血清熱休克蛋白70自身抗體在乳腺癌中的診斷價(jià)值*

梁超文 練 標(biāo) 張銀仙 謝長樂

廣東省開平市中心醫(yī)院腫瘤外科 529300

近年來，全球乳腺癌發(fā)病率呈上升趨勢，是女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤[1]。另一方面，在西方國家的乳腺癌患者中，近年來出現(xiàn)了死亡率下降的情況，這主要是由于對(duì)于此類疾病的早期篩查與診斷得到了普及與技術(shù)上的發(fā)展[2]。所以對(duì)于乳腺癌的早期篩查與防治是十分必要的，同時(shí)這樣的措施也是有效提升乳腺癌患者生存率，提升患者保乳手術(shù)治療可能性的關(guān)鍵所在。目前用于乳腺癌的檢查方法，如乳房X光檢查和超聲等，用于早期乳腺癌篩查并不十分理想[2-4]。有研究數(shù)據(jù)指出，在早期腫瘤疾病的篩查過程中，對(duì)于患者的腫瘤相關(guān)抗原抗體進(jìn)行篩查能夠在一定程度上基于血清分子標(biāo)志物情況對(duì)于患者實(shí)際情況進(jìn)行了解。基于此，本次研究特運(yùn)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測血清Hsp70自身抗體在125例乳腺癌患者、33例乳腺良性腫瘤患者和127例健康體檢者中的水平，探討熱休克蛋白70(Hsp70)自身抗體在乳腺癌患者中的診斷意義，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集我院2019年4月—2021年3月125例乳腺癌和33例乳腺良性腫瘤患者血清標(biāo)本。本次研究中所有患者均未開展相應(yīng)的治療，且通過病理切片檢查確診為乳腺腫瘤患者，乳腺癌及乳腺良性腫瘤組患者均為女性，年齡40～72歲，平均年齡(51.2±14.2)歲；健康對(duì)照組患者均為女性，年齡40～72歲，平均年齡(51.3±14.1)歲；三組患者基線資料比較基本無差異(P>0.05)，同時(shí)患者對(duì)于本次研究知情且簽署同意書，研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)表決通過。患者均取其晨起外周靜脈血3ml進(jìn)行血清制取，并低溫保存。

1.2 儀器和檢測試劑 酶標(biāo)儀采用賽默飛世爾THERMO Multiskan FC，96孔酶標(biāo)板采用海門浩天生物有限公司出產(chǎn)，相關(guān)試劑均采購自舟山同生生物科技公司與廈門英科新創(chuàng)公司。

1.3 Hsp70自身抗體的檢測 對(duì)于患者血清中的Hsp70自身抗體采用酶聯(lián)免疫吸附法進(jìn)行檢測，于96孔酶標(biāo)板將Hsp70重組蛋白(PBS稀釋0.8μg/ml)進(jìn)行包被，保持溫度4℃過夜，次日將酶標(biāo)板孔內(nèi)液體棄去，采用PBST對(duì)于96孔酶標(biāo)板進(jìn)行洗板，次數(shù)為3次，隨后每孔加入200μl封閉液，封閉液主要成分為1%牛血清蛋白與PBST，37℃孵育1h；洗板，加入100μl 1∶110稀釋的乳腺癌患者、乳腺良性腫瘤患者、健康對(duì)照者血清樣品和質(zhì)控樣品(將50例乳腺癌患者的血清混合制成)，陰性對(duì)照為封閉液，陽性對(duì)照為兔抗p53多克隆抗體，所有檢測均做兩平行孔，37℃溫箱孵育1h；洗板，加入羊抗人或羊抗兔IgG-HRP(1∶10 000稀釋)，孵育1h(37℃)；洗板5次，每孔加入顯色液100μl(TMB-過氧化氫)，37℃避光顯色15min；加入終止液50μl，酶標(biāo)儀檢測各樣品的A值(即A450nm-A630nm)，即測定波長為450nm、校正波長為630nm。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 本次研究中采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，并采用GraphPad Prism進(jìn)行ROC數(shù)據(jù)的繪制，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血清Hsp70自身抗在乳腺癌患者中的水平 血清Hsp70自身抗體在乳腺癌組、乳腺良性腫瘤組和健康對(duì)照組中的OD值分別為0.110±0.078、0.077±0.048和0.061±0.037。乳腺癌組和乳腺良性腫瘤組血清Hsp70自身抗體水平高于健康對(duì)照組的水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-7.165，P<0.001；Z=-2.065，P=0.039)；更重要的是，與乳腺良性腫瘤組相比較，乳腺癌組血清Hsp70自身抗體的水平同樣顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-3.084，P=0.002)，見圖1。

