糖原合酶激酶3(GSK3)介導的胰島素對糖原合酶2(GYS2)的抑制調節

周圣曜, 趙新軍, 2

(1. 伊犁師范大學 新疆凝聚態相變與微結構實驗室， 伊寧 835000; 2. 伊犁師范大學 微納電傳感器技術與仿生器械實驗室， 伊寧 835000)

1 引 言

代謝重編程被認為是癌癥的標志[1]，近來的研究發現[2-4]，在人類腫瘤細胞中存在異常的糖原含量，表明了異常的葡萄糖代謝. 在癌癥的發生發展途徑中，葡萄糖和谷氨酰胺代謝通過 MYC、P53、Ras 相關癌基因、LKB1-AMP激酶(AMPK)和PI3激酶(PI3K)在信號通路中的突變而重新編程，其中，致癌的Ras既可以通過增強 GLUT1 蛋白的表達來刺激葡萄糖的攝取，又可以通過合成代謝途徑來利用葡萄糖[5,6]，因此，葡萄糖代謝異常已成為癌癥的重要標志之一. 糖原是葡萄糖的分支聚合物，儲存在肌肉和肝臟中，在需要時用作能量供應[7]. 糖原合酶(GS)是糖原合成中的限速酶[8]，在哺乳動物中，有兩種亞型：由 GYS1 編碼的肌肉 GS 和由 GYS2 編碼的肝臟限制性同工型[8,9]. GYS1 在脂肪、心臟和肌肉中廣泛表達，而 GYS2 則主要在肝臟中表達[10,11]. 病理學研究表明[12]，GYS2 缺乏會導致糖原貯積病0型(GSD-0)并伴有葡萄糖耐量降低的癥狀. 肝臟在糖原代謝過程中，GYS2 被糖原合酶激酶3(GSK3) 磷酸化和抑制，激活 GSK3 可以促進 GYS2 磷酸化和失活，蛋白磷酸酶1(PP1)則催化 GYS2 去磷酸化并激活[13,14]. 在晝夜節律基因(CLOCK)的調控作用下，GYS2 的活性表現出磷酸化/去磷酸化晝夜節律的轉變，這樣，GYS2 的表達合成呈現出了晝夜節律性[15,16]. 以往的研究發現[17-19]，胰島素(Insulin)可以刺激 GSK3 磷酸化抑制其活性，通過依賴PI3K激酶的途徑，胰島素激活 AKT 激酶，經過 AKT 的催化作用，促進了 GSK3 磷酸化和失活[20]. 這樣，胰島素通過 GSK3 對 GYS2 的活性進行調節，有助于實現晝夜節律的肝糖原合成，從而成為 GYS2 激活表達、維持血糖在合理范圍內的基礎. 因此，CLOCK 基因的突變、以及胰島素合成異常將會導致 GYS2 活性的晝夜節律行為改變，進而導致葡萄糖代謝紊亂，促進肝癌(HCC)的發生發展. 最近 Kumagai 等人[21]通過基因組分析表明，癌細胞中的RHOA基因突變激活了PI3K-AKT-雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號傳導途徑，增加了游離脂肪酸的產生，促進了腫瘤的進展. mTOR 是一種進化保守的 Ser/Thr 激酶，與多種生理過程和病理狀態有關，并且 mTOR 通過激活 S6K(p70 S6 激酶)，限制 GSK3 的活性，從而在一定程度上改變 GYS2 磷酸化/去磷酸化轉變特性，影響糖原晝夜節律的合成，促使 HCC 細胞的生長增殖[22,23].

