納豆激酶高產菌株的復合誘變選育

楊子瓊，李迪文，趙小斌，劉登輝，張佑紅

武漢工程大學環境生態與生物工程學院，湖北 武漢 430205

納豆激酶（nattokinase，NK）是一種由發酵納豆中提取的堿性絲氨酸蛋白酶，具有溶栓活性，主要是由納豆芽孢桿菌產生的［1-2］，可以通過直接溶栓和間接溶栓多種途徑對血栓進行降解［3-6］。與鏈激酶、尿激酶、t-PA等傳統的溶栓藥物相比，納豆激酶具有明顯的優勢，在血栓性疾病治療中表現溶栓作用效果顯著、體內半衰期長、可口服使用、安全性高等優點，在開發成新型預防或治療血栓性疾病藥物具有潛力，對臨床治療血栓性疾病有很高的應用價值［7-9］。

在發酵工業中，優良菌種的選育對發酵產物產量是至關重要的。微生物的誘變育種是菌株選育的主要手段，其優點在于操作簡便、方法簡單以及效果明顯等［10］。Mohana等［11］從土壤異質性微生物種群中分離和篩選出產納豆激酶的SFN芽孢桿菌，并對其進行了紫外線（ultraviolet light，UV）突變，結果表明紫外線照射是一種有效的誘變劑，可用于改進芽孢桿菌的菌株及增強納豆激酶活性。甲基磺酸乙酯（ethyl methane sulfonate，EMS）作為磺酸脂類烷基化合物，是一種可以使堿基烷基化影響mRNA轉錄從而導致蛋白質重組的化學誘變劑。楊珠英等［12］使用EMS對竹黃菌懸浮孢子進行誘變處理，篩選得到高產竹紅菌甲素菌株10-5，比出發菌株提高46.4%。在用于誘變育種的LiCl、MnSO4等金屬鹽類中，LiCl常用作助誘劑，因為單一使用LiCl時誘變效果并不明顯，但與其他類誘變劑相結合對菌種進行處理時誘變效果顯著［13-14］。盧利娜等［15］以紫外線和LiCl復合誘變篩選到枯草芽孢桿菌BL01，獲得高產α-淀粉酶突變菌株BL01-13，比出發菌株提高了202%。本研究將結合紫外線、EMS及篩選培養中添加LiCl對高產納豆激酶菌種進行復合誘變選育。

1 實驗部分

1.1 材料與培養基

1.1.1 菌種來源 前期實驗室從購買的納豆食品中篩選出，鑒定并編號為枯草芽孢桿菌XD2［16］。

1.1.2 培養基

初篩培養基：干酪素5 g/L，葡萄糖1 g/L，酵母粉1 g/L，K2HPO41 g/L，KH2PO40.5 g/L，MgSO40.1 g/L，LiCl 15 g/L，瓊脂粉20 g/L，pH為7.0～7.2。

種子培養基：胰蛋白胨10 g/L，酵母浸粉5 g/L，NaCl 10 g/L，pH為7.2～7.4。

發酵培養基：葡萄糖10 g/L，蛋白胨20 g/L，NaH2PO4·2H2O 1 g/L，Na2HPO4·12H2O 2 g/L，MgSO40.5 g/L，CaCl20.2 g/L，pH為7.0～7.2。

1.2 實驗方法

1.2.1 出發菌株的生長曲線測定 將保存在LB固體平板培養基上的出發菌株XD2，接入種子培養基中振蕩培養（160 r/min、37℃恒溫），計時，定時取菌液1 mL，測定其吸光度OD600，繪制出發菌株XD2的生長曲線。

1.2.2 菌懸液的制備 將出發菌株XD2接種到液體種子培養基，然后將其搖瓶培養至對數生長期，取菌液離心，去上清，菌體用無菌生理鹽水進行多次沖洗后稀釋，制備成菌體細胞均一的出發菌株XD2懸浮液。

1.2.3 菌株的誘變 （1）EMS誘變：取8 mL稀釋后的菌懸液，加入2 mL 0.5 mol/L的EMS溶液，EMS處理分別處理0、10、20、30、40、50、60 min（加入等量生理鹽水為對照），加入適量質量分數2%的Na2S2O3溶液終止誘變，然后靜置，離心、去除上清液。用無菌生理鹽水將收集的菌體重復洗滌后，分別將不同EMS處理時間的菌懸液進行梯度稀釋，確定最佳稀釋梯度后，取0.1 mL菌懸液涂布在LB固體培養基平板上培養過夜，并對菌落個數進行統計，計算致死率。

