指紋圖譜及多成分定量結合化學模式識別法評價不同規格西洋參質量*

毛英民，趙大慶，黃寶泰，李佳奇，陳昊媛，劉 莉**，齊 濱**

（1.長春中醫藥大學吉林省人參科學研究院 長春 130117；2.長春中醫藥大學藥學院 長春 130117）

西洋參（Panax quinquefolium L.）是五加科人參屬多年生草本植物，此品味甘微苦，性涼，歸心、肺、腎經，善益氣、養陰、清熱、為清補佳品[1]。西洋參別名花旗參、洋參、西洋人參。我國有著西洋參生長和繁衍的優越自然生態條件，目前是西洋參生產的主要地區[2]。西洋參是多年生宿根性植物，從播種到收獲，需要4年時間，目前我國常見的西洋參種植方式有兩種，分別為移栽和直播，國外西洋參種植均為直播4年。西洋參的產地、生長年限和種植方式都會影響其質量。西洋參主要有效成分為人參皂苷類成分，以往的質量控制指標一般測定幾種常見的單體皂苷含量，例如Rg1、Re、Rb1，這幾種皂苷很難反映西洋參的整體質量。本研究運用指紋圖譜及多成分定量結合化學模式識別法可以為西洋參的質量控制提供有力的支撐。近年來，西洋參指紋圖譜的研究較少，已有的研究雖然在西洋參質量控制上有所貢獻，但是還有許多方面有待提高，有的很多的化學組分沒有分開，導致共有峰太少；有的指認出的有效成分太少；有的對西洋參不同產地進行指紋圖譜研究，有的對西洋參的不同炮制品種進行指紋圖譜研究。目前西洋參不同年限、不同種植方式的HPLC指紋圖譜尚未見報道。本實驗采用HPLC法，對原產地美國和加拿大4年生西洋參和我國4個產地的不同年限的西洋參以及不同種植方式下的西洋參建立指紋圖譜，其分離度及重現性都較好，對相似度進行了比較，并指認出共有峰中的11種人參皂苷成分，求得其含量，為西洋參的選用提供了參考[3]。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Thermo-Ultimate 3000型高效液相色譜儀，VWD檢測器，Chromeleon 7.2工作站，KQ-600E型超聲波清洗器，循環水式多用真空泵，玻璃砂芯過濾裝置，AK-400A型粉碎機，HH-6型數顯恒溫水浴鍋，梅特勒AB135-S型十萬分之一電子天平。

1.2 藥品與試劑

人參皂苷Rb1（批號DSTDR000601）、Rb2（批號DSTDR000765）、Rb3（批號DSTDR000802）、Rc（批號DST201029-013）、Rd（批號DSTDR001501）、Re（批號DSTDR001401）、Rf（批號DST201105-017）、Rg1（批號 DSTDR000901）、Rg2（批號DSTDR001001）、Rg3（批號DST200401-011）、Rh2（批號DSTDS003601）、Ro（批號DST191226-031）對照品均購自樂美天醫藥德思特生物有限公司，正丁醇（分析純），乙腈（色譜純），甲醇（色譜純），磷酸（分析純），屈臣氏飲用水。

1.3 樣品

表1 20批不同規格的西洋參

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：安捷倫ZORBAX SB-Aq C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：A為乙腈和B為0.05%磷酸水溶液，方法按表2進行梯度洗脫[5]；檢測波長為203 nm；柱溫26.5℃；進樣量10 μL；流速1 mL·min-1。理論板數按人參皂苷Rb1峰計算應不低于5000。

表2 流動相梯度洗脫表

2.2 對照品溶液的制備

用十萬分之一的電子天平，精密稱取12種人參皂苷對照品Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Re、Rf、Rg1、Rg2、Rg3、Rh2、Ro，加色譜級甲醇定容，混勻后用0.22 μm濾膜濾過，取續濾液制成上述12種單體皂苷的混合對照 品 溶 液，濃 度 分 別 為0.740、0.300、0.290、0.305、0.760、0.545、0.285、0.335、0.305、0.385、0.400、0.515 mg·mL-1。