在癌細胞的生長增殖過程中，P53 蛋白是最重要的癌變抑制因子之一[24]. 在響應應激信號過程中，P53 介導細胞對 DNA 損傷、致癌性侵害做出反應，引發細胞暫時的細胞周期停滯、永久性細胞衰老和凋亡性細胞死亡，以防受損或受壓的細胞繼續增殖. 在抑制癌細胞增殖過程中，P53 誘導 MDM2 和 PTEN轉錄，MDM2 通過抑制 P53 的反式激活活性來抑制 P53 的功能[25]，而 PTEN 使 PIP3 去磷酸化以抑制 AKT 激活[26]. AKT 可以通過 MDM2 調節 P53 的表達水平誘導細胞凋亡，即形成 AKT-MDM2-P53-PTEN 反饋回路，并且 MDM2 還可與 GYS2 直接結合，以抑制 P53 的泛素化[27]. 這樣 P53 通過抑制 AKT，還可以重塑癌細胞的糖原代謝與應激代謝異常，從而有利于細胞癌變的抑制. 因此，在 HCC 進展過程的微環境中，AKT 的激活表達，對 GSK3 介導的胰島素調節 GYS2 的表達合成，以及 P53 啟動癌變抑制程序至關重要.

鑒于文獻[20,21,22,25,27]中新穎而重要的實驗結果，可以得出：通過 AKT 的調節作用，胰島素與 P53 可以實現 GSK3 的調控，從而進一步調節 GYS2 磷酸化/去磷酸化的晝夜節律轉變特性. 糖原代謝的規律性不僅與晝夜節律的基因 (例如CLOCK 基因)密切相關，而且胰島素與 P53 也會在很大程度上調節糖原代謝的晝夜節律性. 一系列實驗研究結果已經表明[5,28,29]，癌癥的發生發展與晝夜節律代謝紊亂之間存在聯系，深刻理解胰島素與 P53 如何改變 GYS2 磷酸化/去磷酸化轉變的晝夜節律性，對于設計阻止 HCC 發生發展的治療方案是非常重要的. 實驗的結果[25-27,30,31]確認了胰島素與 P53 對糖原代謝的調節作用，但是對于胰島素與 P53 調節糖原代謝的物理機制，以及信號路徑卻沒有研究清楚. 之前的理論[32-35]在激活基因通路研究方面已經取得了重要的成果，并定量揭示了腫瘤抑制的物理機理. 但是在 HCC 進展過程的微環境中，胰島素與 P53如何通過調節 GSK3，調控糖原代謝的作用機制仍然未知.

在本文中，將建立動力學理論模型，研究在 HCC 進展過程的微環境中， GSK3介導的胰島素與 P53對糖原代謝的調控作用. 分析胰島素激活 PI3K-AKT-mTOR 信號傳導途徑調控 GYS2 磷酸化/去磷酸化轉變的晝夜節律性，以及 P53 通過 AKT-MDM2-P53-PTEN 信號通路，對 GYS2 磷酸化/去磷酸化轉變的晝夜節律性的調節特性. 進一步深刻揭示 GSK3 介導的胰島素、P53調節 GYS2 磷酸化/去磷酸化的轉變特性，為設計阻斷 HCC 發生發展的通路治療方案提供理論依據.

2 理論模型

圖 1 胰島素、P53調節 GYS2 磷酸化/去磷酸化轉變通路的具體模型示意圖(模型圖中 b 圖為 a 圖中 PD 模塊部分).Fig.1 Schematic depiction of the model on insulin and P53 regulating the phosphorylation/dephosphorylation transition pathway of GYS2( Fig.b in the model diagram is the PD module of Fig.a).

GSK3 介導的胰島素、P53 調節 GYS2 磷酸化/去磷酸化轉變的模型如圖1所示. 在這里我們考慮：胰島素通過激活 PI3K-AKT-mTOR 信號途徑中的 AKT 抑制 GSK3，影響 GYS2 磷酸化/去磷酸化轉變，以及 P53 誘導 MDM2 和 PTEN 轉錄，MDM2 反抑制 P53，形成 AKT-MDM2-P53-PTEN 反饋回路[26,27]. MDM2 和 GYS2 直接結合抑制 GYS2 的表達，未與MDM2 結合的 GYS2(FGYS2) 活性呈現出晝夜節律的特性，CLOCK 基因通過調控晝夜節律mRNA(Circadian mRNA)和頻率蛋白質(FRQ)的合成表達，調節 FGYS2 磷酸化/去磷酸化，FGYS2 被 GSK3 磷酸化抑制其活性，而被 PP1 去磷酸化激活[14].

