狼毒大戟中4種二萜類成分在大鼠肝微粒體中的代謝

馬天成 馬玉坤 孫珈 張金玲 郭麗娜 劉琦 孫宇

中圖分類號 R969.1 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2022）04-0465-08

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2022.04.14

摘 要 目的 研究狼毒大戟中4種二萜類成分在大鼠肝微粒體中的代謝產物并探討其代謝規律。方法 運用大鼠肝微粒體體外孵育法，將巖大戟內酯A、巖大戟內酯B、17-羥基巖大戟內酯A、17-羥基巖大戟內酯B加至由還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸啟動的大鼠肝微粒體孵育體系中，于37 ℃條件下孵育30 min，再用乙腈終止反應。以陰性組（先加乙腈再啟動孵育30 min）為參考，采用超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質譜聯用技術，利用Analyst? TF 1.7.1、PeakView?2.2、MetabolitePilot 1.5、MasterView 1.2軟件對其質譜裂解規律和代謝產物進行推測與鑒定。結果 4種二萜類成分在二級質譜中均易丟失H2O和CO等中性碎片。巖大戟內酯A和17-羥基巖大戟內酯A在肝微粒中的代謝反應主要為二羥基化、脫氫和一羥基化反應，分別鑒定出6、5個代謝產物。巖大戟內酯B和17-羥基巖大戟內酯B在肝微粒體中的代謝反應主要為一羥基化、水合和同分異構化反應，均鑒定出5個代謝產物。結論 巖大戟內酯A和17-羥基巖大戟內酯A在大鼠肝微粒體中均產生了羥基化及脫氫代謝產物，巖大戟內酯B和17-羥基巖大戟內酯B在大鼠肝微粒體中均產生了羥基化、水合及同分異構化代謝產物。4種二萜類成分的代謝產物均是Ⅰ相代謝產物。

關鍵詞 狼毒大戟;二萜類成分;超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質譜聯用技術;大鼠肝微粒體;體外代謝

Metabolism of four diterpenoids of Euphorbia fischeriana in liver microsomes of rats

MA Tiancheng1，2，MA Yukun1，SUN Jia1，ZHANG Jinling1，GUO Lina1，LIU Qi1，SUN Yu1（1. Academy of Medical Sciences， Qiqihar Medical University， Heilongjiang Qiqihar 161006， China; 2. College of Traditional Chinese Medicine， Shenyang Pharmaceutical University， Shenyang 110016， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE To study the metabolites of four diterpenoids of Euphorbia fischeriana in liver microsomes of rats and to investigate its metabolic regularity. METHODS In vitro incubation system of liver microsomes of rats was built. The jolkinolide A， jolkinolide B， 17-hydroxyl jolkinolide A and 17-hydroxyl jolkinolide B were added into incubation system of liver microsomes in rats activated by reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate， incubated at 37 ℃ for 30 min， and then terminated the reaction with acetonitrile. Taking the negative group （adding acetonitrile firstly and then starting incubation for 30 min） as the reference， the ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry was used; Anaylyst? TF 1.7.1、PeakView? 2.2， MetabolitePilot 1.5 and MasterView 1.2 software were used to speculate and identify the fragmentation law of mass spectrometry and metabolites. RESULTS Four diterpenoids were easy to lose neutral fragments such as H2O and CO in secondary mass spectrometry. Jolkinolide A and 17-hydroxyl jolkinolide A showed similar metabolism pathway， including dihydroxylation， dehydrogenation， and monohydroxylation; six and five metabolites were identified respectively. Jolkinolide B and 17-hydroxyl jolkinolide B showed similar metabolism pathway， including monohydroxylation， hydration and isomerization. Five metabolites were identified. CONCLUSIONS Both jolkinolide A and 17-hydroxyl jolkinolide A produce the metabolites of hydroxylation and dehydrogenation in liver microsomes of rats; both jolkinolide B and 17-hydroxyl jolkinolide B produce the metabolites of hydroxylation， hydration and isomerization in liver microsomes of rats. The metabolites of four diterpenoids are phase Ⅰ metabolites.

