平場復用多焦點結構光照明超分辨顯微成像*

葛陽陽 何灼奮 黃黎琳 林丹櫻 曹慧群 屈軍樂 于斌?

1) (深圳大學物理與光電工程學院，光電子器件與系統教育部/廣東省重點實驗室，深圳 518060)

2) (深圳大學化學與環境工程學院，深圳 518060)

多焦點結構光照明顯微技術(multifocal structured illumination microscopy，MSIM)能在50 μm 的成像深度內和1Hz 的成像速度下實現兩倍于衍射極限分辨率的提升，相比傳統的寬場結構光照明顯微技術，具有較大的成像深度和層析能力，更適合應用于厚樣品的長時程三維超分辨成像.然而，MSIM 存在成像速度慢、圖像處理過程復雜等問題.本文提出了一種基于平場復用多焦點結構光照明的快速超分辨顯微成像方法和系統(flat-field multiplexed MSIM，FM-MSIM)，通過在照明光路中插入光束整形器件，將高斯光束轉變為均為分布的平頂光束，提高激發點陣的強度均勻性和擴大視場;通過將每個衍射受限的激發點沿y 方向延長，形成新的多路復用多焦點陣照明圖案，提高能量利用率，減少掃描步數，進而提高成像速度和信噪比;結合基于多重測量矢量模型的稀疏貝葉斯學習圖像重構算法，簡化圖像重構步驟，在保證空間分辨率的同時實現至少4 倍于傳統MSIM 的成像速度.在此基礎上，利用搭建的FM-MSIM 系統進行了BSC 細胞微管樣片和小鼠腎切片標準樣片的超分辨成像實驗，實驗結果證明了該系統的快速三維超分辨成像能力，對于MSIM 的發展具有重要的意義.

1 引言

近年來，超分辨熒光顯微成像技術(super-resolution fluorescence microscopy，SRFM)蓬勃發展，突破了光學衍射極限的限制，能夠以納米尺度的空間分辨率觀察到細胞內的精細結構和動態過程，已成為生命科學等領域重要的研究工具，極大地推動了生命科學等諸多領域的發展.

目前，SRFM 主要可以分為受激發射損耗(stimulated emission depletion，STED)顯微技術[1-3]、單分子定位顯微術(single molecule localization microscopy，SMLM)[4，5]和結構光照明顯微技術(structured illumination microscopy，SIM)[6-10]3 類技術.STED的空間分辨率通常在60—100 nm 的數量級，由于其采用點掃描的成像方式，可實現數十微米成像深度的超高分辨率成像.但是，其成像速度與觀察樣品區域大小成反比關系，而且需要特定的熒光標記及高能量的損耗光，光漂白和光毒性大，難以用于研究較大的活體生物樣本.SMLM 技術如隨機光學重構顯微技術[4]和光激活定位顯微技術[5]，雖然可實現橫向10—30 nm、縱向20—50 nm 空間分辨率的寬場成像，但通常需要采集數千甚至數萬幅單分子熒光圖片來獲得一幅超分辨圖像，成像速度慢，成像深度一般在幾個微米，而且還受到光開關熒光探針標記的限制，不適合活體厚樣品的超分辨成像.傳統寬場SIM 利用線性光柵結構光照明，實現了橫向100—120 nm、縱向200 nm 左右空間分辨率的寬場、快速成像，三維成像時間分辨率遠高于SMLM，可達1 Hz[6]，而且需要的光照劑量很小，不需要特殊的熒光蛋白，避免了對樣品的損傷和干擾，更適合活細胞成像過程觀測.新出現的海森結構光照明顯微[9]和掠入射結構光超分辨顯微技術進一步提高了SIM 時空分辨率，實現了優于100 nm 分辨率的長時程、快速超分辨成像，幀頻達到200 fps 左右，但成像深度仍然有限.目前，寬場SIM 成像深度一般在20 μm 以內，無法對深層組織進行超分辨成像，主要原因在于寬場照明光容易受到樣品不均勻性和散射作用的影響.為了進一步提升SIM 的成像深度，2010 年，Müller 和 Enderlein[11]提出了一種新型點掃描結構光照明顯微術，命名為圖像掃描顯微(image scanning microscopy，ISM)，它用陣列探測器代替傳統的共焦顯微鏡的點探測器，利用數字像素重定位后續圖像處理技術，在保持高信噪比的同時將成像分辨率提升至寬場照明成像的1.63 倍.然而，由于受到EMCCD 相機幀頻的限制，ISM 獲取一個2 μm×2 μm 的樣品信息需要花費25 s 的成像時間，極大限制了其應用.為了解決這一問題，2012 年York 等[12]提出了多焦點結構光照明顯微技術(multifocal structured illumination microscopy，MSIM)，采用高速數字微反射鏡器件 (digital micromirror device，DMD)同時實現多焦點結構光的產生和掃描，通過數字像素重定位和解卷積技術進行超分辨圖像重構，實現了在成像深度50 μm 內的橫向約145 nm、軸向約400 nm 的空間分辨率和1 Hz 時間分辨率的三維超分辨成像，為活體厚樣品的超分辨成像提供了強有力的工具.2013 年，Schulz 等[13]提出了基于轉盤式共聚焦顯微鏡的ISM，其成像處理步驟與MSIM基本一致，但光學系統相對復雜.德國Zeiss 公司于2014 年起，在共聚焦顯微鏡的基礎上，推出了多種型號的基于Airyscan 探測器的ISM，成像速度和信噪比獲得很大的提升.隨后，研究人員為了進一步提高ISM 的成像速度、簡化后續圖像處理過程，發展了多種基于光學像素重定位技術的ISM，如瞬時結構光照明超分辨顯微[14]、二次掃描共聚焦顯微[15]和光學光子再分配顯微[16]等.雖然，這些系統不依賴于后期的像素重定位技術來實現超分辨，但光學掃描系統復雜，光路準直要求高，不便于實際操作和應用.因此，ISM 顯微技術在成像速度、成像深度和功能上仍有很大的提升空間.

