EZH2、GLUT-1聯合DNA-ICM檢測在胸腔積液中鑒別良惡性間皮病變的價值

殷曉偉 楊玉柱 賈賀 徐雪房 黃政 許艷梅

胸水脫落細胞學鑒別惡性間皮瘤(Malignant mesothelioma， MM)與反應性間皮細胞增生(Reactive mesothelial hyperplasia， RMH)的難點在于形態上瘤細胞存在重疊，而侵犯鄰近組織等組織學特點在細胞學標本中無法觀察，此時增加細胞塊切片輔助免疫細胞化學染色可有效提高MM的診斷準確率，所以尋找一組可靠的免疫標記物尤為重要。隨著細胞DNA-ICM技術被廣泛應用，使腫瘤的研究提高到了定量分析水平[1]，近年來，因其特異性強且準確度高的優點，在宮頸癌及乳腺癌的臨床診斷中具有較高的應用價值[2-4]。已有學者提出DNA-ICM技術在惡性胸水的診斷中有較高的靈敏度[5]，可能為良惡性漿膜腔積液的鑒別提供一種新的診斷思路。本文分別探討免疫細胞化學技術及細胞DNA-ICM技術的診斷價值，進一步分析聯合應用對漿膜腔積液內MM的診斷價值。

資料與方法

一、研究對象

收集山東省單縣中心醫院2014年1月—2019年12月間經組織學證實的胸水病例共50例，其中MM 30例，男性12例，女性18例，年齡39～74例(中位年齡62歲)；RMH 20例，男性13例，女性7例，年齡45～77歲(中位年齡65歲)。所有病例均有組織病理證實診斷準確。

二、研究方法

將新鮮胸水制備細胞涂片兩張，一張室溫下瑞氏-吉姆薩染色在光學顯微鏡下分析，一張行改良Feulgen DNA染色，用于DNA定量掃描分析，其余標本離心后經全自動脫水機處理后，石蠟包埋制成做細胞塊用于免疫細胞化學檢測。

三、判定標準

免疫細胞化學聯合檢測判定標準：EZH2、GLUT-1任意一項檢測陽性即為陽性。

DNA倍體分析結果判定標準：系統將掃描細胞自動分類并計數，同時通過測定細胞核的積分光密度來判斷DNA的相對含量，DNA含量的大小描述為 DNA 指數( DNA index，DI)，正常細胞DI值為1，當DI>2. 5為異倍體細胞，且異常細胞數≥3個為陽性，DI≤2.5者為陰性[6]。

四、統計學方法

用SPSS 25.0統計軟件進行統計分析，計數資料以例數、百分比表示，比較采用卡方檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、免疫細胞化學檢測EZH2、GLUT-1在胸腔積液中的表達情況

EZH2陽性定位于細胞核，在30例MM中(見圖1A)陽性表達率為83%，20例RMH中(見圖1B)陽性表達率為25%，EZH2在MM與RMH中的表達差異有統計學意義(P<0.05)。GLUT-1陽性定位于細胞膜，在30例MM中(見圖2A)陽性表達率為70%，20例RMH中(見圖2B)無陽性表達，差異有統計學意義(P<0.05)(見表1)。

圖1 EZH2的表達情況 SP×200

圖2 GLUT-1的表達情況 SP×200

表1 免疫細胞化學檢測EZH2、GLUT-1在胸腔積液中的表達情況

二、EZH2和GLUT-1聯合檢測在胸水MM中的診斷價值

EZH2、GLUT-1對MM診斷的靈敏度分別為80%、70%，特異度分別為73%、72%，當EZH2、GLUT-1聯合檢測時，對MM診斷的靈敏度為93%，差異有統計學意義(P<0.05)，特異度為86%，差異有統計學意義(P<0.05)(見表2)。

表2 聯合檢測 EZH2、GLUT-1對胸腔積液內MM診斷的靈敏度和特異度

三、DNA定量分析結果

50例樣本，經活檢組織證實其中MM 30例，DNA掃描診斷27例，RMH 20例，經DNA掃描診斷16例，DNA倍體分析符合率和陽性檢出率分別為86%(43/50)、90%(27/30)(見圖3，4)。

圖3 一例惡性間皮瘤胸水標本DNA定量分析檢測

四、各種檢查方法靈敏度及特異度的比較

免疫細胞化學技術檢測EZH2及GLUT-1在MM診斷的靈敏度、特異度分別為93%，86%，DNA定量分析的靈敏度及特異度分別為90%、80%，聯合應用免疫細胞化學技術及DNA定量分析敏感度為97%，特異度為75%(見表3)。

表3 各種檢查方法靈敏度及特異度[n(%)]

