電針對慢性炎性疼痛大鼠Wnt/β-catenin以及ERK/MAPK信號通路相關蛋白表達的影響*

桑亞男，郭現輝，董 升，王權亮，張安東，閆 瑞

（1.河南中醫藥大學第三附屬醫院 鄭州 450000；2.河南省中醫藥研究院附屬醫院 鄭州 450000；3.阜外華中心血管病醫院 鄭州 450000）

慢性炎癥疼痛是臨床上最常見的病理性疼痛之一，引起的持續性疼痛會對患者身心造成嚴重影響。慢性疼痛的經歷會影響個體的生理狀態，即使在疼痛感覺已經恢復之后，有慢性疼痛經歷的受試者通常對隨后的較低疼痛表現出增強的反應[1]。目前常用的疼痛治療藥物為各類抗炎藥和鎮痛藥，但長期使用會產生不同程度的副作用。針灸鎮痛已被廣泛用于緩解多種疼痛，特別是慢性疼痛。雖然已有研究表明針灸可以通過抗氧化途徑，神經保護和抗炎途徑產生鎮痛作用[2]，但目前針刺鎮痛的機制仍不完善。

Wnt-1和β-catenin是經典Wnt/β-catenin信號通路的關鍵蛋白，已有研究表明，Wnt/β-catenin信號通路以及相關蛋白的表達與炎癥反應密切相關[3-4]。此外，在神經系統發育過程中，Wnt蛋白家族在調節軸突再生和神經性疼痛的發病機制中起著重要作用[5]。Wnt信號通路的激活可刺激促炎因子TNF-α和IL-1β的分泌，加劇神經性疼痛[6-8]。Wnt或β-catenin的活化都可以促進腦源性神經營養因子（BDNF）表達，然后加重神經疼痛[9-11]。然而針灸治療慢性疼痛的機制是否與Wnt/β-catenin信號通路的調控有關仍不清楚。

CREB和ERK蛋白都與各種類型的疼痛傳遞有關[12]，例如神經性疼痛、糖尿病神經病變疼痛、或者辣椒素誘導的疼痛。CREB和ERK蛋白屬于絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族，通過調節背根神經節（DRG）、脊髓和大腦皮層的神經元可塑性和炎癥反應導致疼痛超敏反應[13]。在慢性疼痛的外周和中樞神經系統中都存在MAPKs的過度磷酸化[14-15]，而抑制MAPKs會減弱神經元興奮性并緩解疼痛[16-17]。然而，ERK/MAPK信號通路在針灸治療慢性疼痛中的作用尚不清楚。

因此，本研究建立慢性炎性疼痛大鼠模型，旨在探究電針（Electroacupuncture，EA）干預治療對Wnt/β-catenin信號通路和ERK/MAPK信號通路的影響，進一步明確針刺消炎鎮痛可能的分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康的SPF級雄性SD大鼠，體質量200-250 g，購自成都達碩實驗動物有限公司，合格證號：20190078。所有大鼠均正常飲食飲水。

1.2 試劑與儀器

前列腺素E2（PGE2）ELISA試劑盒（Elabscience，54J6AM7NFP）、白 介 素-6（IL-6）ELISA試 劑 盒（Abcam，ab234570）、IL-1β ELISA試 劑盒（Abcam，ab255730）；兔抗Wnt-1、兔抗β-catenin和兔抗GSK-3β（Abcam，ab15251、ab32572和ab32391）；兔 抗CREB、兔抗p-CREB、兔抗ERK和兔抗p-ERK（Abcam，ab32515，ab32096，ab184699和ab76299）。

ZE5 Bio-Rad全能型成像系統（Bio-Rad，USA）；MK3酶標儀（Thermo，USA）；NC12775 Von-Frey纖維絲測痛儀（上海玉研科學儀器有限公司，中國）。

1.3 方法

1.3.1 實驗動物分組

建模前1天，將SD大鼠置于特制的有機玻璃箱內，適應環境30 min后，對大鼠進行機械痛覺測試，剔除疼痛閾值異常（疼痛閾值過高或過低）的大鼠后分組進行實驗。選出6只大鼠作為對照組，再將剩余的大鼠進行CFA造模，造模成功后，將大鼠隨機分為3組，每組6只，組間大鼠體重沒有顯著性差異，具體分組為：模型組、模型+電針組和模型+假電針組。

1.3.2 CFA動物模型

根據文獻方法建立CFA動物模型[18]：腹膜內注射3%戊巴比妥鈉（50 mg/kg）對大鼠進行麻醉，給實驗組大鼠左后足皮下注射100 μL完全弗氏佐劑誘發足底內炎癥，對照組注射100 μL生理鹽水。造模7天后，與未造模組比較，造模組大鼠左后足出現明顯的紅腫，并且活動行為明顯減少，則造模成功。