綜上，研究和開發新型ISM 系統和方法，進一步提升其性能，使其更適用于活體厚樣品的快速三維高分辨成像，對于生命科學和生物醫學等領域的研究具有重要的意義.本課題組在前期的研究工作中，提出基于多重測量矢量模型的稀疏貝葉斯學習(multiple measurement vector sparse bayesian learning，MSBL)的MSIM 圖像重構算法(MSIMMSBL)[17]，不需要估計多焦點的空間位置信息，將重建過程視為多重探測矢量的重建問題，簡化了處理步驟，并進一步提高了MSIM 的空間分辨率.在前期工作基礎上，為了進一步提高MSIM 的分辨率、成像速度和信噪比，本文提出了一種平場復用的多焦點結構光照明顯微成像方法(flat-field multiplexed MSIM，FM-MSIM)和系統，通過在照明光路中引入光束整形器件，將高斯光束轉變為平頂光束，獲得成像視場內更加均勻的激發點陣，提高系統分辨率;通過設計新的“4×1”多像素復用多焦點照明模式，采集的點陣源圖像僅為MSIM 中所采用“1×1”單像素多焦點照明模式的1/4，大大提高了MSIM 的成像速度和信噪比;結合 MSBL 進行超分辨圖像處理，得到約2 倍于寬場顯微分辨率的提升.設計和搭建了FM-MSIM 系統，開展了細胞微管樣片和小鼠腎切片標準樣片的超分辨顯微成像實驗，驗證了系統的分辨率和視場;編制了MSBL 圖像重構程序，實現了厚樣品的超分辨三維圖像重構.實驗結果證明了系統同時提升了MSIM 的時空分辨率和信噪比，為MSIM 發展及其在活體厚樣品快速高分辨成像方面的應用提供了理論和技術基礎.