KEYWORDS? ?Euphorbia fischeriana; diterpenoids; ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry;liver microsomes in rats; in vitro metabolism

狼毒大戟Euphorbia fischeriana Steud.主要生長于我國內蒙古、東北及河北等地區。其以根入藥，味苦、辛，性平，有毒，具有泄水逐飲、破積殺蟲的功效，是我國傳統中藥材[1]。現代藥理學研究表明，狼毒大戟具有抗腫瘤、抗細菌、抗真菌、抗病毒、抗癲癇等多種活性[2-3]。狼毒大戟的主要成分包括二萜類、三萜類、香豆素類、酚酸類、甾醇類等，其中二萜類成分為其主要的活性成分[4]。巖大戟內酯A、巖大戟內酯B、17-羥基巖大戟內酯A和17-羥基巖大戟內酯B是狼毒大戟中含量較高且活性較強的二萜類成分[5]。

在早期的藥物-藥物相互作用研究中，體外肝微粒體孵育體系是探討藥物代謝的重要模型[6]。體外代謝研究可在新藥研發早期利用體外代謝參數合理預測候選化合物的體內藥動學行為，指導其后期藥動學、藥效學研究以及安全性評價模型的選擇[7]。本研究擬采用大鼠肝微粒體體外孵育法結合超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質譜聯用技術研究狼毒大戟中巖大戟內酯A、巖大戟內酯B、17-羥基巖大戟內酯A和17-羥基巖大戟內酯B的代謝產物，并對其可能的裂解途徑進行推測，探討其代謝規律，旨在為這4種二萜類活性成分的代謝途徑及在體藥動學研究奠定基礎。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括30A型超高效液相色譜儀（日本Shimadzu公司）、Triple TOF 4600型質譜儀（美國AB Sciex公司）、AB135-S型分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）、Elix Essential 5 UV型純水儀（美國Merck Millipore公司）、B8800型超聲波清洗器（美國Branson公司）、Centrifuge 5417R型離心機（德國Eppendorf公司）、HYQ-2121A型渦旋混勻器（美國Crystal公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

巖大戟內酯A、巖大戟內酯B、17-羥基巖大戟內酯A和17-羥基巖大戟內酯B對照品（批號分別為EF-1、EF-2、EF-3、EF-4，經高效液相色譜法檢測純度均大于98%）均由齊齊哈爾醫學院醫藥科學研究院天然藥物化學實驗中心制備;甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）均購自美國Merck公司;甲酸（質譜純）購自美國Thermo Fisher Scientific公司;還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）購自大連美侖生物技術有限公司;磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、氯化鎂均購自天津市科密歐化學試劑有限公司;其余試劑均為分析純或實驗室常用規格，水為純化水。

1.3 肝微粒體

大鼠肝微粒體（批號M10011，質量濃度20 mg/mL）購自武漢普萊特生物醫藥技術有限公司。

2 方法與結果

2.1 色譜與質譜條件

2.1.1 色譜條件

以Phenomenex C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）為色譜柱，以0.1%甲酸溶液（A）-0.1%甲酸乙腈溶液（B）為流動相進行梯度洗脫（0～0.01 min，20%B，0.01～1.00 min，20%B→30%B;1.00～7.00 min，30%B→50%B，7.00～10.00 min，50%B→70%B;10.00～15.00 min，70%B→100%B;15.00～16.00 min，100%B;16.00～16.10 min，100%B→20%B;16.10～18.00 min，20%B）;柱溫為40 ℃;流速為0.3 mL/min;進樣量為2 μL。

2.1.2 質譜條件

離子源為電噴霧離子源;離子噴霧電壓為5.5 kV;離子源溫度為600 ℃;去簇電壓為100 V;碰撞能量為10 eV。霧化氣、輔助氣和氣簾氣均為氮氣，其壓力分別為55、55、35 psi。在正離子模式下進行全掃描，累計時間為250 ms。采用數據依賴采集模式進行分析，即對每個分析物中質譜響應超過100 cps的15個最強碎片離子進行子離子掃描，掃描范圍為100～1 200 amu，累計掃描時間為100 ms。碰撞能量差為15 eV，并開啟動態背景扣除。采用自動校準系統對質譜和質譜/質譜自動進行調諧和校正。數據獲取和處理分析采用Analyst?TF 1.7.1和PeakView?2.2軟件，利用MetabolitePilot 1.5和MasterView 1.2軟件對代謝產物進行推測與鑒定。