1.3.3 電針（EA）治療

在CFA大鼠模型建立后第8天，對EA治療組大鼠左后肢足三里（ST36）和陽陵泉（GB34）進行電針治療，ST36位于膝關節后外側，腓骨小頭下約5 mm處，GB34位于距ST36上外側5 mm處，穴位定位標準參照《實驗針灸學》[19]），針灸針置于大鼠肌肉層（2-3 mm），刺激參數選用疏密波，頻率2/100 HZ，強度0.5-1.5 mA（每10 min增加0.5 mA），每次治療30 min，連續電針治療7天，每天在同一時間（上午9∶00-11∶00）進行。實驗中4組大鼠均在沒有麻醉的情況下被固定在固定裝置內，除電針治療處理外，其余操作完全相同。不同處理為對照組和模型組不進行電針治療，模型組+假電針組針灸針置于大鼠肌肉層（1 mm），但不進行通電治療。

1.3.4 大鼠一般情況觀察

觀察大鼠一般情況，包括大鼠的精神狀態、飲食飲水、步態和足底紅腫程度。

1.3.5 Up-down法檢測機械痛

在實驗前3天取實驗大鼠提前適應Up-down法環境，每次20 min。用VonFrey針刺觸覺測量套件刺激大鼠左后足，Up-down法檢測和計算大鼠機械痛閾，詳細步驟為：將大鼠置于鏤空的行為檢測鋼絲網上適應后，然后序貫采用1.4、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、15.0、26.0 g的Von Frey細絲垂直檢測各組大鼠足底疼痛閾值，若出現縮足、舔足、抬足等行為，則表明該Von Frey細絲對應規格為此時大鼠足底疼痛閾值。檢測時間點在EA治療的前1天（T0）、第1天（T1）、第3天（T3）、第5天（T5）和第7天（T7）記錄大鼠機械痛變化。

1.3.6 化學刺激法檢測冷刺激痛覺超敏反應

在檢測機械痛30 min后，以0.2 mL丙酮快噴射大鼠左后足，觀察大鼠的應激反應情況，根據其對冷刺激的反應進行冷刺激評分，沒有任何反應者為0分；輕抬受刺激的后足為1分；反復劇烈抬、搖晃后足為2分；持續或反復撤足并舔爪、搖爪或大叫者為3分[20]。于EA治療的前1天（T0）、第1天（T1）、第3天（T3）、第5天（T5）和第7天（T7）記錄大鼠冷刺激評分。

1.3.7 ELISA檢測血清和左后足組織中PGE2、IL-6、TNF-α和IL-1β的表達

實驗最后1天，在行為學測試結束后1 h，大鼠麻醉后腹主動脈取血，4℃，5000 r/min離心10 min后取血清；取致炎足足底組織，冰浴研磨，制備組織勻漿，3000 r/min離心15 min，取上清。ELISA法檢測上清和血清中PGE2、IL-6、TNF-α、IL-1β和BDNF的含量，具體操作參考試劑盒說明書。

1.3.8 Western blot檢測左后足組織中相關蛋白的表達水平

取大鼠左后足組織，PBS清洗，加裂解液，冰浴研磨，離心后收集上清，Bradford法測定蛋白濃度。取25 μg蛋白，進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，并轉移至PVDF膜，然后進行TBST清洗、一抗孵育（Wnt-1，1∶1000；β-catenin，1∶5000；GSK-3β，1∶5000；CREB，1∶1000；p-CREB，1∶5000；ERK，1∶10000；p-ERK，1∶10000）、TBST清洗、二抗孵育（抗兔HRP標記的二抗，1∶5000，Santa Cruz Biotechnology）、TBST清洗等常規Western blot操作步驟，最后加入超敏發光底物曝光，使用Image J分析蛋白相對表達水平，β-actin為內參。

1.4 統計學分析

采用GraphPad 8.0統計軟件對實驗結果進行分析，實驗結果用均值±標準差（±s）表示。本實驗中數據均呈正態分布，對照組和模型組采用T檢驗，模型組、電針組和假電針組三組間采用單因素分析，方差齊性，事后檢驗采用Tukey做事后分析，方差不齊，事后檢驗采用Dunnett's做事后分析。P〈0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 電針治療對慢性炎性疼痛大鼠大體情況的影響

四組大鼠精神狀態都表現良好，飲食飲水正常。正常組大鼠未發現明顯異常狀況，其余三組小鼠造模后，均出現患足紅腫、活動行為明顯減少，并且活動時有不同程度的拖足表現。

2.2 電針治療對慢性炎性疼痛大鼠機械痛閾值與冷痛覺反應的影響

結果如圖1所示，與對照組相比，第0天、第1天、第3天、第5天和第7天的模型組小鼠機械痛閾值均顯著降低（均P〈0.001），冷刺激評分均顯著升高（均P〈0.001）。EA治療第1天和第3天，與模型組相比，EA治療組大鼠機械痛閾值有升高趨勢（均P〉0.05），冷刺激評分有下降趨勢（均P〉0.05），但差異不顯著；在EA治療后第5天及第7天，EA治療組大鼠的機械痛閾值顯著增高（P〈0.01，P〈0.001），冷刺激評分顯著降低（均P〈0.05）。此外，與模型組相比，假EA治療組大鼠的機械痛閾值和冷刺激評分均無顯著改變。