2 FM-MSIM 系統與方法

2.1 系統設計與搭建

所搭建的FM-MSIM 系統光路如圖1 所示.首先，一臺功率為200 mW，波長為488 nm 的固體激光器(Sapphire 488-200CW CDRH，相干，美國)發出的激光束經過一個由透鏡L1 (f1=10 mm)和L2 組成的4f系統 (f2=75 mm)將光束直徑擴大到原來直徑的7.5 倍;然后，經一個光束整形器BeamShaper (TopShape，TSM25-10-D-D-355，Asphericon Inc.美國)將高斯光束轉化為平場光束;平場光束與DMD 面板法線呈24°角照射在DMD 光學面上，并被‘on’狀態的微鏡反射進入由透鏡L3 (f3=75 mm)和L4 (f4=75 mm)組成的4f濾波系統，在其頻譜平面上放置一個可調式針孔光闌來阻擋DMD 的多余衍射級的反射光，以免產生雜散光干擾.經DMD 調控的反射光束會聚在4f濾波系統中透鏡L4 的后焦面上形成稀疏的激發點陣，并且其位置與管鏡TL1 (fTL1=300 mm)前焦面重合，確保DMD 的光學反射面與管鏡的前焦面共軛，激發濾光片F1 放置在管徑TL1 后面用來防止雜散光進入顯微鏡;最終，激發點陣經過由管鏡TL1 和物鏡(60×，NA=1.27，尼 康，日本)構成的顯微系統，尺寸縮小為原來的1/90 后成像到樣品面上并形成最終的激發模式.樣品經激發后發出的熒光經同一個物鏡、雙色片和發射濾光片F2 后，再經成像管鏡TL2 (fTL2=200 mm)成像到高靈敏度sCMOS相機(ORCA-Fusion BT，像素數2304×2304，像素尺寸6.5 μm×6.5 μm，濱松，日本)上.實驗中，DMD 面板的像素數為1024×768，每個像素尺寸大小為10.8 μm×10.8 μm，經光學系統縮小為原來的1/90后，其在樣品面上的對應大小為120 nm×120 nm.在FM-MSIM數據采集過程中，為了實現掃描和數據采集的同步，使用Labview 軟件通過采集卡(NI USB-6363，美國)分別控制DMD、三維納米位移臺 (E545，PI，德國)和sCMOS 相機.

圖1 FM-MSIM 系統光路示意圖Fig.1.Schematic diagram of FM-MSIM system.

2.2 平場照明

在FM-MSIM 系統的激發光路中引入光束整形器件，將入射的準直高斯光束整形為準直的平頂光束，入射到DMD 反射面上的光強分布的均勻性得到了很大改善，獲得了光強分布更加均勻的激發點陣，并且最大限度地利用DMD 的面板來獲得更大的照明視場.首先，利用羅丹明均勻溶液對光束整形器件的平場照明效果進行了測試，實驗結果如圖2 所示.圖2(a)和圖2(b)分別為無光束整形器和有光束整形器的羅丹明均勻溶液寬場成像圖，圖2(c)為沿中心一條直線處的歸一化光強分布輪廓圖，可以明顯看出經過光束整形器調制后的光強分布更加均勻;圖2(d)和圖2(e)為有無光束整形器的激發點陣效果對比圖，同樣可以看出經調制后可以得到更加均勻的激發點陣，從而改善后續的熒光成像和超分辨圖像重建.

圖2 平場照明實驗表征 (a)無光束整形器的羅丹明均勻溶液寬場成像;(b)有光束整形器的羅丹明均勻溶液寬場成像;(c)圖(a)和圖(b)中藍色虛線部分布歸一化強度輪廓圖;(d)無光束整形器的激發點陣;(e)有光束整形器的激發點陣Fig.2.Experimental characterization of flat-field illumination:(a) Wide field imaging of uniform Rhodamine 6 G solution without a beam shaper;(b) wide field imaging of uniform Rhodamine 6 G solution with a beam shaper;(c) normalized intensity fitting profiles along blue dotted line in panel (a) and panel (b);(d) a multifocal excitation pattern without a beam shaper;(e) a multifocal excitation pattern with a beam shaper.

2.3 復用的多焦點結構光照明圖案

在MSIM 中[12]，利用一個DMD 同時實現激發點陣的產生和數字掃描，具體實現方式如下，根據DMD 工作基本原理，當光束以特定角度入射DMD 面板時，每個處于工作on 狀態的微反射鏡都在樣品面對應位置產生一個衍射受限激發點，只要將一些特定位置的微反射鏡處于工作on 狀態就能在樣品面上獲得規則的多焦點激發模式.實際操作時，通過控制軟件加載相同尺寸的黑白圖片來決定DMD 上微反射鏡的工作狀態，當加載的圖片黑白像素點的位置發生變化時對應的DMD 微反射鏡工作狀態也產生相應的改變，從而形成我們想要的激發模式.然而，在最初的MSIM 的激發點陣圖案中，每個激發點采用DMD 上“1×1”處于on 狀態的像素構成，考慮到圖像信噪比，設置點陣間隔為14 pixels×16 pixels，則需要采集224 幅點陣源圖像來重構一幅超分辨圖像;對于480×480 視場，相機幀頻222 Hz，超分辨成像速度大約1 Hz，相對較慢;而且光能利用率非常低，造成圖像的信噪低，影響超分辨圖像的重構，因此，需要發展新的MSIM照明圖案.

