SD大鼠生殖發育毒性試驗背景數據的建立

沈 姣，陸冰冰，盧 凡，高慶發，喬紅群，岳 鵬，劉 晶

（1.江蘇省藥物安全性評價中心，江蘇省藥物研究所有限公司，江蘇 南京 210009；2.南京工業大學藥學院，江蘇 南京 211816）

在藥物研發過程中，生殖與發育毒性評估是藥物非臨床安全性評價的重要內容，與急性毒性、長期毒性和遺傳毒性等毒理學研究有密切聯系，是藥物進入臨床研究及上市的重要環節。生殖毒性研究的目的是通過動物試驗反映受試物對哺乳動物生殖功能和發育過程的影響，預測其可能產生的對生殖細胞、受孕、妊娠、分娩、哺乳等親代生殖功能的不良影響，以及對子代胚胎-胎兒發育和出生后發育的不良影響[1]。生殖毒性研究在限定臨床研究受試者范圍、降低臨床研究受試者和藥品上市后使用人群的用藥風險方面發揮重要作用。生殖毒性研究主要包括3個試驗階段：生育力和早期胚胎發育試驗（Ⅰ段）、胚胎-胎仔發育試驗（Ⅱ段）和圍產期發育試驗（Ⅲ段）。

根據國際人用藥物生殖與發育毒性檢測（International Council for Harmonization，ICH）（S5）[2]和國家食品藥品監督管理總局（China Food and Drug Administration，CFDA）[3]的指導原則，因為其使用范圍廣且背景數據充分，生殖毒性試驗嚙齒類動物通常選用大鼠。本文歸納了2018-2020年江蘇省藥物安全性評價中心生殖毒性（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ段）研究項目并對其中溶媒對照（飲用水）組SD大鼠相關數據進行收集和統計分析，建立了生殖毒性指標的背景數據庫，為藥物生殖毒性安全評價的開展和結果分析提供數據參考。

1 材料與方法

1.1 動物、藥物和儀器

所有試驗使用8～9周齡SPF級SD大鼠，均購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物生產許可證號：SCXK（京）2016-0006，飼養于江蘇省藥物安全性評價中心SPF級動物房，動物使用許可證號：SYXK（蘇）2016-0032，室溫控制在20～26℃，相對濕度控制在40%～70%，維持12 h/12 h光/暗循環（工作照明＞200 Lux，動物照明15～20 Lux），換氣次數≥15次·h-1，噪聲≤60 dB，自由飲水，飼喂SPF維持鼠糧（江蘇省協同醫藥生物工程有限公司）。所有研究均用于GLP條件下的生殖毒性安全性評價試驗，均經江蘇省藥物安全性評價中心動物管理與使用委員會審核批準。溶媒對照組均使用實驗動物飲用水，均為本中心自制，通過南京市質檢所檢查合格；大鼠胚胎-胎仔發育毒性試驗中陽性對照均使用注射用環磷酰胺（江蘇恒瑞醫藥有限公司，規格為200 mg·瓶-1），用氯化鈉注射液配制成0.35 g·L-1溶液。生物顯微鏡（XSD-24N，南京江南永新光學公司）；CO2安樂死系統〔凌云博際（北京）科技有限公司〕；電子天平（AR1530，上海精密科學儀器有限公司）；電子計重秤（BT418W，深圳博途電子科技有限公司）；連續變倍體視顯微鏡（XTB-1，南京江南永新光學公司）；動物精子活力分析儀（SCA，ESP，西班牙MICROPTIC S.L.公司）；電子天平和電子計重秤每年均通過南京市計量監督檢測院計量的檢定。

1.2 試驗方法

Ⅰ段、Ⅱ段和Ⅲ段試驗用大鼠在檢疫期結束后均為9-10周齡，已達到體成熟和性成熟。溶媒對照組均采用灌胃給予實驗動物飲用水，為10 mL·kg-1；Ⅱ段試驗中陽性對照組大鼠均灌胃給予環磷酰胺3.5 mg·kg-1，為10 mL·kg-1。依據《藥物生殖毒性研究技術指導原則》要求，每組參與統計的動物數需≥20只，實際各試驗在剖檢后均滿足該要求。

Ⅰ段試驗中，動物在檢疫期結束后依據動物體重隨機分為溶媒對照組和受試物組，每組雌雄大鼠各24只；雄鼠給藥4周，雌鼠給藥2周后按照雌雄比1∶1合籠交配，交配期不超過3個雌鼠發情周期（一個交配周期為5天，包括動情前期、動情期、動情后期和動情間期）。合籠次日后對雌鼠進行陰道涂片檢查，查見精子或陰栓確定為妊娠第0日（gestation day 0，GD0）。雌雄大鼠在交配期間持續給藥，雄鼠交配成功當日處死剖檢，未交配成功雄鼠于交配期結束后剖檢；受孕大鼠持續給藥至GD6，GD14解剖。

