乙酰水楊酸-異煙肼的包合工藝優(yōu)化與抗菌活性測試

方世通，祝 宏，金學(xué)平，丁 嬌，馬 峻，王艷武，劉 慧*

1.武漢工程大學(xué)化工與制藥學(xué)院，湖北 武漢 430205；2.武漢市藥物增溶工程技術(shù)研究中心（武漢軟件工程職業(yè)學(xué)院），湖北 武漢 430205；3.武漢市金銀潭醫(yī)院，湖北 武漢 430023

結(jié)核病（tuberculosis，TB）是由結(jié)核分枝桿菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）感染引起的，近年帶有多重耐藥性的結(jié)核桿菌（multidrug resistance-mycobacterium tuberculosis，MDR-MTB）日益增加［1］，其驚人增長加劇了其全球流行。MDR-MTB的高發(fā)病率可能極大地阻礙當前的結(jié)核病治療，導(dǎo)致更高的失敗率、更長的治療時間和更復(fù)雜的藥物方案。目前，結(jié)核病的化療包括幾種治療方案，MDR-MTB的治療可延長至2年［2］。一般結(jié)核病治療通常使用的抗生素有利福平、異煙肼［3］、吡嗪酰胺、乙酰水楊酸［4］和乙胺丁醇［5］。但隨著抗生素的濫用，以及耐藥性的日益增強，為了對抗耐藥性，除了其他藥物取代，還可以將不同藥物雜合在一起，比如將異煙肼和乙酰水楊酸通過一些簡單的烷烴鏈等共價鍵連接起來，得到乙酰水楊酸-異煙肼雜合藥物［6］，期望改善單一作用靶點的異煙肼和乙酰水楊酸藥物分子的耐藥性［7］。

并且，為了方便臨床用藥，提高藥物制劑的靶向性，選擇用包合的方式，將所得藥物分子利用糖類材料包合保護起來，其中，糖類材料選擇了β-環(huán)糊精和殼聚糖。

β-環(huán)糊精是由7個吡喃葡萄糖分子組成環(huán)狀結(jié)構(gòu)的環(huán)狀低聚糖，這些亞基通過1，4糖苷鍵連接。環(huán)糊精具有環(huán)形形狀，環(huán)形的較大和較小的開口分別暴露于溶劑仲羥基和伯羥基。由于這種排列，環(huán)的內(nèi)部不是疏水性的，但比水性環(huán)境親水性要低得多，因此能夠容納其他疏水性分子。相反，外部足夠親水以賦予環(huán)糊精（或其復(fù)合物）水溶性。它們不溶于典型的有機溶劑。具有疏水性分子的環(huán)糊精包合物能夠穿透人體組織，這些可用于在特定條件下釋放生物活性化合物，有著廣泛的應(yīng)用［8-10］。

殼聚糖（chitosan）是直鏈多糖隨機分布的β-（1→4）-linked-D-glucosamine（脫乙酰單元）和Nacetyl-D-glucosamine（乙酰化單元）。殼聚糖可用于幫助通過皮膚輸送藥物，殼聚糖能增強極性藥物跨上皮表面的轉(zhuǎn)運，且具生物相容性和可生物降解性［11］，以及可能存在的疊加抗菌作用［12］。

本文通過使用β-環(huán)糊精、殼聚糖來包合抗結(jié)核雜合藥物乙酰水楊酸-異煙肼（acetylsalicylic acid-isoniazid，ASA-INH），結(jié)構(gòu)式如圖1所示，得到對應(yīng)的ASA-INH-β-環(huán)糊精包合物、ASA-INH-殼聚糖包合物，通過實驗得出包合的最優(yōu)工藝，并且對該包合物進行了表征實驗，以及檢測包合物對結(jié)核桿菌的抗菌活性。

圖1 ASA-INH結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structure of ASA-INH