假定 MDM2 和 GYS2 的直接結合形成復合體 MMG 的反應為二級反應，晝夜節律 mRNA標記為 Circadian mRNA(CmRNA). 基于 Hill 動力學與 Michaelis-Menten 方程[36,37]，可以獲得各組分濃度隨時間演化的動力學方程組為：

(1)

(2)

(3)

(4)

(5)

(6)

(7)

(8)

(9)

[MGYS2]=k10[GYS2]

(10)

[FGYS2]=k11[GYS2]

(11)

(12)

(13)

(14)

(15)

以上方程組中，k10、k11為競爭因子參數，為了符合實驗結果[18,20,21,22,25,27]，我們模型化k10=1/{1+exp[0.5(1-[MDM2]/[GYS2])]}，描述 MDM2 對 GYS2 的結合能力，k11=1-k10，標記未與 MDM2 結合的 GYS2 的分數. 與 MDM2 結合的 GYS2 標記為 MGYS2，未與 MDM2 結合的 GYS2 標記為 FGYS2. 描述 GYS2 的磷酸化狀態標記為 FGYS2 的超磷酸化態(pGYS2)，GYS2 去磷酸化狀態為 FGYS2 低磷酸化態(dGYS2)，dGYS2 激活CmRNA. pGYS2 與 dGYS2 間的轉換，明確了 GYS2 磷酸化/去磷酸化的轉變特性. 方程組中 [FGYS2]=[pGYS2]+[dGYS2]，Hill 系數為n1=5、n2=3、n3=5.

生物系統具有很強的穩定性，這使得合理的數學模型能夠在較大的參數范圍內有效描述系統的特性，可以通過考察模型對參數變化的敏感性檢測參數(表1)設置的合理性，模型中微分方程組可以通過四階變步長Runge-Kutta 方法求解.

3 結果與討論

胰島素在刺激糖原合成過程中，通過 PI3K 激酶激活 AKT，經過 AKT催化抑制 GSK3 的活性[18]，進而影響 GYS2 磷酸化/去磷酸化的轉變. 為了考察GSK3 介導的胰島素對 GYS2 的抑制調節，可以首先考察 [AKT] 隨時間演化的動力學特性.

圖2呈現了在不同胰島素濃度條件下，[AKT]

附1 模型中的參數取值

隨時間演變的動力學關系. 從圖 2 可以看出，AKT 濃度隨時間的演化而逐漸增大，升高到了較大的穩定值，這表明 AKT 被激活并達到一定的表達水平. 比較不同胰島素濃度時的 [AKT]，可以看出，隨著 [Insulin] 增大，[AKT] 隨時間演化的穩定幅值變大(圖4a). 由此表明了胰島素在 PI3K-AKT-mTOR 信號傳導中的作用. 胰島素通過激活并提升 AKT 的表達水平上調，從而進一步激活下游通路信號. 在胰島素刺激糖原合成過程中，通過刺激 PI3K 激酶的途徑，胰島素激活 AKT，并且較大濃度的胰島素在很大程度上提升了 AKT 的表達水平，經過 AKT 的催化作用，抑制 GSK3 激酶的活性[16-18].

圖 2 不同 [Insulin] 條件下，[AKT] 隨時間演變的動力學關系.Fig.2 Temporal evolutions of the level of [AKT] at different [Insulin].

圖 3 不同[Insulin] 條件下，[GSK3] 隨時間演變的動力學關系.Fig.3 Temporal evolutions of the level of [GSK3] at different [Insulin].