致死率=（對照組菌落-EMS處理后菌落）/對照組菌落×100%。

（2）紫外線誘變：取10 mL菌懸液和無菌磁力轉子放入無菌培養皿中，再放在磁力攪拌器上。在黑暗條件下，使用18 W紫外燈對菌液分別照射0（對照）、30、60、90、120、150、180、210 s，期間保持攪拌使菌液均勻照射，照射完后低溫保存2 h，防止光修復。用無菌生理鹽水清洗菌體并稀釋后，取0.1 mL菌液涂布于LB固體培養基上培養，細數菌落計算其致死率。

致死率=（對照組菌落-紫外照射后菌落）／對照組菌落×100%。

閉環控制中存在著無功優化與電壓校正兩個模塊，控制流程如圖1所示，優化與校正的關系如下：①用優化算法可以進行電壓校正，但失敗情況較多，計算速度較慢，而且動作設備是全網的控制變量，這樣從控制的經濟性考慮和調度經驗考慮都是不可行的。②將優化與校正分離，在電壓正常時對全網進行優化，考慮降損并實現逆調壓，由于優化實現了逆調壓，可以盡量保證電壓不越限。③在有電壓越限的情況下，啟動校正。校正算法在控制區內根據靈敏度選擇控制變量進行校正，只需動作幾個對越限點影響最大的幾個設備，使用基于最小二乘理論的直接校正算法只需幾秒鐘[5]。

（3）復合誘變：取出發菌株XD2的菌懸液用EMS處理最佳誘變時間，處理后加入適量Na2S2O3溶液終止反應，離心保留菌體，再用無菌生理鹽水沖洗。然后將經EMS誘變處理后的菌液轉到無菌培養皿中，用18 W紫外燈照射最佳誘變時間。照射完后，將誘變過的菌液適當稀釋后，涂布于在含有質量分數1.5%的LiCl作為助誘變劑的初篩培養基上。

1.2.4 菌種的篩選 （1）誘變菌株的初篩：將涂布后的初篩培養基在黑暗條件下37℃恒溫培養1 d，觀察平板狀況，發現長出菌落并表現出生長狀態良好后，取飽和硫酸銨溶液滴加在平板上，未分解的干酪素會與飽和硫酸銨溶液反應生成白色沉淀，根據此反應可以觀察平板上產生的透明圈，分別測量菌落直徑（C，mm）以及菌落產酶形成的透明圈直徑（H，mm），并計算透明圈直徑與菌落直徑的比值（H/C值），用來判斷菌株產生的蛋白酶水解蛋白能力的強弱。根據H/C值大小挑選突變菌株進行劃線培養獲得純化菌株進行保存。

（2）誘變菌株的復篩：將上述初篩后篩選出的誘變菌株菌落，經種子培養基培養，然后接種到基礎發酵培養基中培養。各取發酵液1 mL離心，上清液即為粗酶液。取10μL的上清液滴加在瓊脂糖-纖維蛋白平板孔板上在37℃下反應18 h，用數顯游標卡尺測量透明圈的直徑，與出發菌株XD2的透明圈直徑對比，挑選出透明圈直徑較大的菌株進行保存。

1.2.5 菌種遺傳穩定性 對復篩的6株突變菌株進行傳代培養，每隔24 h劃線于固體培養基上傳一代，連續傳代5代，每代接種到發酵培養基中搖瓶發酵48 h。再取10μL發酵上清液點在瓊脂糖-纖維蛋白平板上，測量透明圈的平均直徑大小，檢測其傳代穩定性。