1 實驗部分

1.1 材料、試劑與儀器

實驗過程中所用到的主要原料、試劑有：ASA-INH（實驗室自制）、乙酰水楊酸（麥克林試劑，acetylsalicylic acid，ASA）、異煙肼（天津市博迪化工有限公司，isoniazid，INH）、殼聚糖（麥克林試劑）、無水乙醇（天津市富宇精細化工有限公司）、冰醋酸（國藥集團化學(xué)試劑有限公司）、β-環(huán)糊精（武漢遠成共創(chuàng)科技有限公司）、DMSO（國藥集團化學(xué)試劑有限公司）、Tween-80（國藥集團化學(xué)試劑有限公司）、氯化鈉（福晨化學(xué)試劑有限公司）、樹脂天青（麥克林試劑）、7H9培養(yǎng)基（武漢市金銀潭醫(yī)院）。

實驗過程中所用到的主要儀器有：數(shù)顯磁力控溫攪拌器（鞏義予華儀器有限公司）；Nicolet 5700型傅里葉紅外光譜儀（美國尼高力儀器公司）；SII DSC 6220差示掃描量熱儀（日本精工株式會社）；WFZ-26A紫外可見分光光度計（武漢圣利興科技有限公司）。

1.2 乙酰水楊酸-異煙肼包合物的制備

1.2.1 飽和水溶液法制備乙酰水楊酸-異煙肼-β-環(huán)糊精包合物 稱取0.3 g ASA-INH，加入5 mL無水乙醇，使其溶解，滴入β-環(huán)糊精飽和溶液中，該飽和溶液用1.0 gβ-環(huán)糊精制備，攪拌30 min后，在0～4℃中冷藏24 h，抽濾，用少量無水乙醇去洗滌未被包合的ASA-INH，剩余物經(jīng)過真空干燥，即得ASA-INH-β-環(huán)糊精包合物。

1.2.2 冷凍干燥法制備乙酰水楊酸-異煙肼-殼聚糖包合物 稱取1.0 g的ASA-INH，用0.1 mol/L的冰醋酸溶液將其溶解，再稱取1.0 g的殼聚糖，同樣將其用0.1 mol/L的冰醋酸溶液溶解，將乙酰水楊酸-異煙肼的冰醋酸溶液緩慢滴入殼聚糖的冰醋酸溶液，攪拌30 min后，在0～4℃中冷藏過夜，隨后進行冷凍干燥，用少量的無水乙醇，將冷凍干燥后的樣品中未被包合的ASA-INH洗去，抽濾，濾餅經(jīng)真空干燥即得ASA-INH-殼聚糖包合物。

1.2.3 包合物中乙酰水楊酸-異煙肼的含量測定

包合物的包合率、收率分別根據(jù)下式進行計算：

因此，還需要得到包合物中ASA-INH的含量，該含量可利用紫外分光光度法進行測定。

先配制并量取適量質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL ASA-INH的乙醇溶液，在200～500 nm的波長范圍內(nèi)進行紫外掃描，最終結(jié)果如圖2所示，顯示ASA-INH最大吸收出現(xiàn)在236 nm。

圖2 ASA-INH紫外光譜掃描圖Fig.2 Ultraviolet spectrum of ASA-INH

以無水乙醇為空白，并用無水乙醇配置0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mg/mL梯 度 質(zhì) 量 濃 度 的ASA-INH的標準溶液。于236 nm處測定其紫外吸光度值（A）。

以質(zhì)量濃度（ρ）對吸光度值（A）進行回歸，如圖3所示作圖，得到回歸方程：A=11.87ρ+0.003 7（R2=0.999 3）。

圖3 ASA-INH紫外標準曲線圖Fig.3 Ultraviolet standard curve of ASA-INH

同樣以無水乙醇為空白對照，將ASA-INH的包合物用無水乙醇配成質(zhì)量濃度分別為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mg/mL的待測樣品，于236 nm處測定其紫外吸光度值，將吸光度值代入ASAINH紫外標準曲線的回歸方程中，計算得到包合物中ASA-INH的含量。

1.2.4 均勻?qū)嶒瀮?yōu)化工藝 對同一種材料，同一種制備方式，影響包合常數(shù)的因素主要有3種：客分子和主分子的投料比、包合時間、包合溫度。

飽和水溶液法制備ASA-INH-β-環(huán)糊精包合物，為得到較好的包合率和收率，選擇利用均勻設(shè)計進行條件篩選，通過對各物質(zhì)穩(wěn)定性等性質(zhì)的考察，最終設(shè)置客分子和主分子的投料摩爾比范圍在0.5～1.5之間（間隔為0.25），包合時間在0.5～2.5 h之間（間隔設(shè)為0.5 h），溫度范圍在30～70℃之間（間隔設(shè)為10℃）。因素水平表見表1，均勻設(shè)計試驗表見表2。