圖 3 顯示了不同 [Insulin] 條件下，[GSK3] 隨時間演變的動力學關系. 從圖 3 可以看出，隨著時間的演化，[GSK3] 極快地升高到了最大值，然后持續短時間后急劇降低并趨于穩定值不變. 由此表明，[GSK3] 隨時間演化的初始階段呈現了脈沖式的激活表達，進而觸發增強了 GYS2 的磷酸化和抑制. 實驗研究表明[17,18]， GYS2 被 GSK3 磷酸化和抑制，磷酸化的 GYS2 處于失活狀態，不利于糖原合成. 隨著 [Insulin] 增加，圖 3 也顯示了 [GSK3] 隨時間演化的幅值減小，由此表明了胰島素對 GSK3 的抑制作用. 胰島素激活 AKT，較大濃度的胰島素會使得 AKT 的表達水平上調，由于 AKT 對 GSK3 的抑制效應，致使在較大胰島素濃度條件下，GSK3 呈現了較低的激活表達水平. 這樣會使得 GSK3 對 GYS2 的磷酸化和抑制性減弱，促進了 GYS2 去磷酸化并激活，有利于糖原合成. 另外，胰島素還通過 PI3K-AKT-mTOR-S6K 通路對 GSK3 形成負反饋，抑制減弱 GSK3 的表達水平，刺激糖原合成. 由此可見，胰島素通過激活 PI3K-AKT-mTOR-S6K 信號通路，通過抑制 GSK3 調節 GYS2 磷酸化/去磷酸化，進而調控葡萄糖的代謝. 為了進一步確定胰島素調節 GYS2 磷酸化/去磷酸化效應，可以考察不同胰島素濃度條件下，dGYS2 隨時間的演化特性.

圖 4 不同[Insulin] 條件下 [dGYS2]隨時間演變的動力學關系.Fig.4 Temporal evolutions of the level of [dGYS2] at different [Insulin].

圖 4 呈現了在不同胰島素濃度條件下，dGYS2 濃度隨時間演變的動力學關系. 從圖 4 可以看出，在胰島素濃度適當的條件下(50 nM)，[dGYS2] 顯示了較為穩定的隨時間周期演化振蕩特性，穩定振蕩周期約為 24 h，這與 Doi 等人的染色質免疫沉淀分析測量實驗結果一致[16]. 由此表明，在一個晝夜周期中，GYS2 去磷酸化激活保持了很好的節奏感，調控著 GYS2 活性的晝夜節律表達. 這樣，通過 GYS2 去磷酸化激活的晝夜節律性，調節肝糖原晝夜節律的合成. Doi 等人的實驗表明[15]，CLOCK 基因通過調控 CmRNA 和 FRQ 的合成表達，在 GSK3 激酶和 PP1 激酶的作用下，調節 GYS2 磷酸化/去磷酸化的晝夜節律性表達[14,16]. 在這里我們發現，在胰島素濃度適當的條件下，dGYS2 正常的周期演化振蕩特性被很好地保持，由此表明，適當的胰島素濃度，有助于 CLOCK 基因調節 GYS2 磷酸化/去磷酸化的晝夜節律性表達，維持正常的糖原代謝. 在較低胰島素濃度條件下(1～50 nM)，隨著胰島素濃度降低，dGYS2 隨時間演變的周期性開始變大(圖4a)，進一步降低胰島素濃度(～1nM)，dGYS2 隨時間演化的周期幾乎完全改變，并且振蕩規律演化為極短的脈沖式信號，振蕩幅度增加. 由此表明，在胰島素濃度太低的情況下，GYS2 去磷酸化激活的晝夜節律性會被改變，進而改變了肝糖原晝夜節律的合成規律，導致肝臟內糖原代謝周期異常；dGYS2 振蕩幅度增加則表明糖原代謝活性增強，出現血糖升高癥狀. 在較高胰島素濃度條件下(50～250 nM)，隨著胰島素濃度增大，如圖 4b 所示，dGYS2 隨時間改變的周期演化振蕩性開始改變，當胰島素濃度較高時(～250 nM)，隨著時間演化，dGYS2 的周期振蕩性逐漸消失，周期性規律被完全改變，振幅降低. 由此表明，在胰島素濃度太大的情況下，GYS2 去磷酸化激活的晝夜節律性會被極大地改變，肝糖原晝夜節律的合成規律被破壞，進而導致肝臟內糖原代謝異常降低.