2.3 供試品溶液的制備

用粉碎機把西洋參整根粉碎，過三號篩（50目）得本品粉末，精密稱取其1 g，置于錐形瓶中，加入提前配置好的水飽和正丁醇50 mL，稱定其重量，置于超聲波清洗器（功率600 W）中連接好回流裝置，采用超聲70℃加熱進行提取，1.5 h后停止，取出，放涼，再次稱重，補齊超聲加熱回流中減少的水飽和正丁醇，搖晃均勻，用濾紙過濾[6]。用量筒量取續濾液25 mL，移至蒸發皿中，在通風廚中70℃水浴鍋上蒸干，加入適量的色譜甲醇使殘渣溶解，轉移至5 mL容量瓶中，加甲醇定容，搖晃均勻，用0.22 μm濾膜濾過，取續濾液置于液相小瓶中。

2.4 方法學考察

2.4.1 線性關系

用十萬分之一的電子天平，精密稱取12種人參皂苷對照品稱取對照品Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Re、Rf、Rg1、Rg2、Rg3、Rh2、Ro，加色譜級甲醇使其溶解，配制成濃度分別為4.710、1.006、1.450、1.025、1.350、2.725、1.025、1.075、0.425、0.386、0.365、1.175 mg·mL-1的混合對照品儲備溶液，再用甲醇將其稀釋2、5、10、20、25倍，制成5種不同濃度的混合對照品溶液，按2.1項下色譜條件進樣，將得到的結果以濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y），得到每種成分的回歸方程和線性范圍[7]，結果見表3，表明在定量范圍內各成分的線性良好。

表3 線性關系表

2.4.2 精密度實驗

取配制好的供試品溶液1份，按2.1項下色譜條件連續進樣6次，將峰型較好、保留時間和峰面積大小適中的共有色譜峰Ro為參照峰,計算28個共有峰與參照峰的相對保留時間和相對峰面積，計算得到各共有峰相對保留時間RSD〈1%，相對峰面積的RSD〈3%，表明儀器精密度良好。

換熱站供熱節能改造工程采用合同能源管理模式，簽訂合同時，應明確約定項目的邊界條件和收益計算的基準參數，并規定節能效益的分成比例。

2.4.3 穩定性實驗

取配制好的供試品溶液1份，在制備0、6、12、24、36、48 h后，按2.1項下色譜條件進樣，將峰型較好、保留時間和峰面積大小適中的共有色譜峰Ro為參照峰，計算28個共有峰與參照峰的相對保留時間和相對峰面積，計算得到各共有峰相對保留時間RSD〈1%，相對峰面積的RSD〈3%，表明供試品溶液在48 h內穩定性較好[8]。

2.4.4 重復性實驗

取配制好的供試品溶液6份，按2.1項下色譜條件進樣,將峰型較好、保留時間和峰面積大小適中的共有色譜峰Ro為參照峰，計算28個共有峰與參照峰的相對保留時間和相對峰面積，計算得到各共有峰相對保留時間RSD〈1%，相對峰面積的RSD〈3%，表明該方法的重復性良好。

2.4.5 加樣回收率實驗

取7份樣品S1，分別加入提取溶劑后，其中有6份分別加入2.4.1項下的混合對照品儲備溶液0.4 mL，分別記為H1、H2、H3、H4、H5、H6；最后1份加入空白溶液0.4 mL，記為S1。按2.3項下對樣品進行處理，制備供試品溶液，再按2.1項下色譜條件進樣，計算11種單體皂苷的平均回收率和RSD結果見表4，表明該分析方法準確度良好。

表4 加樣回收率結果

2.5 指紋圖譜的建立及相似度評價

按2.3項下方法，將得到的20批西洋參樣品進行制備，按2.1項下色譜條件，進樣測定。將得到的20批西洋參數據文件以cdf文件的格式，導入到中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012年版）中，將1號樣品的圖譜作為參照譜，選擇中位數法，時間寬度為0.1，進行多點校正和色譜峰mark峰匹配[9-10]，確定了28個共有峰，得到西洋參疊加指紋圖譜，見圖1。

圖1 20批西洋參藥材的HPLC指紋圖譜其對照指紋圖譜（R）

生成對照指紋圖譜R，20批西洋參指紋圖譜與對照圖譜進行相似度評價，結果S1-S20與對照指紋圖譜的 相 似 度 分 別 為0.924、0.922、0.921、0.920、0.931、0.935、0.938、0.940、0.949、0.952、0.936、0.941、0.904、0.910、0.909、0.910、0.925、0.920、0.921、0.923每批西洋參的相似度結果均大于0.90，表明所建立的指紋圖譜方法可對西洋參藥材進行鑒定和質量控制[11]。