表1 因素水平Tab.1 Level of factors

表2 均勻?qū)嶒炘O(shè)計表Tab.2 Uniform experimental design on U 5（53）

冷凍干燥法制備ASA-INH-殼聚糖包合物，設(shè)置客分子和主分子的投料質(zhì)量比范圍在1～240之間，包合時間在0.5～2.5 h之間（間隔設(shè)為0.5 h），溫度范圍30～70℃之間（間隔設(shè)為10℃）。因素水平表見表3，均勻設(shè)計實驗安排表同表2。

表3 因素水平Tab.3 Level of factors

2 結(jié)果與討論

2.1 乙酰水楊酸-異煙肼包合物制備工藝條件的優(yōu)化

以綜合評價（綜合評價=包合率×0.7+收率×0.3）為指標，表4為飽和水溶液法均勻?qū)嶒灲Y(jié)果采用“IBM SPSSStatistics”軟件，通過綜合評價（E1）、客分子和主分子的投料摩爾比（X1）、包合時間（Y1）、包合溫度（Z1），對結(jié)果進行回歸分析，得回歸方程為E1=66.343+0.397Z1-0.123X1Z1+0.06Z1Y1。

表4 飽和水溶液法均勻?qū)嶒灲Y(jié)果Tab.4 Results of uniform experimental design for saturated aqueous solution method

利用Excel軟件的編程解，分析處理該回歸方程得最優(yōu)工藝條件：ASA-INH與β-環(huán)糊精摩爾比為0.5∶1，包合溫度為70℃，包合時間為2.5 h，綜合評價（E1）經(jīng)回歸方程計算得90.9%。

同樣以綜合評價為指標，表5為冷凍干燥法均勻?qū)嶒炘O(shè)計結(jié)果。

表5 冷凍干燥法均勻?qū)嶒灲Y(jié)果Tab.5 Results of uniform experimental design for freeze-drying method

采取同樣的數(shù)據(jù)分析處理方法，得回歸方程為E2=67.902-0.036X2+0.02Z22+0.023Z2Y2，以 及 最優(yōu)工藝條件：ASA-INH與殼聚糖質(zhì)量比為1∶1，包合溫度為70℃，包合時間為2 h，綜合評價（E2）經(jīng)回歸方程計算得81.6%。

2.2 包合物的表征結(jié)果

2.2.1 紅外光譜法 比較圖4中的b與c、e與f可知，2種包合物的紅外譜圖雙鍵區(qū)和指紋區(qū)的吸收峰明顯少于2種物理混合物，并且于1 675 cm-1的C=O的伸縮振動吸收峰在兩種包合物的紅外譜圖中消失，這是因為發(fā)生了掩蔽作用，該作用產(chǎn)生的原因可能是ASA-INH分子進入β-環(huán)糊精空腔內(nèi)，并且殼聚糖和ASA-INH存在分子間作用力，這證明有ASA-INH-β-環(huán)糊精包合物、ASA-INH-殼聚糖包合物生成［13］。

圖4 紅外光譜掃描圖：（a）β-環(huán)糊精，（b）ASA-INH-β-環(huán)糊精包合物，（c）ASA-INH與β-環(huán)糊精的物理混合物，（d）殼聚糖，（e）ASA-INH-殼聚糖包合物，（f）ASA-INH與殼聚糖物理混合物Fig.4 Infrared spectrum scan：（a）β-cyclodextrin，（b）ASA-INH-β-cyclodextrin inclusion compound，（c）physical mixture of ASA-INH andβ-cyclodextrin，（d）chitosan，（e）ASA-INH-chitosan inclusion compound，（f）physical mixture of ASA-INH and chitosan