由于胰島素通過激活 PI3K-AKT-mTOR-S6K 信號通路，激活 AKT 抑制調節 GSK3 的表達水平，GSK3 催化 GYS2 磷酸化，同時，PP1 促進 GYS2 去磷酸化，在 CLOCK 基因、FQR 蛋白以及適當濃度胰島素的調節作用下，體系始終處在 GYS2 磷酸化/去磷酸化晝夜節律轉變的動態平衡中，維持晝夜節律的糖原代謝. 然而，較少的胰島素不足以抑制 GSK3，這樣 GSK3 活性較大地增強，過多地促使 GYS2 磷酸化，導致糖原代謝異常. 較多的胰島素則會過量地抑制 GSK3，使得 GSK3 活性較大程度地降低，對 GYS2 磷酸化的催化能力減弱，致使 PP1 催化的 dGYS2 不能被及時磷酸化，進而導致糖原代謝紊亂.

Boroughs 等人的研究發現[1]，在糖原代謝存在異常時，P53 具有促進代謝適應的調控作用，通過 P53 調控，異常的代謝會被調節，幫助平衡糖酵解和磷酸化，并有助于細胞適應和抵抗代謝應激. 為了進一步明確 P53 對糖原代謝異常的調節作用，可以考察在較低和較高胰島素濃度條件下，P53 對 dGYS2 異常的晝夜節律性演變的調節恢復特性.

圖 5 [Insulin]=1 nM(a) 與[Insulin]=250 nM(b) 時，[dGYS2]隨時間演變的動力學關系Fig.5 Temporal evolutions of the level of [dGYS2] for [Insulin]=1 nM(a) and [Insulin]=250 nM(b).

圖 5 呈現了在 [Insulin]=1 nM 與 [Insulin]=250 nM 時不同k5條件下，dGYS2 隨時間演變的動力學關系.k5參數描述了 P53 的生成速率，較大的k5參數，表明了 P53 較快的生成速率，對應著 P53 隨時間演化的較大的幅值與其較高的表達水平. 從圖 5 可以看出，通過改變k5參數，在較低(圖5a)和較高(圖5b)胰島素濃度條件下 dGYS2 異常的晝夜節律性，可以被調節恢復. 由此表明，P53 對較低和較高胰島素濃度條件下 dGYS2 晝夜節律性的異常，有明顯的調節恢復作用，隨著 P53 的增多或降低，晝夜節律的周期性逐漸被還原. 這是由于，胰島素通過激活 PI3K-AKT-mTOR-S6K 信號通路，激活 AKT 抑制調節 GSK3 的表達水平，P53 則會通過 AKT-MDM2-P53-PTEN 回路抑制 AKT，這樣，胰島素合成異常導致的 GYS2 磷酸化/去磷酸化轉變的晝夜節律改變，可以通過激活 P53 的表達水平進行合理地調節恢復. 另外，在 P53 的作用下，會有較多的 MDM2 激活，MDM2 和 GYS2 的直接結合減少了 FGYS2 的表達水平，在一定程度上也調控了 GYS2 磷酸化/去磷酸化的表達水平和晝夜節律特性.

圖 6 不同 k5 條件下，[GSK3] 與 [FGYS2] 隨時間演變的動力學關系.Fig. 6 Temporal evolutions of the levels of [GSK3] and [FGYS2] at different k5.