圖1 血清Hsp70自身抗體的水平箱線圖

2.2 血清Hsp70自身抗體在乳腺癌中的診斷效能 根據(jù)ROC曲線分析(圖2)和約登指數(shù)，當(dāng)檢測乳腺癌患者血清Hsp70自身抗體的cutoff值為0.060時(shí)，區(qū)分健康體檢者的AUC值為0.761(95%置信區(qū)間：0.702～0.820)，敏感度為82.4%，特異度為62.2%；區(qū)分乳腺良性腫瘤患者的AUC值為0.675(95%置信區(qū)間：0.569～0.781)，敏感度為80.0%，特異度為45.5%；區(qū)分乳腺良性腫瘤患者與健康體檢者的AUC值為0.746(95%置信區(qū)間：0.690～0.802)，敏感度為84.8%，特異度為56.6%。

圖2 Hsp70自身抗體區(qū)分乳腺癌與不同對(duì)照組的ROC曲線

3 討論

目前，臨床上常用的乳腺癌相關(guān)血清腫瘤標(biāo)志物癌胚抗原和CAl53等，對(duì)于監(jiān)測復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移和療效評(píng)估具有很好的價(jià)值，然而，在早期乳腺癌患者，這些標(biāo)志物的診斷敏感度低，只有在晚期乳腺癌才具有較高的敏感性。近年來大量研究表明，相對(duì)于正常人，在腫瘤的早期階段，患者血清中針對(duì)腫瘤相關(guān)抗原的自身抗體水平就顯著升高[5-8]，提示自身抗體在惡性腫瘤早期診斷具有潛在應(yīng)用價(jià)值。更重要的是，EarlyCDT-lung是一項(xiàng)聯(lián)合檢測7種自身抗體標(biāo)志物的血液檢查，已經(jīng)在臨床上證實(shí)有助于早期發(fā)現(xiàn)無癥狀的肺癌患者，而且EarlyCDT-lung的關(guān)鍵優(yōu)勢在于能夠比“CT(標(biāo)準(zhǔn)診斷影像學(xué)檢查)”更早地幫助鑒定肺癌風(fēng)險(xiǎn)，具有更高特異性[8]。在乳腺癌方面，研究已表明在乳腺癌患者診斷5年前的無癥狀階段自身抗體就呈現(xiàn)陽性結(jié)果[9]。有國外研究發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照者相比，ZRF自身抗體和KRR1自身抗體在早期乳腺癌患者血清中的水平均顯著升高[8]。這些研究提示，腫瘤自身抗體在乳腺癌患者血清中是存在的，有潛力作為一種有效的乳腺癌早期診斷方法。

熱休克蛋白(Heat shock proteins，HSPs)是一組廣泛存在于生物體內(nèi)、高度保守的應(yīng)激蛋白。作為分子伴侶，在細(xì)胞內(nèi)主要參與蛋白質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、裝配分選解等過程，并且在創(chuàng)傷、感染和惡性腫瘤等應(yīng)激狀態(tài)下被誘導(dǎo)表達(dá)[9]。Hsp70作為熱休克蛋白家族的一員，已被證實(shí)在多種腫瘤中高表達(dá)，并在腫瘤的發(fā)生發(fā)展、預(yù)后和腫瘤免疫等發(fā)揮重要作用[10-11]。研究表明，針對(duì)腫瘤相關(guān)抗原的自身抗體的產(chǎn)生和腫瘤相關(guān)抗原本身的突變和過表達(dá)等密切相關(guān)[12]。崔曉梅等[13]的研究表明，Hsp70在乳腺癌組織細(xì)胞中高表達(dá)。Yang等學(xué)者[14]的研究證實(shí)了Hsp70自身抗體在乳腺癌患者的水平高于健康對(duì)照者，而且聯(lián)合包括Hsp70自身抗體在內(nèi)的5種自身抗體組合，對(duì)乳腺癌的診斷敏感度和特異度達(dá)到了82.7%和100.0%。在本研究中，相對(duì)于健康體檢者與乳腺良性腫瘤患者，血清Hsp70自身抗體在乳腺癌患者中的水平顯著升高，表明Hsp70自身抗體可以區(qū)分乳腺癌患者和健康者，更重要的是，Hsp70自身抗體有助于區(qū)分乳腺良惡性腫瘤。另一方面，本研究結(jié)果表明，Hsp70自身抗體對(duì)于乳腺癌具有較好的敏感度(80%以上)，有利于將Hsp70自身抗體作為一種乳腺癌的篩查工具以幫助發(fā)現(xiàn)更多無癥狀乳腺癌患者，然而，其特異度相對(duì)較差，診斷鑒定乳腺癌患者仍需借助影像學(xué)技術(shù)和病理檢查。

綜上所述，Hsp70自身抗體與乳腺癌患者存在相關(guān)性，可以幫助區(qū)分乳腺良惡性腫瘤，是篩查乳腺癌一種潛在的血清分子標(biāo)志物。但本研究的樣本量較小，而且未能統(tǒng)計(jì)分析納入本研究的乳腺癌患者臨床病理資料，因此，未來仍需要通過大樣本的早期乳腺癌患者對(duì)Hsp70自身抗體進(jìn)行診斷效能驗(yàn)證。