1.2.6 納豆激酶的酶活力測定 納豆激酶酶活力的測定采用的是瓊脂糖-纖維蛋白平板法。稱取瓊脂糖粉末與纖維蛋白原標準品分別用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）配制成10 mg/mL瓊脂糖緩沖溶液和2.5 mg/mL纖維蛋白原緩沖溶液，瓊脂糖加熱煮沸溶解，待其冷卻至45℃，取10 mL瓊脂糖緩沖液與5 mL纖維蛋白原緩沖溶液混合均勻，再加入0.1 mL凝血酶溶液（100 IU/mL），快速倒入干凈的培養皿中，在水平桌面上室溫靜置，待其冷卻充分凝固為乳白色后打孔備用。取10μL離心后的發酵上清液點在瓊脂糖-纖維蛋白平板孔板上，37℃反應18 h，用數顯游標卡尺測量透明圈的直徑。

1.2.7 尿激酶標準曲線的繪制 將尿激酶標準品用無菌生理鹽水分別稀釋成50、100、200、400、600、800、1 000 IU/mL的單位濃度梯度，各取10μL加入瓊脂糖-纖維蛋白平板的小孔中，在37℃反應18 h，測量透明圈垂直直徑（mm），并以垂直直徑乘積表示為透明圈的面積S（cm2）。以溶解纖維蛋白的透明圈面積的常數對數lg S為橫坐標，以尿激酶酶活力的常數對數lg A為縱坐標，繪制尿激酶標準曲線，得到回歸方程。

1.2.8 出發菌株與高產突變菌株的發酵產酶對比將出發菌株和高產突變菌株在相同的搖瓶發酵條件下，定時取樣測定菌液的光密度（optical density，OD600）和納豆激酶酶活力大小進行比較。

2 結果與討論

2.1 出發菌株的生長曲線繪制

如圖1所示，出發菌株XD2的生長周期主要分為4個階段，從接種開始到3 h，菌體適應生長環境，生長緩慢處于延滯期；從3 h開始，出發菌株XD2快速繁殖，進入對數生長期，菌體以幾何倍數增長。12 h后，菌體濃度無明顯增長，細胞分裂與死亡達到平衡，生長進入穩定期；培養24 h后，菌體濃度開始下降，培養環境的營養物質耗盡無法提供菌體生長。為制備出發菌株XD2的菌懸液，需要確定菌體處于生長對數期，此階段菌株正好處于遺傳物質為染色質狀態，細菌的遺傳物質結構更容易改變，并且此時各菌體細胞生長平衡、成分均勻，更有利于突變穩定性。因此確定取培養至12 h時的菌液制備出發菌株的菌懸液。

圖1 出發菌株XD2的生長曲線Fig.1 Growth curve of original strain XD2

2.2 誘變劑處理時間對菌種致死率的影響

通常菌體死亡率在85%～90%之間時較容易獲得正向突變菌株。如圖2（a）所示，在0.1 mol/L EMS濃度作用下，在0～60 min內，致死率隨EMS處理時間的增加，菌株的死亡率逐漸上升。到50 min時，菌體致死率到達（97.67±0.92）%，幾乎全部死亡。所以為了獲得較好的菌株誘變結果，選擇0.1 mol/L EMS處理40 min為最佳處理時間，此時致死率為（85.82±2.17）%。如圖2（b）所示，紫外的照射時間從30 s延長到120 s時，出發菌株XD2的死亡率由（11.39±1.15）%增長到（85.53±1.69）%；當照射時間達到210 s左右時，致死率可以達到（99.90±0.17）%，意味著此時菌體被殺死幾乎沒有存活。因此確定在紫外照射時間為120 s，此時致死率為（85.53±1.69）%。

圖2 不同誘變劑處理時間對菌體致死率的影響：（a）EMS處理，（b）紫外照射Fig.2 Effect of treatment time with different mutagens on fatality rate of bacteria：（a）EMSprocessing，（b）UV irradiation

2.3 突變菌株的篩選

2.3.1 突變菌株的初篩結果 經過甲基磺酸乙酯和紫外線復合誘變篩選后，從篩選培養基平板中篩選得到H/C值較高的12株突變菌株，其編號分別為YB1-YB6、YC1-YC6，具體的初篩結果如表1所示。

表1 復合誘變菌株的初篩結果Tab.1 Preliminary screening results of compound mutagenic strain

2.3.2 突變菌株的復篩結果 通過搖瓶發酵，復篩結果如表2所示，與出發菌株XD2相比，6株突變菌株在瓊脂糖-纖維蛋白原平板上的透明圈直徑均增加，說明6株突變菌株的納豆激酶酶活力均有不同程度提升。其中編號突變菌株YB5的透明圈直徑最大達到（30.32±0.13）mm，而H/C值最大的菌株YC4的透明圈直徑為（29.11±0.17）mm，小于菌株YB5和菌株YC2，說明H/C值只能相對表現出菌株的產蛋白水解酶的能力。