Ⅱ段試驗適應完成后雌雄大鼠按照2∶1進行合籠交配，次日查籠，查見精子或陰栓當日定為孕鼠GD0，孕鼠按照隨機分組方法分配至溶媒對照組、受試物組和陽性對照組，每組24只孕鼠。孕鼠于GD6-15給藥，GD20解剖。

Ⅲ段試驗中，親代（founder 0，F0）雌雄大鼠在檢疫期結束后交配、查籠、動物數和體重分組（方法與Ⅱ段試驗相同），分為溶媒對照組和受試物組。親代母鼠定義為F0代，分娩當日記為分娩第0日（postnatal day 0，PND0），于 GD15-PND21給藥，PND21解剖，觀察F0代母鼠臟器指標。分娩后的子代定義為F1（filial generation 1，F1）代。F0代分娩后于PND4每窩篩選出5雄5雌，共計5對F1代仔鼠，其中1對用于行為學試驗；3對用于PND35天解剖，觀察仔鼠臟器指標；另外1對用仔鼠出生后10周（Week，W）后的同組不同窩交配，觀察子代的生育和交配能力（方法與Ⅰ段試驗相同）

1.3 分析指標

1.3.1 體重和體增重檢測

Ⅰ段大鼠交配前每周進行2次稱重，孕鼠于GD0，GD3，GD6，GD10和 GD14稱重。Ⅱ段孕鼠于GD0，GD3，GD6，GD10，GD13，GD16和 GD20稱重。Ⅲ段孕鼠于 GD0，GD3，GD6，GD10，GD14，GD17和 GD20稱 重 ，Ⅲ 段 哺 乳 期 母 鼠 于 PND0，PND4，PND7，PND14和PND21稱重。F1代雄雌仔鼠于PND4，PND7，PND14，PND21和 PND35稱重。F1代交配雄鼠、雌鼠W6，W7，W8，W9和W10稱量體重。F1代孕鼠于 GD3，GD6，GD10和 GD14稱重。鄰近 2次體重差值為此段時間大鼠的體增重。

1.3.2 臟器指標

Ⅰ段雄鼠記錄睪丸、附睪、前列腺和精囊腺的重量。Ⅰ段雌鼠和Ⅲ段F1代用于交配的雌鼠在交配完成后GD14處死，稱子宮重，檢查胎盤，計數黃體數、活胎數、死胎數、吸收胎數和著床數。

Ⅱ段大鼠于GD20剖檢，取出胎仔，計算黃記錄、胎重（連子宮）、胎仔重、胎盤總重、胎盤外觀、活胎數、死胎數、吸收胎數、性別比和身長，檢查外觀、內臟和骨骼檢查，并計算著床數。

記錄F1代交配雄鼠睪丸和附睪重。記錄F0代和F1代雄雌仔鼠心、肝、脾、肺、左腎、右腎、睪丸、附睪、卵巢和子宮重。

1.3.3 F1代生長發育指標檢測

檢測幼仔的窩產仔數、出生體重和存活率。對幼仔進行標記，并每天觀察毒性的臨床跡象，直至斷奶。

F1代PND篩選后的5對仔鼠，3對用于PND35后解剖，檢測內臟的重量及畸形。1對同組不同窩之間交配成功后，F1代雄鼠于交配成功后解剖。F1代雌鼠于交配成功GD14解剖。

1對用于觀察仔鼠的生理發育狀況和行為學測試，主要包括耳廓分離、門齒萌出、睜眼、張耳、出毛、睪丸下降和陰道張開。檢測仔鼠神經反射指標，主要包括平面翻正反射、空中翻正反射、負趨地性反射、視覺定位反射和斷崖回避反射。

1.4 統計學分析

根據試驗方案和江蘇省藥物安全性評價中心的標準操作規程，手動收集或用數據采集系統收集原始數據。實驗結果數據采用SPSS23.0軟件包統計處理。大鼠Ⅱ段試驗溶媒對照組與陽性對照組結果對比時，使用t檢驗方法進行統計分析。除Ⅲ段試驗中仔鼠生長發育指標使用中位數進行統計，其余數據均進行±s、95%置信區間（confidence interval，CI）、最大值、最小值和變異系數（coefficient of variation，CV）的統計描述。

2 結果

2.1 生育力和早期胚胎發育試驗（Ⅰ段）

2.1.1 孕鼠體增重變化

在大鼠生育力和早期胚胎發育試驗中，體增重結果見表1。孕鼠妊娠期體增重均＞15 g·d-1，未見異常。

Tab.1 Body mass gain of pregnant rats in segmentⅠduring 2018-2020

2.1.2 SD雌鼠生殖發育指標

雌鼠在交配完成后于GD14處死，各檢測指標結果見表2。黃體數為（16.8±1.6）個，變異系數較低為9.3%，表明黃體數變化較小，整體數據趨于穩定；吸收胎數為（0.93±1.3）個，變異系數偏高為139.7%，主要原因是由于多數動物吸收胎數為0，個別動物的吸收胎數較大，導致數據的SD值較高，對生殖發育毒性試驗的毒性參考意義較小，其余數據趨于穩定。