2.2 溶液的配制

2.2.1 磷酸鹽緩沖液

精密稱取磷酸氫二鈉1.496 g，用水定容于50 mL量瓶中;再精密稱取磷酸二氫鉀1.361 g，用水定容于50 mL量瓶中;將上述配制的磷酸二氫鉀溶液逐滴加入到磷酸氫二鈉溶液中，直至所得混合溶液的pH為7.4，即得。

2.2.2 氯化鎂溶液

精密稱取氯化鎂0.953 g，用水定容于200 mL量瓶中，得5 mmol/L的氯化鎂溶液。

2.2.3 NADPH溶液

精密稱取NADPH 10 mg，加水0.6 mL，混勻，得4 mmol/L的NADPH溶液，現用現配。

2.2.4 樣品溶液

分別精密稱取巖大戟內酯A、巖大戟內酯B、17-羥基巖大戟內酯A和17-羥基巖大戟內酯B對照品適量，加入一定量的二甲基亞砜進行溶解，使上述各成分的質量濃度均為1 mg/mL，即得。

2.3 大鼠肝微粒體體外孵育實驗

孵育體系包含pH 7.4的磷酸鹽緩沖液100 μL、水49 μL、肝微粒體10 μL、5 mmol/L氯化鎂溶液20 μL。本研究設實驗組（肝微粒體代謝后組）和陰性組（肝微粒體代謝前組）。兩組孵育體系中分別加入1 mg/mL的巖大戟內酯A、巖大戟內酯B、17-羥基巖大戟內酯A、17-羥基巖大戟內酯B樣品溶液各1 μL，在37 ℃下預孵育5 min。然后，實驗組加入4 mmol/L的NADPH溶液20 μL啟動反應，在37 ℃下繼續孵育30 min后，加入冰乙腈600 μL終止反應;陰性組先加入冰乙腈600 μL，再加入4 mmol/L的NADPH溶液20 μL，在37 ℃條件下繼續孵育30 min。取各組樣品，渦流混勻30 s，以14 000 r/min離心10 min，取上清液于另一EP管中，于37 ℃下以氮氣流吹干，殘渣加甲醇200 μL復溶，再以14 000 r/min離心10 min，取上清液2 μL按“2.1”項下條件進樣分析。

2.4 4種二萜類成分的質譜裂解途徑及代謝產物分析

2.4.1 巖大戟內酯A

（1）質譜裂解途徑：巖大戟內酯A的準分子離子峰的m/z為315.195 2[M+H]+。在其二級質譜圖（圖1）中，m/z 297.184 0、287.202 0[M+H]+推測是由準分子離子峰分別脫去1分子H2O和1分子CO而得;m/z 287.202 0

[M+H]+繼續脫去1分子H2O得到m/z 269.191 0[M+H]+的碎片離子峰;m/z 227.105 3、191.070 4、177.054 0、163.038 6、139.038 4、121.064 3、105.069 6等[M+H]+為巖大戟內酯A裂環后產生的碎片離子峰。巖大戟內酯A可能的主要質譜裂解途徑如圖2所示。

（2）代謝產物：對實驗組和陰性組巖大戟內酯A的提取離子流圖（圖3）進行比較，根據保留時間（retention time，tR）共鑒定出6個代謝產物（記為M1～M6）。結合其精確分子量和二級質譜信息（表1），參考巖大戟內酯A可能的質譜裂解途徑（圖2），推測這些化合物是巖大戟內酯A的二羥基化代謝產物、二羥基化+脫氫代謝產物及一羥基化代謝產物。