圖1 機械痛域及冷刺激評分檢測結果（g）（n=6）

2.3 電針治療對慢性炎性疼痛大鼠血清、左后足組織中炎癥介質的影響

與對照組相比，模型組大鼠血清和左后足組織中的炎癥介質IL-1β、IL-6、PGE2、TNF-α和BDNF的表達水平顯著升高（均P〈0.001）。與模型組相比，EA治療顯著降低了CFA大鼠血清IL-1β（P〈0.05）、IL-6（P〈0.05）、PGE2（P〈0.05）、TNF-α（P〈0.05）和BDNF（P〈0.01）的表達水平，并下調了左后足組織中IL-1β（P〈0.01）、IL-6（P〈0.05）、PGE2（P〈0.01）、TNF-α（P〈0.01）和BDNF（P〈0.05）的表達水平。此外，假EA治療對CFA大鼠血清和左后足組織中PGE2、IL-6、TNF-α、IL-1β和BDNF的表達無顯著影響（均P〉0.05）。見表1，表2。

表1 血清中PGE2、IL-6、TNF-α和IL-1β的表達（n=6）

表2 左后足組織中PGE2、IL-6、TNF-α和IL-1β的表達（n=6）

2.4 電針治療對對慢性炎性疼痛大鼠左后足組織中Wnt/β-catenin信號通路的影響

如圖2所示，與對照組相比，模型組大鼠左后足組織中Wnt-1、β-catenin、GSK-3β的蛋白表達水平均顯著上升（P〈0.001）。與模型組相比，EA治療組大鼠左后足組織中Wnt-1和β-catenin的蛋白表達水平顯著下降（P〈0.001），GSK-3β蛋白的表達水平顯著上升（P〈0.001）。此外，假EA治療組與模型組相比，大鼠左后足組織中Wnt-1和β-catenin蛋白顯著下降（P〈0.05，P〈0.01），GSK-3β蛋白顯著上升（P〈0.001）。

圖2 各組大鼠左后足組織中Wnt/β-catenin信號通路分子的表達（±s，n=6）

2.5 電針治療對對慢性炎性疼痛大鼠左后足組織中ERK/MAPK信號通路的影響

如圖3所示，與對照組相比，模型組大鼠左后足組織中CREB和ERK蛋白磷酸化水平均顯著上升（P〈0.001）。與模型組相比，EA治療組大鼠左后足組織中CREB和ERK蛋白磷酸化水平顯著下降（P〈0.001）。此外，假EA治療組與模型組相比，大鼠左后足組織中CREB蛋白磷酸化水平顯著下降（P〈0.05），但ERK蛋白磷酸化水平無明顯差異（P〉0.05）。

圖3 各組大鼠左后足組織中ERK/MAPK信號通路分子的表達（±s，n=6）

3 討論

慢性炎癥疼痛是世界上患病率很高的疾病[21]，通常與精神疾病和神經發育疾病（包括重度抑郁癥）并存[22]，同時慢性疼痛常伴發患者睡眠障礙[23]，嚴重影響患者身心健康。針刺是中國傳統醫學之一，能治療各種急慢性疼痛[24-26]。左后足皮下注射完全弗氏佐劑是常用的慢性炎性疼痛動物模型建模方法[18]。祖國中醫學說認為疼痛的病機是“不通則痛”和“不榮則痛”，因此中醫以化瘀通絡止痛及益氣養血止痛兩種為主[27]。中醫針灸理論認為，針刺特定的腧穴、經脈，能夠疏通經絡、調和氣血，因而改善氣滯血瘀、經脈痹阻所導致的疼痛[27]。陽陵泉（GB34）穴為足少陽之脈所入為合的合上學，為八會穴之筋會，針刺陽陵泉穴可疏肝利膽、舒筋利節[28]。足三里（ST36）穴屬足陽明胃經，為胃經合穴，針刺可生化氣血，榮養四肢百骸，梳理上、中、下三焦之氣血[29]。足三里（ST36）和陽陵泉（GB34）是中醫針刺治療常用的組合穴位，化瘀通絡，益氣養血。EA基于傳統針灸衍生而來，相比于傳統針灸，EA具有操作簡便、更加安全的優點[30]。沈偉等[31]研究表明電針足三里（ST36）和陽陵泉（GB34）可以緩解CFA模型大鼠的疼痛。本研究表明也表明足三里（ST36）和陽陵泉（GB34）對CFA模型大鼠有陣痛效果，與沈偉等[31]研究結果一致，而假EA對CFA大鼠疼痛無明顯改善。