Tab.2 Reproductive indexes of pregnant rats in segmentⅠduring 2018-2020

2.1.3 SD雄性大鼠生殖器官重量

在確認雌鼠妊娠后于GD0處死雄鼠，稱取睪丸、附睪、前列腺和精囊腺重量，各檢查指標結果見表3。睪丸和附睪平均重量分別為3.4±0.3和（1.1±0.1）g，變異系數均較低，分別為9.5%和9.4%。

Tab.3 Organ mass of male rats in segmentⅠduring 2018-2020

2.2 胚胎-胎仔發育試驗（Ⅱ段）

2.2.1 SD孕鼠體增重變化

胚胎-胎仔發育階段溶媒對照組和環磷酰胺組孕鼠妊娠期體增重孕前期未見異常，GD16-20期間是胎仔生長發育的關鍵階段，環磷酰胺GD16-20孕鼠體增重為（39.2±1.6）g·d-1，溶媒對照組為（55.1±13.7）g·d-1，環磷酰胺組孕鼠體增重顯著低于溶媒對照組（P＜0.05）（表4）。

Tab.4 Body mass gain of pregnant rats in vehicle control group and positive control group in segmentⅡduring 2018-2020

2.2.2 SD孕鼠和胎仔生殖發育指標

在GD20處死孕鼠，各檢查指標結果見表5。其中，環磷酰胺吸收胎數平均為（1.4±0.2）個，相較于溶媒對照組的（0.5±1.3）個顯著升高（P＜0.05）；子宮總重、胎盤總重、胎仔重和身長陽性對照組分別為（55.4±1.6）g，（5.0±0.2）g，（2.6±0.1）g和（3.1±0.0）cm，均顯著低于溶媒對照組的（80.4±17.2）g、（9.0±1.9）g、（3.8±0.4）g和（3.7±0.2）cm（P＜0.05）。其余指標無明顯差異。溶媒組胎仔體重和身長變異系數分別為11.52%和4.95%，表明胎仔發育較穩定。

Tab.5 Reproductive indexes of pregnant rats in vehicle control group and positive control（cyclophosphamide）group in segmentⅡduring 2018-2020

2.3 圍產生期發育試驗（Ⅲ段）

2.3.1 F0代母鼠和F1代仔鼠體重變化

F0代母鼠孕期體增重（表6）未見異常。F0代哺乳期母鼠，由于哺乳，體重降低幅度較大；F1代仔鼠出生后前期PND0-14體重增長較緩慢；PND14后可正常進食，體重和體增重增長較快（表7）。F1代交配雌鼠、雄鼠W6體重和體增重均隨著時間變化而穩定增長，并無性別差異。F1代孕鼠在妊娠期GD0-14體重和體增重穩定增加（表8和表9）。

Tab.6 Body mass gain of founder（F0）pregnant rats in segmentⅢduring 2019-2020

Tab.7 Body mass gain of filial generation 1（F1）offspring rats in segmentⅢduring 2019-2020

Tab.8 Body mass of F1mating rats and F1pregnant rats in segmentⅢduring 2019-2020

Tab.9 Body mass of F1pregnant rats in segmentⅢduring 2019-2020

2.3.2 F0代母鼠和F1代仔鼠臟器重量變化

哺乳期結束后處死F0母鼠，各項指標見表10，肺平均重量為（1.7±0.6）g，變異系數為35.1%。F1代仔鼠PND35解剖各項指標見表11，雌鼠子宮平均重量為（0.3±0.1）g，變異系數為33.2%，其余各指標結果均較穩定。

Tab.10 Organ mass of F0female rats in segmentⅢduring 2019-2020

Tab.11 Organ indexes of F1rats in segmentⅢduring 2019-2020

2.3.3 F1代雄鼠和孕鼠生殖指標

在確認雌鼠妊娠后于GD0處死雄鼠，睪丸和附睪的檢測結果見表12，睪丸和附睪平均重量分別為3.6±0.3和（1.2±0.1）g，變異系數分別為 8.1% 和10.2%。F1代孕鼠在交配完成后GD14處死，均無死胎，其他各項指標見表13。吸收胎數平均為（1.2±1.5）個，由于個體差異較大，導致變異系數偏高，為122.3%。

