DON消除效果的影響見圖6。

圖6 臭氧熏蒸時間對玉米胚中DON消除效果的影響Fig.6 Effect of ozone fumigation time on the removal of DON in corn germ

從圖6可以看出，在60 min內，臭氧熏蒸玉米胚中DON的含量隨時間延長而顯著降低（P＜0.05），60 min時的消除率為82.86%，此時DON含量由初始的6.68 mg/kg降低至1.15 mg/kg，超過60 min后DON含量降低不顯著（P＞0.05）。Ren Dongliang等[24]利用液相色譜-四極桿-飛行時間質譜進行檢測分析，確定了DON的4 種臭氧分解產物，推測出臭氧破壞了DON的C9—C10處的雙鍵、12,13-環氧環以及C3或C7處的羥基，作用方式符合Criegee機制。王莉等[25]基于DON結構和毒性之間的關系，推斷出臭氧分解產物的毒性顯著降低。邵慧麗[26]用臭氧處理后的DON污染小麥飼喂小鼠，發現臭氧熏蒸可顯著降低小麥中DON的毒性。

2.4 臭氧熏蒸條件對玉米胚毛油品質的影響

鑒于玉米胚臭氧熏蒸過程可能會對其中油脂品質造成不良影響，因此對經不同水分質量分數、不同時間熏蒸處理后的玉米胚提取油脂，并對玉米胚毛油的酸價、過氧化值、色澤進行測定，結果如圖7和表1所示。圖7A為玉米胚水分質量分數對臭氧熏蒸（1 h）玉米胚毛油酸價和過氧化值的影響，圖7B為臭氧熏蒸時間對玉米胚（水分質量分數20%）毛油酸價和過氧化值的影響。

表1 臭氧熏蒸處理對玉米胚毛油色澤的影響Table 1 Effect of ozone fumigation on the color of crude corn oil

圖7 臭氧熏蒸對玉米胚毛油酸價和過氧化值的影響Fig.7 Effect of ozone fumigation on the acid value and peroxide value of crude corn oil

由圖7A可看出，隨玉米胚水分質量分數的增加，臭氧熏蒸玉米胚中油脂的酸價顯著升高（P＜0.05），在水分質量分數為30%時達到最高，由初始的6.57 mg/g升高至8.33 mg/g；過氧化值在水分質量分數高于15%后顯著增加（P＜0.05），水分質量分數為30%時，過氧化值由初始的6.40 mmol/kg升高至7.32 mmol/kg。刁恩杰[27]發現用濕潤的臭氧熏蒸后花生的酸價顯著高于直接臭氧熏蒸，因為臭氧與水首先發生反應產生的·OH比臭氧氣體具有更強的氧化能力。因此，玉米胚水分含量的增加可能促進了·OH的生成，從而增加了臭氧的氧化性。

隨著臭氧熏蒸時間的延長，玉米胚中油脂的酸價和過氧化值持續升高，但總體升幅不大。在80 min時酸價由初始的6.57 mg/g升高至8.06 mg/g；過氧化值在熏蒸時后不超過40 min時無顯著變化（P＞0.05），超過40 min后顯著增加（P＜0.05），至80 min時過氧化值由初始的6.40 mmol/kg升高至7.32 mmol/kg。

綜合考慮臭氧熏蒸對3 種真菌毒素都能有較高的消除率，將玉米胚臭氧熏蒸的優化條件確定為水分質量分數15%、熏蒸時間60 min，經此條件處理后，玉米胚中油脂的酸價升至7.88 mg/g，過氧化值升至6.94 mmol/kg，均未超出GB/T 2716—2018《食品安全國家標準 植物油》中對玉米毛油的品質要求（酸價不超過10 mg/g；過氧化值不超過0.25 g/100 g（9.85 mmol/kg））。因此，臭氧熏蒸處理對玉米毛油品質的影響在可接受范圍內。

從表1可以看出，當玉米胚水分質量分數低于20%時，隨樣品水分質量分數的增加，其對應毛油的紅值呈降低趨勢。臭氧氣體具有漂白和脫色的能力，能降解食品中的類胡蘿卜素和花色苷[28]。玉米中含有豐富的葉黃素和玉米黃素（類胡蘿卜素類的天然色素），可能在臭氧處理的過程中被降解，使玉米胚色澤變淺。當玉米胚水分質量分數高于20%時，隨水分質量分數增加，紅值呈上升趨勢。鄧捷等[29]觀察到臭氧處理后的玉米油顏色由淡黃色轉變為紅褐色。臭氧熏蒸處理玉米胚的過程中，也有可能生成有色的玉米油臭氧氧化產物，從而使毛油的色澤加深。在玉米胚水分質量分數為15%條件下，隨臭氧熏蒸時間的延長，玉米胚毛油的紅值呈持續降低趨勢，熏蒸時間80 min時毛油的紅值由處理前的7.9下降至6.0，這與山長坡[30]研究的濕潤臭氧處理后花生色澤變化趨勢一致。

3 結 論

采用不同的玉米胚水分質量分數及不同熏蒸時間對玉米胚中3 種真菌毒素進行臭氧熏蒸消除，對比分析不同熏蒸條件對玉米胚中真菌毒素消除效果的影響，結果發現，適當提高玉米胚水分質量分數可顯著提高臭氧對3 種真菌毒素的消除效果，但當水分質量分數高于20%時，再隨水分質量分數增加消除率增長不明顯。3 種真菌毒素的消除率與處理時間呈正相關，熏蒸時間達60 min時，3 種真菌毒素均可獲得較好的消除效果，繼續延長處理時間，反應趨于平衡。基于盡量降低玉米胚水分含量和縮短臭氧處理時間以降低營養成分損失考慮，綜合3 種真菌毒素的消除效果，臭氧熏蒸消除3 種真菌毒素的優化工藝條件為臭氧質量濃度150 mg/L、樣品水分質量分數15%、臭氧熏蒸時間60 min，此時對3 種真菌毒素（AFB1、ZEN、DON）均有較好的降解消除效果，消除率可分別達66.61%、69.44%、90.96%。隨玉米胚水分質量分數升高和臭氧熏蒸時間延長，玉米胚毛油的色澤呈降低趨勢，酸價和過氧化值呈升高趨勢，但均未超出GB/T 2716—2018中對玉米毛油的品質限量要求。