細胞因子介導促炎或抗炎反應，IL-1β、IL-6、TNF-α是促炎因子的標志物[32-33]。PGE2是一種經典的炎癥介質，在炎癥反應中介導疼痛和發熱[34]。因此炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α和炎癥介質PGE2的表達水平一定程度上代表了炎癥反應程度。而BDNF通過中樞敏化調節慢性疼痛的發展[35]。本研究表明，EA治療結束后血清和左后足組織中炎癥因子PGE2、IL-6、TNF-α、IL-1β和BDNF表達也顯著下降，這些表明電針治療能顯著改善CFA大鼠炎癥反應和疼痛反應。此外，假EA對CFA大鼠炎癥反應無顯著改變。

慢性炎癥痛的發生機制尚不明確，目前較為認可的是炎癥機制[18,36]。張媛媛等[37]發現EA可能通過抑制大鼠關節Wnt/β-catenin信號通路下調MMP-13的表達，降低促炎因子IL-1β的釋放，改善膝骨關節炎軟骨退變。有多項研究發現EA通過Wnt/β-catenin信號通路參與脊髓損傷的組織修復過程[38-39]。因此，Wnt/β-catenin信號通路被認為是EA治療作用的炎性通路之一。研究表明GSK-3β與Axin、APC、CK1形成的復合物在細胞質內使β-catenin磷酸化而降解，而Wnt蛋白能與Fzd、LRP5/6結合，募集Dvl，阻止GSK-3β與Axin、APC、CK1復合物的形成，從而阻止β-catenin磷酸化，使β-catenin在細胞質中累積造成炎癥反應[40]，因此提高GSK-3β的表達有利于抑制β-catenin在細胞質中累積造成的炎癥反應。本研究結果顯示，EA抑制了Wnt/β-catenin信號通路的活化，提高了GSK-3β的表達，提示EA作用機制與GSK-3β促進β-catenin磷酸化有關。令人意外的是，在CFA模型組大鼠中GSK-3β的表達水平顯著上升。研究表明，動物機體組織都具有自我修復的功能[41-42]，而肌肉是一種具有強大的自我修復功能的組織，當受到輕微損傷時肌肉組織可以自我修復[43]，因此我們推測這是CFA大鼠機體自我修復的結果，而EA促進了CFA大鼠機體的自我修復，但EA促進CFA自我修復的作用機制仍進一步研究。

CREB和ERK蛋白都與各種類型的疼痛傳遞有關。外周神經損傷會引起神經性疼痛和背根神經節（DRG）和背角中絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族成員的磷酸化。神經損傷后，細胞外信號調節蛋白激酶（ERK）（MAPK家族的重要成員）的磷酸化在神經元、小膠質細胞和背角星形膠質細胞中依次增加[44]。神經損傷誘導的ERK磷酸化（p-ERK）發生較早且持續時間長，并且發生在多種神經性疼痛動物模型中，例如，當受到傷害性疼痛刺激時，背根神經節和脊髓中的CREB和ERK蛋白表達升高[12]。此外，CREB和ERK蛋白在神經性疼痛模型、糖尿病神經病變模型或辣椒素誘導疼痛模型中，表達也會升高[12]。研究表明，抑制ERK激活的MEK抑制劑可在不同時間點有效緩解疼痛[13,45-46]。然而，在CFA動物模型中，CREB和ERK蛋白在慢性疼痛中的可能作用尚不清楚。本研究表明，CREB和ERK蛋白磷酸化水平在CFA疼痛組織中升高，EA電針抑制了CREB和ERK蛋白的磷酸化，表明EA治療CFA與其抑制ERK/MAPK信號通路有關。

此外，我們發現假電針抑制了Wnt和β-catenin的蛋白表達，并且降低了CREB蛋白磷酸化水平，但ERK蛋白磷酸化水平無明顯差異。有趣的是，假電針治療7天后對大鼠疼痛和炎癥反應并無明顯改善，這有可能是因為假電針同樣刺激了足三里（ST36）和陽陵泉（GB34）兩個穴位，改善了Wnt/β-catenin信號通路和ERK/MAPK信號通路，對CFA有治療作用，但是其對CFA的治療效果較慢，在治療7天后無法達到明顯改善CFA疼痛的效果。同時，這也說明電針介入的時間點很可能對慢性炎性疼痛療效有影響，然而，其具體影響機制還需進一步證明。

總而言之，本研究表明，EA顯著改善了大鼠慢性炎性疼痛，其機制可能與EA抑制Wnt/β-catenin信號通路以及ERK/MAPK信號通路有關。