Tab.12 Organ mass of F1mating male rats in segmentⅢduring 2019-2020

Tab.13 Reproductive index of F1pregnant rats in segmentⅢduring 2019-2020

2.3.4 F1代仔鼠生長發育指標

仔鼠耳廓分離時間中位數2019年為PND3，2020年為PND2；負趨地性反射時間中位數2019年為PND6，2020年為PND5；斷崖回避反射時間中位數2019年為PND7，2020年為PND6；觸須定位時間中位數2019年為PND12，2020年為PND13；陰道張開中位數時間2019年為PND32，2020年為PND33；其余各項指標這兩年的數據均相同，具體各指標檢查結果見表14。

Tab.14 Physiological development and reflection development of F1offspring rats in segmentⅢduring 2019-2020

3 討論

在生殖毒性試驗中，給藥動物體重和體增重的變化是評價受試物對動物是否產生毒性的非常重要指標。本GLP實驗室研究發現，Ⅰ段、Ⅱ段和Ⅲ段SD孕鼠妊娠期體重變化均為逐漸增加趨勢，這與國內外相關報道一致[4-5]。在Ⅲ段試驗中，SD母鼠因為哺乳期哺乳，體增重下降幅度較大，同時期的仔鼠體重隨著時間增加而增加，反映了大鼠實際的生理情況。

黃體數、著床數、活胎數、吸收胎數和死胎數等指標是衡量胚胎早期和晚期發育毒性的重要指標。本GLP實驗室生殖Ⅰ段中的平均黃體數（16.8±1.6）個，平均著床數（16.4±1.9）個，平均活胎數（15.3±2.3）個。王蓉等[6]研究報道，平均黃體數（14.5±1.3）個，平均著床數（13.4±1.3）個，平均活胎數（13.0±1.4）個，與本研究結果相近。生殖Ⅱ段中的平均黃體數（15.4±1.9）個，平均著床數（14.5±2.8）個，平均活胎數（14.0±3.1）個，平均吸收胎數（0.53±1.31）個。賈玉林等[7]、孔衛青等[8]、葉向峰等[9]和Noritake等[10]研究報道，平均黃體數分別為（12.8±2.1），（15.6±2.8），（15.5±2.5）和16.0個，平均著床數分別為（11.8±2.8），（13.6±3.7）和（14.2±3.2）和 14.7個，平均活胎數分別為（11.5±2.8），（12.8±3.7），（13.4±3.5）和14.1個，與本研究結果亦相近。生殖Ⅲ段中的平均黃體數（16.6±2.4）個，平均著床數（15.8±2.4）個，平均活胎數（14.6±2.5）個，平均吸收胎數為（1.2±1.5）個，現有文獻少見有關于Ⅲ段以上相關指標的報道。與本中心Ⅰ段和Ⅱ段試驗指標相比，Ⅲ段以上指標無統計學顯著性差異。同時，與溶媒組相比，Ⅱ段試驗中陽性對照組母體生育、胎仔發育各項指標呈現出顯著差異，表明了本中心相關技術體系的可靠性。

Ⅱ段試驗中，胎仔重、胎盤重、身長和性別比是評價藥物對胎仔的生長發育是否產生毒性的指標[7]。本GLP實驗室中平均胎盤總重（9.0±1.9）g，平均胎仔重（3.8±0.4）g，性別比為1.0。賈玉林等[7]、孔衛青等[8]、葉向峰等[9]和Noritake等[10]研究報道，平均胎盤總重（7.8±2.0）g，平均胎仔重分別（3.8±0.4）、（3.9±0.3），3.7和（4.0±0.8）g，性別比分別為1.0，0.9，1.0和0.9，與本研究結果相近。

器官重量是最敏感的藥物毒性指標之一，其變化往往先于形態變化。Piao等[11]和崇立明等[12]研究表明，雄性大鼠的心、肝、脾、肺和腎等器官的絕對重量均高于雌性大鼠。本實驗室Ⅲ段毒性試驗中F1代仔鼠雄性的臟器重量均高于雌性，與上述報道一致。在生殖Ⅰ段中睪丸平均重量（3.3±0.3）g，附睪平均重量（1.1±0.1）g；生殖Ⅲ段中睪丸平均重量（3.5±0.3）g，附睪平均重量（1.2±0.1）g，并無顯著差別。

仔鼠門齒萌出、皮毛發育、平面翻正、張耳、睜眼、空中翻正、視覺定位、睪丸下降的時間與肖百全等[13]研究報道無顯著差別。

通過對本中心2018-2020年各階段生殖毒性試驗結果的研究匯總，各溶媒對照組SD大鼠試驗數據分布均一，基本穩定，初步建立了本中心SD大鼠Ⅰ～Ⅲ段生育和發育指標的背景數據。隨后將進行繼續補充和完善，并使其更加規范化和標準化，保證試驗系統的正確性及所獲數據的可靠性，為生殖毒性安全性評價提供科學依據，也可為其他同行實驗室提供一定參考。