其中，M1和M2的分子式皆為C20H26O5，tR分別是6.94、7.57 min，準分子離子峰分別為m/z 347.184 0、347.185 7[M+H]+。在M1的二級質譜信息中，主要的碎片離子峰m/z 329.176 4、311.163 9、293.156 0[M+H]+為準分子離子峰依次脫去1分子H2O而得，碎片離子峰m/z 301.176 7、283.165 6[M+H]+分別為m/z 329.176 4、311.163 9[M+H]+進一步脫去1分子CO而得。在M2的二級質譜信息中，主要的碎片離子峰m/z 329.171 9、311.162 8、293.152 1[M+H]+為準分子離子峰依次脫去1分子H2O而得，碎片離子峰m/z 299.165 7、283.153 9[M+H]+分別為329.171 9、311.163 9[M+H]+進一步脫去1分子CH2O和1分子CO而得。與巖大戟內酯A相比，M1和M2的質量數都多了32，推測其可能為巖大戟內酯A的二羥基化代謝產物。

M3、M5和M6的分子式皆為C20H26O4，tR分別是8.80、9.19、11.03 min，準分子離子峰分別為m/z 331.190 9、331.190 8、331.191 1[M+H]+。與巖大戟內酯A相比，質量數都多了16，推測其可能為巖大戟內酯A的一羥基化代謝產物。在二級質譜信息中，M3、M5和M6產生了類似的碎片離子。經過與對照品比對，M6被鑒定為17-羥基巖大戟內酯A，故可確定M6的羥基化位點為C17位。

M4的分子式為C20H24O5，tR為8.96 min，準分子離子峰為m/z 345.169 9[M+H]+。與M1相比，M4的質量數少了2。在M4的二級質譜信息中，主要的碎片離子峰m/z 299.168 9[M+H]+為準分子離子峰脫去1分子H2O和CO而得;m/z 299.168 9[M+H]+再進一步脫水，則可產生m/z 281.143 4[M+H]+的碎片離子峰，推測M4可能為巖大戟內酯A的二羥基化+脫氫代謝產物。

2.4.2 巖大戟內酯B

（1）質譜裂解規律：巖大戟內酯B的準分子離子峰為m/z 331.190 6[M+H]+。在其二級質譜圖（圖4）中，m/z 313.179 6、295.195 7[M+H]+推測是由準分子離子峰依次脫去1分子H2O而得;m/z 303.195 7、285.185 1[M+H]+推測是由準分子離子峰依次脫去1分子CO和1分子H2O而得;此外，巖大戟內酯B還因裂環產生了m/z 193.049 5、183.116 3、165.054 8、137.059 5、125.022 9[M+H]+等一系列碎片離子峰。巖大戟內酯B可能的主要質譜裂解途徑如圖5所示。

（2）代謝產物：對實驗組和陰性組巖大戟內酯B的提取離子流圖（圖6）進行比較，根據tR共鑒定出5個代謝產物（記為N1～N5）。結合其精確分子量和二級質譜信息（表2），參考巖大戟內酯B可能的質譜裂解途徑（圖5），推測這些化合物為巖大戟內酯B的一羥基化+水合代謝產物、一羥基化代謝產物、水合代謝產物及同分異構化代謝產物。

N1和N2的分子式皆為C20H28O6，tR分別是6.53、8.17 min，準分子離子峰分別為m/z為365.196 4、365.195 8

[M+H]+。與巖大戟內酯B相比，兩者的質量數均多了34，即多了1分子H2O2，因此推測N1、N2為巖大戟內酯B的一羥基化+水合代謝產物。

N3的分子式為C20H26O5，tR為8.53 min，準分子離子峰為m/z 347.181 0[M+H]+。與巖大戟內酯B相比，N3的質量數多了16，因此推測N3為巖大戟內酯B的一羥基化代謝產物。

N4的分子式為C20H26O4，tR為8.65 min，準分子離子峰為m/z 331.190 7[M+H]+。與巖大戟內酯B相比，N4具有相同的分子式，因此推測N4可能為巖大戟內酯B的同分異構化代謝產物。