基于此，在FM-MSIM 中，考慮到點陣圖像的信噪比，設計了新的“4×1”多像素復用多焦點照明模板，相當于4 行像素同時并行掃描，匹配點陣模板尺寸，點陣間隔設置為16 pixels×18 pixels，則掃描步數為72，而普通“1×1”單像素多焦點照明模式的掃描步數288，如圖3 所示，普通“1×1”單像素多焦點照明模式在y方向上的掃描步數為“4×1”多像素復用多焦點照明模式的4 倍，因此，利用新型模板掃描的成像速度是原先模板掃描速度的4 倍;在同樣的激發光強度下，經DMD 反射的光能量利用率變為原來的4 倍;利用羅丹明均勻染料樣品的點陣熒光圖像，根據信噪比的計算公式10log10(Isignal/Inoise)，計算激發點陣的平均峰值信噪比約提高了20%.圖3(a)為4×1 激發點陣模板掃描原理示意圖，每次移動1 個像素點，對應樣品面上移動120 nm.圖3(b)為普通1×1 激發點陣模板掃描原理圖，圖3(c)為單張點陣圖的羅丹明均勻染料熒光圖像.

圖3 復用多焦點照明原理圖 (a) 4×1 激發點陣掃描原理圖;(b) 1×1 激發點陣掃描原理圖;(c)復用的多焦點激發羅丹明均勻染料樣品熒光圖像Fig.3.Schematic diagram of multiplexed multifocal excitation illumination:(a) Schematic diagram of 4×1 excitation spot array scanning;(b) schematic diagram of 1×1 excitation spot array scanning;(c) fluorescece image of the excitation foci in a uniform solution of Rhodamine 6G at the sample plane.

2.4 超分辨圖像重構方法

MSIM[12]超分辨重構需要經過數字像素重定位技術，即多焦點位置標定、數字針孔濾波、圖像縮放、求和等4 個圖像處理步驟來重建超分辨圖像，然后再經過解卷積來進一步提升圖像的分辨率，最終獲得2 倍于寬場顯微鏡的分辨率.在數字像素重定位過程中，多焦點參考位置的精確估計，對于MSIM 重建算法至關重要.本課題組在前期的研究工作中，提出的MSBL 圖像重構算法[17]，并不需要估計多焦點的空間位置，將重建過程視為多重探測矢量的重建問題，簡化了處理步驟，而且進一步提高了MSIM 的空間分辨率.在FM-MSIM中，由于采用了新的結構光照明圖案，在MSBL 圖像重構算法中，對照明模板作相應修改即可.

利用MSBL 進行的超分辨圖像重構的基本原理如下:樣品被第m個激發模式em(r)照射時，像面上的熒光強度分布ym(r)可表示為

式中，s(r) 為樣品的結構信息，em(r)為激發多焦點的強度分布，在本文中為新設計的多像素復用多焦點陣列模板，P SFdet(r)為系統探測點擴散函數.基于壓縮感知理論，將連續信號轉換成離散信號表示，其中第m個激發模式在空間中的強度分布表示為em，對應的樣品發射的熒光信號為vmS·em，其中Sdiag(s1，···，sN)為非負對角矩陣，表示N像素網格化的結構信息.將樣品熒光信息卷積 P SFdet(r)的過程用矩陣H表示，則(1)式改寫為

其中矩陣Y和H分別代表熒光點陣圖像序列和光學系統的響應函數，S和E分別為樣品的真實結構信息和光學系統的激發模式.而(2)式又可進一步改寫成

其中Y[y1，y2，···，yN]，其中ym是由第m張點陣數據轉換來的列向量，H是測量矩陣，XS·E[x1，x2，···，xN]，xm則是s(r)·em(r)得 來的列向量，S和E分別為s(r)和em(r)構成的矩陣，于是，整個圖像重構過程如圖4 所示.