討 論

漿膜腔積液是MM常見的首發癥狀，并且樣本的獲取相對安全，操作簡單易行，因此細胞學檢查對于MM的診斷具有無法取代的優勢。當病變的間皮性質明確時，MM與RMH的鑒別是病理醫師需要面臨的重大挑戰，雖然RMH是良性病變，但有時與MM的細胞學特征重疊，僅涂片和常規染色難以鑒別診斷[7-8]，因此尋找一種有效的生物標記物尤為重要。本課題前期實驗結果提示EZH2及GLUT-1抗體組合在組織病理中是區分MM與RMH的有效生物標志物[9]，故推測在漿膜腔積液細胞學診斷中亦具有一定的價值。

圖4 一例反應性間皮細胞增生性胸水標本DNA定量分析檢測

Zeste 基因增強子人類同源物2(Enhancer of zeste homolog ，EZH2)是人PcG基因家族中多梳抑制復合物2(PRC2)的核心組成成份，是近年在表觀遺傳領域發現的一種具有組蛋白甲基轉移酶活性的腫瘤相關蛋白，具有靶向催化組蛋白H3第27位賴氨酸(H3K27)甲基化的作用，參與細胞的周期調控、衰老和細胞分化并可沉默細胞分化相關基因參與腫瘤的發生[10-13]。早期研究表明，EZH2在MM組織中的表達明顯高于RMH，而EZH2的敲除，則抑制MM發生，Jiang等[14]研究漿膜腔積液中EZH2的表達情況，結果顯示惡性積液中陽性表達率為90%，而RMH為16%。 在我們的研究中 EZH2在30例MM中陽性表達率為83%，20例RMH中陽性表達率為25%，結果與Jiang等人的研究相符。葡萄糖轉運蛋白1(Glucose transporter protein 1，GLUT-1)是目前已知分布最為廣泛的葡萄糖轉運蛋白，主要介導細胞內外的跨膜轉運，對糖代謝的調節等功能起到關鍵作用[15]，與腫瘤的發生和發展密切相關，已有報道在多種上皮源性惡性腫瘤中均有 GLUT-1的過表達[16-17]。漿膜腔積液中的腫瘤細胞因無法依靠血管生成獲取氧及營養物質，此時腫瘤細胞在低氧狀態下主要通過糖酵解獲能，葡萄糖的攝取及代謝均處于增高狀態，細胞對其所處微環境的反應導致GLUT-1過表達。有研究[18]提出GLUT-1在胸水良惡性病變的鑒別上具有重要的應用價值。以往研究的關注點大部分集中在轉移性腺癌與RMH的鑒別，而針對MM與RMH的研究較少，本研究在病變明確為間皮來源的基礎上，利用免疫細胞化學技術檢測30例MM中GLUT-1陽性表達率為70%，而在20例RMH中均未見表達，由此可見，GLUT-1是一種在漿膜腔積液內鑒別良惡性間皮病變的重要腫瘤標志物。在最近的兩項間皮病變研究中，EZH2對MM診斷的敏感度為45%～66%，聯合BAP1和EZH2可將敏感度增加到74%～90%[8]。本實驗中，聯合EZH2和GLUT-1的敏感性為93%，大大提高了MM診斷的可靠性。

DNA是細胞生長、繁殖的基礎，正常人體細胞為二倍體，生理狀態下DNA結構及含量發生周期性變化[1]。當細胞惡變時，基因突變可導致染色體數目發生改變，從而形成非整倍體細胞。DNA含量的改變能較客觀地反應細胞的增生狀態，因此，若出現 DNA 含量異常增高或是處于增殖期的細胞數目異常增多，均可提示機體組織有惡性病變的可能[19]。目前，就DNA-ICM的臨床應用已經達成了國際共識。也有越來越多的臨床數據證實了DNA-ICM作為一種輔助方法適用于宮頸上皮內病變和浸潤癌的診斷和預后。同時有研究提出，DNA-ICM在判斷漿膜腔積液的良惡性質方面，具有一定臨床價值[20-22]。本實驗在經活檢組織證實的 30例MM及20例RMH的漿膜腔積液內檢測了細胞的DNA含量，經DNA掃描診斷符合率和陽性檢出率分別為86%(43/50)、90%(27/30)，均提示其在漿膜腔積液內良惡性間皮病變的鑒別中，有較高的使用價值。

雖然細胞塊聯合免疫細胞化學技術在漿膜腔積液的診斷中有肯定的臨床價值，但由于敏感性不高而出現一部分假陰性。而細胞 DNA 定量分析法可快速識別標本中少數癌變細胞，其診斷結果較常規方法更客觀。本研究運用脫落細胞學DNA定量分析檢測MM的靈敏度為90%，與免疫細胞化學技術相比無統計學意義(P>0.05)，但若兩者聯合使用則有較好的互補性，其敏感度達97%。可顯著提高漿膜腔積液內良惡性間皮病變鑒別診斷的準確性，具有很高的應用價值。