2.2.2 差示掃描量熱法 用空白鋁箔盒為對照，在0～300℃的溫度范圍內(nèi)，掃描速度為20℃/min，得到了ASA-INH、β-環(huán)糊精、ASA-INH-β-環(huán)糊精包合物、ASA-INH和β-環(huán)糊精物理混合物的吸熱峰（圖5），以及ASA-INH、殼聚糖、ASA-INH-殼聚糖包合物、ASA-INH和殼聚糖物理混合物的吸熱峰（圖6）。

圖5 樣品DSC熱譜圖Fig.5 DSCthermograms of samples

圖6 樣品DSC熱譜圖Fig.6 DSC thermograms of samples

由圖5和圖6可知，ASA-INH在183℃有一吸熱峰，應(yīng)該是其熔點，而2種包合物DSC曲線中并無該峰，并且β-環(huán)糊精、ASA-INH-β-環(huán)糊精包合物均在118℃處出現(xiàn)吸熱峰，殼聚糖、ASA-INH-殼聚糖包合物均在115℃左右處出現(xiàn)吸熱峰，證明ASA-INH和β-環(huán)糊精、ASA-INH和殼聚糖均已形成包合物［14］，再看到2種物理混合物的DSC曲線中，發(fā)現(xiàn)有2個吸熱峰，包括原料雜合物的熔點峰，表明該混合物只是簡單的混合，并無新物質(zhì)生成。

2.3 包合物抗菌活性測試

2.3.1 主要試劑配制 分別稱ASA、INH、ASAINH、ASA-INH-β-環(huán)糊精包合物、ASA-INH-殼聚糖包合物各50 mg，分別用去離子水定容于50 mL的容量瓶中，配成質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的溶液，其中，實驗最大質(zhì)量濃度設(shè)為0.5 mg/mL，并以此往下做對倍稀釋。

2.3.2 實驗方法 微孔顯色法，采用盲法編排測試程序。

2.3.3 實驗結(jié)果分析 以結(jié)核分枝桿菌H37Rv株為標本，通過氧化還原指示劑顯色法檢測結(jié)核分支桿菌的耐藥性，藥物的敏感性可由指示劑的顏色變化得到［15］。以不加藥物的培養(yǎng)基為對照組，紅色表示耐藥（R），藍色表示敏感（S）。培養(yǎng)基的顯色情況可以反映出不同藥物對H37RV生長的影響，藥物的最小抑菌濃度（minimal inhibit concentration，MIC）是培養(yǎng)基顯藍色最低濃度［16］。

根據(jù)表6的初步活性數(shù)據(jù)顯示，相對于原料ASA和INH而言，ASA-INH的抗菌最低濃度更低，表明其抗菌活性增強。

表6 藥物抗菌活性Tab.6 Antibacterial activities of drugs

本實驗選擇的雜合物和制備的2種包合物對標準菌株H37RV的MIC值相同，并且發(fā)現(xiàn)β-環(huán)糊精包合的藥物比殼聚糖包合的藥物具有更強的抗耐藥性和殺菌活性，推測可能是由于載體的親水性，因此可以限制MarR介導(dǎo)的雜合物外排，從而消除MarR影響，以減少耐藥性對其的影響，對于使用殼聚糖包合的，還可能存在一部分的疊加抗菌效應(yīng)［12］。

3 結(jié) 論

本文基于β-環(huán)糊精和殼聚糖為包合物載體，采用飽和水溶液法制備ASA-INH-β-環(huán)糊精包合物，冷凍干燥法制備ASA-INH-殼聚糖包合物。通過均勻設(shè)計，結(jié)果表明，ASA-INH與β-環(huán)糊精的最佳包合工藝條件為：ASA-INH與β-環(huán)糊精摩爾比為0.5∶1、包合溫度70℃、包合時間2.5 h，綜合評價為90.9%。ASA-INH與殼聚糖的最佳包合工藝條件為：ASA-INH與殼聚糖物質(zhì)的量比1∶1、包合溫度70℃、包合時間2 h，綜合評價為81.6%。經(jīng)抗菌活性測試，ASA-INH-β-環(huán)糊精包合物、ASA-INH-殼聚糖包合物的活性比乙酰水楊酸、異煙肼及乙酰水楊酸-異煙肼都有著更低的MIC，并且發(fā)現(xiàn)ASA-INH-β-環(huán)糊精有著最低的MIC（≤0.052μmol/mL），值得進一步開發(fā)。