表2 復合誘變菌株的復篩結果Tab.2 Re-screening results of compound mutagenic strain

2.4 突變菌株的遺傳穩定性試驗結果

復篩得到的6株突變菌株的傳代試驗結果如圖3所示，經5次傳代后，其中突變菌株YB5、YC2、YC5的透明圈直徑隨著傳代代數增加逐漸減小，說明這3株突變菌株遺傳穩定性差，產酶性能逐漸衰退；突變菌株YB2、YC4、YC6經5次傳代透明圈直徑大小趨于穩定；其中菌株YC4的透明圈大小穩定在（29.46±0.09）mm，是6株突變菌株中產納豆激酶表現最好且遺傳穩定性。根據遺傳穩定性試驗結果確定突變株YC4作為供試株進行后續試驗。

圖3 突變菌株傳代穩定性Fig.3 Subpassage stability of mutant strain

2.5 尿激酶標準曲線

如圖4所示，尿激酶標準曲線的線性回歸方程為y=4.381 8x-0.162 64，R2=0.992，說明瓊脂糖-纖維蛋白平板上的透明圈面積的常數對數lg S與尿激酶酶活力的常數對數lg A成良好線性關系。

圖4 尿激酶標準曲線Fig.4 Standard curve of urokinase

納豆激酶的酶活力X=A×D，其中A為通過回歸方程計算的粗酶液中相對尿激酶酶活，單位IU/mL；D為粗酶液的稀釋倍數，由于透明圈直徑大小在0～24 mm之間的lg S與lg A才有線性關系，超過此范圍需要對發酵上清液進行稀釋后再上樣測定酶活。

2.6 原始菌株與高產突變菌株的發酵產酶比較

如圖5所示，突變菌株YC4與原始菌株XD2的生長趨勢相似，而突變菌株YC4的納豆激酶酶活力明顯高于原始菌株。在0～12 h階段，兩個菌株均快速生長繁殖，且此階段產酶水平都很低；12 h后隨著菌體的生長進入穩定期，此時兩菌株均逐漸開始產酶；18 h開始，原始菌株與突變菌株產酶速度迅速增長；24 h后菌體濃度開始下降進入衰亡期，兩個菌株的產酶水平持續增長；至48 h時，兩種菌株的納豆激酶酶活力均達到高峰，此時原始菌株發酵的納豆激酶酶活力為（3 494.31±149.45）IU/mL，而突變菌株的納豆激酶活力為（8 450.55±237.40）IU/mL，是原始菌株的2.42倍；發酵48～72 h間，兩株菌株的納豆激酶酶活力均無明顯變化。

圖5 原始菌株XD2與突變菌株YC4的發酵產酶比較Fig.5 Comparison of fermentation enzymes between original strain XD2 and mutant strain YC4

3 結 論

以前期實驗室篩選并保存的納豆枯草芽孢桿菌XD2為出發菌株，對其進行EMS誘變試驗和紫外誘變實驗，確定了誘變條件為使用濃度為0.1 mol/L的EMS處理最佳時間為40 min，紫外線最佳照射時間為120 s。通過添加LiCl的初篩培養基篩選到12株蛋白酶的酶解能力較高的菌株，分別編號為YB1-YB6、YC1-YC6。進一步通過搖瓶發酵復篩，篩選到納豆激酶能力提升的6株菌株，分別是突變菌株YB2、YB5、YC2、YC4、YC5以及YC6。通過傳代5代的遺傳穩定性試驗，最終篩選到突變菌株YC4，其產納豆激酶能力強且產酶性能穩定。與出發菌株的搖瓶發酵比較，確定突變菌株YC4的產酶發酵周期為48 h，納豆激酶酶活力為8 450.55 IU/mL，是出發菌株XD2的2.42倍，說明復合誘變效果良好，顯著地提高了產酶效益，降低了生產成本，為納豆激酶的大規模生產提供基礎。