N5的分子式為C20H28O5，tR為9.57 min，準分子離子峰為m/z 349.202 0[M+H]+。與巖大戟內酯B相比，N5的質量數多了18，即1分子H2O，因此推測N5可能為巖大戟內酯B的水合代謝產物。

2.4.3 17-羥基巖大戟內酯A

（1）質譜裂解途徑：17-羥基巖大戟內酯A的準分子離子峰為m/z 331.190 3[M+H]+。在其二級質譜圖（圖7）中，m/z 313.179 8、295.169 0[M+H]+推測是由準分子離子峰依次脫去1分子H2O而得;m/z 285.185 4[M+H]+推測是由m/z 313.179 8[M+H]+脫去1分子CO而得;此外，17-羥基巖大戟內酯A還因裂環產生了m/z 239.106 5、227.104 8、199.075 3、189.054 1、175.148 2、161.131 6、147.043 5、133.100 5、119.085 6、105.069 2[M+H]+等一系列碎片離子峰。17-羥基巖大戟內酯A可能的主要質譜裂解途徑如圖8所示。

（2）代謝產物：將實驗組和陰性組17-羥基巖大戟內酯A的提取離子流圖（圖9）進行比較，根據tR共鑒定出5個代謝產物（記為P1～P5）。結合其精確分子量和二級質譜信息（表3），參考17-羥基巖大戟內酯A的質譜裂解途徑（圖8），推測這些化合物可能為17-羥基巖大戟內酯A的一羥基化代謝產物及二羥基化+脫氫代謝產物。

P1、P2、P5的分子式皆為C20H26O5，tR分別為6.88、6.94、7.59 min，準分子離子峰分別為m/z 347.185 7、347.185 0、347.186 4[M+H]+。與17-羥基巖大戟內酯A相比，三者的質量數均多了16，因此推測其可能為17-羥基巖大戟內酯A的一羥基化代謝產物。

P3和P4的分子式皆為C20H24O6，tR分別為7.38、7.44 min，準分子離子峰均為m/z 361.164 9[M+H]+。與17-羥基巖大戟內酯A相比，兩者的質量數多了30，即分子式上多了2個O、少了2個H，因此推測其可能為17-羥基巖大戟內酯A的二羥基化+脫氫代謝產物。

2.4.4 17-羥基巖大戟內酯B

（1）質譜裂解途徑：17-羥基巖大戟內酯B的準分子離子峰為m/z 347.186 7[M+H]+。在其二級質譜圖（圖10）中，m/z 329.174 7、311.164 9[M+H]+推測是由準分子離子峰依次脫去1分子H2O而得;m/z 301.180 3、283.169 3[M+H]+推測是由m/z 329.174 7[M+H]+依次脫去1分子CO和1分子H2O而得;此外，17-羥基巖大戟內酯B還因裂環產生了m/z 227.106 4、213.091 7、191.034 6、163.040 1、131.049 5、123.008 3、109.102 7[M+H]+等一系列碎片離子峰。17-羥基巖大戟內酯B可能的主要質譜裂解途徑如圖11所示。

（2）代謝產物：對實驗組及陰性組的17-羥基巖大戟內酯B提取離子流圖（圖12）進行比較，根據tR共鑒定出5個代謝產物（記為Q1～Q5）。結合其精確分子量和二級質譜信息（表4），參考17-羥基巖大戟內酯B可能的質譜裂解途徑（圖11），推測這些化合物可能為17-羥基巖大戟內酯B的一羥基化+水合代謝產物、一羥基化代謝產物、水合代謝產物及同分異構化代謝產物。

Q1和Q2的分子式皆為C20H28O7，tR分別為5.15、5.43 min，準分子離子峰分別為m/z 381.190 7、391.191 7[M+H]+。與17-羥基巖大戟內酯B相比，兩者的質量數多了34，即分子式多了H2O2，因此推測其可能為17-羥基巖大戟內酯B的一羥基化+水合代謝產物。