2.6 有效成分含量測定

在建立西洋參指紋圖譜的基礎上，采用與對照品比對，見圖2，指認了其中11個共有峰，分別為1號峰人參皂苷Rg1；2號峰人參皂苷Re；3號峰人參皂苷Rg2；4號峰人參皂苷Ro；5號峰人參皂苷Rb1；6號峰人參皂苷Rc；7號峰人參皂苷Rb2；8號峰人參皂苷Rb3；9號峰人參皂苷Rd；10號峰人參皂苷Rg3；11號峰人參皂苷Rh2，未檢測到12號峰人參皂苷Rf，計算其含量，結果見表5。其中個批次樣品中Rg1、Re、Rb1含量的和高于2%，符合2020版《中國藥典》的規定。

表5 20批西洋參中11種人參皂苷成分的含量（n=3，mg·g-1）

圖2 西洋參樣品S1（A）和混合對照品（B）的HPLC色譜圖

2.7 基于化學計量學方法對不同批次的西洋參比較與區分

為了說明不同產地間不同批次的西洋參的品質差異，本研究以測得的西洋參中的11種成分的含量為變量，運用多種統計學方法對20批西洋參樣品進行分析。

2.7.1 聚類分析

聚類分析是一種被用作描述數據的技術方法，可以衡量不同樣品間數據的相似性，是將一些有相似數據基礎的樣品分類到不同簇的一個過程，所以同一個簇中的樣品有更高的相似性，而不同簇間的樣品有著一定相異性。

運用SPSS 21軟件對本實驗20批西洋參樣品進行聚類分析，將測得的11種人參皂苷類成分的含量作為變量，聚類方法使用Ward法（離差平方和法），以平方Eucliodean距離為度量標準[12]，得到系統聚類分析的樹狀圖，結果見圖3，當判別距離為5時，20批西洋參樣品可以分為3類，S1、S2、S3、S4、S17、S18、S19、S20八批樣品為一類，S5、S6、S7、S8、S9、S10、S11、S12八批樣品為一類，S13、S14、S15、S16四批樣品為一類。由結果可知，聚類分析法可以將20批西洋參樣品進行分類，山東文登產區的西洋參（S13-S16）單獨成一類；東北產區的西洋參樣品中，長白的西洋參（S5-S8）和撫松的西洋參（S9-S12）區分效果不是很明顯，歸為一類；集安的西洋參（S1-S4）和美國、加拿大的西洋參（S17-S20）二者有明顯的區分效果但是被歸為一類。長白地區和撫松地區距離很近，兩個產區都屬于吉林省長白山產區，兩個產區的地理生長環境相似，所以兩個產區的西洋參差異不大；集安地區的和美國、加拿大可能在緯度和其他自然條件上相似，生產的西洋參都品質較高。可以看出聚類分析法可以全面反應20批西洋參之間的差異。

圖3 20批西洋參藥材系統聚類分析樹狀圖

2.7.2 主成分分析

主成分分析是一種通過多個變量的線性變換，利用降維的思想，選出少數重要變量的一種多元統計分析方法。在用統計分析方法研究含有多個變量的實驗時，實驗會隨變量的個數增多使復雜程度增高。其實變量之間是有一定的相關關系的，變量之間會有相同的一部分因素，和不同的一部分因素，當兩個變量之間相關關系緊密時，可以認為這兩個變量在反映實驗的時候，有一部分信息是重疊的。主成分分析就是盡可能減少實驗中提出的變量，當變量有很多時，可以將關系之間緊密的幾個變量變成另外一個新變量，且建立出的幾個新變量之間是沒有聯系的，我們可以通過較少的幾個新變量，就可以保留原有的信息且完全反應實驗的內容，減輕了分析實驗的復雜程度[13]。

將測得的11種人參皂苷類成分的含量作為變量導入SPSS 21軟件中，選用因子分析，采用主成分的方法，選擇相關性矩陣，計算得到主成分特征值、累計貢獻率及主成分綜合得分。主成分特征值與方差貢獻率見表6，主成分因子載荷矩陣見表7。將特征值〉1、累計貢獻率〉80%作為提取標準，可提取到2個主成分，第一主成分貢獻率最高為70.676%，第二主成份貢獻率為11.550%，2個主成分累積貢獻率為82.226%，由此可知前2個主成分能反映西洋參中11種人參皂苷的含量信息。