圖 6 顯示了不同k5參數條件下，[GSK3] 與 [FGYS2] 隨時間演變的動力學關系. 從圖 6a 可以看出. 在一定的k5參數變化范圍內，隨著 P53 表達水平的提升，[GSK3] 去磷酸化激活在一定程度上被增強. 這意味著較高的 P53 表達水平，會減弱胰島素對 GSK3 的抑制程度，使得 GSK3 活性增強. 這是由于，通過 AKT-MDM2-P53-PTEN 回路，P53 抑制 AKT，減弱了胰島素對 GSK3 的抑制. 此外，P53 較高的表達水平，會激活較多的 MDM2，這樣與 MDM2 結合的 GYS2 增多，減少了 FGYS2 的表達水平. 圖 6 還顯示了較大k5參數，對應著較小的 [FGYS2] 隨時間演變的幅值. 由此表明了 P53 的增多，在一定程度上可以調低 FGYS2 的幅值水平，進而影響改變 GYS2 的活性，以及磷酸化/去磷酸化的晝夜節律性. 這樣，P53 通過調控胰島素對 GSK3 的抑制程度，以及 FGYS2 的表達水平，實現了調節恢復 GYS2 磷酸化/去磷酸化轉變的晝夜節律性，進而調節恢復異常的糖原代謝，幫助細胞適應和抵抗代謝異常應激[38].

4 結 語

在本文中，基于Hill 動力學與 Michaelis-Menten 方程，建立理論模型研究 HCC 進展過程的微環境中，GSK3 介導的胰島素對糖原代謝的調節作用，以及 P53 調節恢復異常的糖原代謝. 分析了胰島素激活 PI3K-AKT-mTOR 信號傳導途徑，調節 GYS2 磷酸化/去磷酸化轉變的晝夜節律性，以及 P53 通過 AKT-MDM2-P53-PTEN 信號通路，對 GYS2 磷酸化/去磷酸化轉變的晝夜節律異常的調節恢復特性. 研究發現，胰島素通過激活并提升 AKT 的表達水平，經過 AKT 的催化作用，GSK3 隨時間演化呈現了脈沖式的激活表達，進而觸發增強了 GYS2 的磷酸化和抑制作用. 由此表明，胰島素通過激活 PI3K-AKT-mTOR-S6K 信號通路，在一定程度上調節 GYS2 磷酸化/去磷酸化. 通過考察不同胰島素濃度條件下，dGYS2 隨時間的演化特性，我們發現，隨著胰島素濃度降低，dGYS2 隨時間演變的周期性改變. 由此表明，在胰島素濃度太低的情況下，GYS2 去磷酸化的激活的晝夜節律性會被改變，進而改變了肝糖原晝夜節律的合成規律. 在較高胰島素濃度條件下，隨著胰島素濃度增大，dGYS2 隨時間演變的周期演化振蕩性會被極大地改變，肝糖原晝夜節律的合成規律被破壞. 通過考察在較低和較高胰島素濃度條件下，P53 對 dGYS2 異常的晝夜節律性演變的調節恢復特性，我們發現在 P53 作用下，原本紊亂的 dGYS 隨時間的演化，隨著 P53 的增多或降低，晝夜節律的周期性逐漸被還原. 由此表明，P53 調節恢復 GYS2 磷酸化/去磷酸化轉變的晝夜節律性，進而調節恢復異常的糖原代謝.

本文中只考慮胰島素與 P53 協同通過激活、抑制 AKT 調節 GSK3 活性，從而改變糖原代謝特性. 事實上，胰島素還可以通過抑制GSK3刺激起始因子2B(eIF2B)的去磷酸化和激活，促進蛋白質合成的速率改變[39,40]. GSK3 還催化真核蛋白合成 eIF2B 的磷酸化和抑制，從而抑制蛋白合成. 因此，胰島素在人類代謝調節中的生物功能仍需要進一步研究[41]. 本文考慮胰島素激活PI3K-AKT-mTOR 信號傳導途徑，調節 GYS2 磷酸化/去磷酸化轉變的晝夜節律性，以及 P53 通過 AKT-MDM2-P53-PTEN 信號通路，調節恢復 GYS2 磷酸化/去磷酸化轉變的晝夜節律性，進而調節糖原代謝. 理論結果符合實驗[18,20-22,25]，進一步揭示了 GSK3 介導的胰島素調節 GYS2 磷酸化/去磷酸化轉變的晝夜節律性的調節機理，以及 P53 對 GYS2 磷酸化/去磷酸化轉變異常的調節恢復特性，可為設計阻斷 HCC 發生發展的通路治療方案提供理論依據.