Q3的分子式為C20H26O6，tR為7.01 min，準分子離子峰為m/z 363.181 6[M+H]+;Q5分子式為C20H28O6，tR為8.18 min，準分子離子峰為m/z 365.196 9[M+H]+。與17-羥基巖大戟內酯B相比，Q3分子式多了O，Q5分子式多了H2O，因此推測Q3可能為17-羥基巖大戟內酯B的一羥基化代謝產物，Q5可能為17-羥基巖大戟內酯B的水合代謝產物。

Q4的分子式為C20H26O5，tR為8.00 min，準分子離子峰為m/z 347.186 2[M+H]+。與17-羥基巖大戟內酯B相比，兩者分子量相同，因此推測Q4可能為17-羥基巖大戟內酯B的同分異構化代謝產物。

3 討論

在預實驗中，筆者同時采用了正離子和負離子兩種質譜掃描模式對巖大戟內酯A、巖大戟內酯B、17-羥基巖大戟內酯A、17-羥基巖大戟內酯B的肝微粒體代謝產物進行解析，結果顯示，正離子掃描模式可獲得更多的二級碎片信息，故最終采用正離子模式對代謝產物的結構進行解析。

本研究結果顯示，巖大戟內酯A、巖大戟內酯B、17-羥基巖大戟內酯A、17-羥基巖大戟內酯B在正離子檢測條件下的二級質譜裂解方式存在共性。經過查閱文獻[8-10]和本文結果可知，上述4種二萜類化合物的二級質譜均易丟失H2O和CO等中性碎片，并產生一系列碎片離子。隨后，本研究通過解析原型藥物及其代謝產物的二級質譜裂解規律、tR、精確分子量等數據發現，巖大戟內酯A和17-羥基巖大戟內酯A在肝微粒中的代謝途徑相似，主要為二羥基化、脫氫和一羥基化反應;巖大戟內酯B和17-羥基巖大戟內酯B在肝微粒體中的代謝途徑相似，主要為一羥基化、水合及同分異構化反應。通過與對照品比對發現，巖大戟內酯A可在肝微粒體中經一羥基化反應生成17-羥基巖大戟內酯A，進而推斷出巖大戟內酯A在肝微粒體中可在C17位發生甲基羥基化。在結構上，與巖大戟內酯A和17-羥基巖大戟內酯A相比，巖大戟內酯B和17-羥基巖大戟內酯B的C11、C12位多了1個三元氧環，由此推測這兩個成分可能在肝微粒體中發生C11與C12的氧環開裂，再進一步進行水合反應，然后經羥基脫水生成原型藥物的同分異構化代謝產物。巖大戟內酯A、巖大戟內酯B、17-羥基巖大戟內酯A和17-羥基巖大戟內酯B在二級質譜中產生了大量的裂環碎片離子，由于二萜類化合物結構復雜，可能存在多種裂環方式，暫無法對各裂解碎片進行逐一歸屬。因此，在沒有對照品的情況下，較難推測各化合物羥基化代謝產物的羥基結合位點。在今后的研究中，可在大量富集代謝產物后進行分離，得到單體代謝產物，再通過核磁共振等手段對其結構進行鑒定。

通過對比筆者前期對巖大戟內酯B體內代謝的研究結果[9]發現，該成分體內外代謝途徑有相似之處，但也存在一定差異。在體內與體外代謝中，巖大戟內酯B均產生了氧化代謝產物，并且推測其C11、C12位的三元氧環在代謝中都發生了開裂現象;不同的是，巖大戟內酯B在體內代謝中產生了脫水代謝產物，而在體外肝微粒體代謝中產生了水合代謝產物。

綜上所述，巖大戟內酯A和17-羥基巖大戟內酯A在大鼠肝微粒體中均產生了羥基化及脫氫代謝產物，巖大戟內酯B和17-羥基巖大戟內酯B在大鼠肝微粒體中均產生了羥基化、水合及同分異構化代謝產物。4種二萜類成分在大鼠肝微粒體中的代謝產物均是Ⅰ相代謝產物，未發現Ⅱ相代謝產物。

參考文獻

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（收稿日期：2021-11-12 修回日期：2022-01-20）

（編輯：鄒麗娟）