表6 主成分特征值與方差貢獻率

表7 主成分因子載荷矩陣

根據得到的主成分，建立含有2個主成分的PCA模型，其中R2X（cum）表示在進行多元統計分析時，其在X軸方向上保留原始數據信息的百分比平方，其大小為0.995；Q2（cum）為整體模型預測能力參數，大小為0.88。整體來說建立的模型區分度和預測程度都較好[14]。建立含2個主成分的坐標系，得到PCA得分圖，見圖4。從PCA得分圖中我們可以得到20批西洋參的分類信息，可以看出東北集安產區的西洋參（S1-S4）和山東文登產區的西洋參（S13-S16）以及國外西洋參（S17-S20）在PCA得分圖上，比較明顯的被分到獨立區域，而東北長白產區的西洋參（S5-S8）和東北撫松產區的西洋參（S9-S12）在PCA得分圖上分布較集中，兩個地區的區分不是很清晰。20批不同批次的西洋參總體上被分為4類，表明各個批次的西洋參在化學成分含量上有差異性，其主要是受到產地的影響，雖然西洋參的種植方式和種植年限對其也有影響，但其并不是導致每批西洋參有差異的關鍵因素。

圖4 20批西洋參PCA得分圖

對導致西洋參差異的標志成分進行分析，并得到差異性標記物的VIP值，結果見圖5，篩選出導致西洋參差異性較大的成分，以VIP〉1.0的變量作為標準[15]，篩選出造成品質差異的4個主要成分，Rb1、Re、Rd、Ro，其中Rb1、Re的VIP值都大于1.5，其是導致不同批次西洋參差異的主要成分，其在美國、加拿大、集安地區生產的西洋參中含量較高。

圖5 11種人參皂苷成分的VIP預測值分布圖

3 討論

本實驗在前期比較了超聲提取法、加熱回流提取法和超聲加熱回流提取法對峰面積的影響，結果顯示當采用超聲加熱回流提取時，色譜峰的峰面積在整體程度上高于超聲提取法和加熱回流提取法，其中加熱回流提取法時的色譜峰面積又高于超聲提取法的。同時對進樣色譜條件進行了考察，包括色譜柱的選用、流動相的選用、流動相磷酸水的pH、柱溫，綜合各種因素，最終梯度洗脫條件確定為：安捷倫ZORBAX SB-Aq C18色譜柱，柱溫26.5℃，乙腈-0.05%磷酸水溶液，流速1 mL·min-1。

20批西洋參藥材的HPLC化學指紋圖譜結果顯示20批西洋參樣品的相似度均大于0.90。集安、長白、撫松和美國、加拿大的西洋參相似度較高均大于0.92，說明東北3個產區和美國、加拿大產區的西洋參藥材在化學組分和含量上類似，其中又以長白和撫松地區的相似度最高最接近，可能是兩個產區距離較近，地理生長環境相似的原因；集安和美國、加拿大地區的相似度最接近，可能是緯度相接近，生長環境相似的原因。山東文登產區的相似度相對于整體較低，相似度在0.90-0.92之間。說明20批西洋參樣品的化學組分和含量上存在差異，這種差異主要是由產地造成的，不同的生長環境導致西洋參中的化學組分存在著差異，采用指紋圖譜相似度評價方法無法區分不同年限和不同種植方式的西洋參樣品。

含量測定得到了11種人參皂苷的含量，聚類分析和主成分分析反應20批西洋參之間的差異。從皂苷含量和的結果整體來看：進口〉集安〉長白≈撫松〉文登，國內種植方式：4年〉直播4年〉3年〉2年。西洋參的質量不僅與產地有關系，而且還與種植方式有關，在國內移栽種植4年的西洋參人參皂苷含量要高于直播種植4年的西洋參。此外西洋參的質量還與種植的年限有關系，在同一產地西洋參生長的年份越高，人參皂苷類成分含量的和越高，藥材的質量越高；造成西洋參質量差異的主要成分是人參皂苷Rb1、Re、Rd、Ro。

本研究提取溶劑選用水飽和正丁醇，僅對部分化學成分進行提取，所以進行的HPLC分析結果，僅顯現出西洋參藥材部分化學信息。