首先，將所有的探測圖像序列和系統PSF 根據圖4(a)和圖4(b)轉換成矩陣形式.其中Y矩陣的每一個列矢量對應一幅探測圖像，而H的第i列對應著當樣品中只有一個分子發射熒光，且它的位置隨著圖4(b)中的箭頭移動到第i個位置處時，得到的探測圖像.假設每幅探測圖像的尺寸為m×n、超分辨成像的尺寸為m0×n0(m0，n0＞m，n)、探測圖像數量為N，則對應矩陣Y，H和X的大小分別為mn×N，mn×m0n0，和m0n0×N.由于X=SE，X中的所有列矢量具有相同的空間支撐，并且這個空間支撐與S相同，因此重構X的問題可以作為一個多測量矢量問題.

圖4 原始數據與系統PSF 轉換為矩陣形式的過程 (a) FM-MSIM 點陣數據轉換為矩陣Y;(b)系統PSF 轉換為矩陣HFig.4.Process of converting raw images and system PSF into matrix form:(a) FM-MSIM multifocal patterns data is converted to matrix Y;(b) System PSF is converted to matrix H.

其次，利用MSBL 算法來求解(4)式.根據貝葉斯推理，公式的解X′

由最大后驗概率估計得到:

最后，估計值X′中所有的列矢量相加并轉換成一個大小為m0×n0的超分辨圖像.

通過上述算法流程，可以重構出樣品的超分辨圖像.

3 成像結果與討論

3.1 細胞微管樣品的超分辨成像

為了驗證FM-MSIM 系統的超分辨成像能力，首先利用Alexa Fluor 488 標記的非洲綠猴腎細胞(BSC)微管樣品進行系統的分辨率標定.利用MSBL 算法分別對傳統的“1×1”多焦點點陣模板和新設計的“4×1 ”多像素復用點陣模板采集得到的圖像進行超分辨重構，得到的結果如圖5 所示.圖5(a)為減去背景噪聲的寬場圖像(subtract background widefield，SubWF)，圖5(b)為傳統“1×1”多焦點點陣模板得到的MSBL 重構圖像，圖5(c)為“4×1 ”多像素復用點陣模板得到的MSBL 重構圖像，圖5(d)和圖5(e)分別為圖中藍色和白色實線處的微管強度歸一化輪廓曲線，并對多組微管數據進行了x，y兩個方向上的半高全寬(full width at half maximum，FWHM)值進行了統計計算，x方向由高斯擬合得到的FWHM 分別為(315 ±15) nm，(183 ± 10) nm，(162 ± 10) nm 同 理，y方向半高全寬分別為(306 ± 15) nm，(174 ± 10) nm，(169 ± 10) nm.可以看出，利用“4×1 ”多像素復用點陣模板采集得到的數據經超分辨重構后的圖像分辨率略高，原因在于使用其對樣品進行掃描時得到的熒光強度更強，在相同的激光功率以及采集頻率150 Hz 情況下，擁有更高的信噪比，這也導致經MSBL 算法重構后獲得的分辨率更高，基本達到了寬場顯微分辨率的2 倍.此外，實驗中使用的傳統的“1×1”多焦點點陣模板的掃描步數為288，采集一幅二維圖像所需時間約為1.92 s，而使用“4×1 ”多像素復用照明模板的掃描步數72，采集一幅二維圖像僅需約0.48 s，可以看出FMMSIM 的成像速度為原先MSIM 成像速度的4 倍.

圖5 FM-MSIM 分辨率標定 (a)減去背景噪聲的寬場微管圖像;(b) 1×1 點掃模板的MSBL 重構圖像;(c) 4×1 點掃模板的MSBL 重構圖像;(d)藍色實線處微管強度輪廓線;(e) 白色實線處微管強度輪廓線Fig.5.Resolution in FM-MSIM:(a) Wide field image of microtubule in BSCs labeled with Alexa Fluor 488 phalloidin by subtracting background noise;(b) MSBL reconstructed image of 1×1 point scan mode;(c) MSBL reconstructed image of 4×1 point scan mode;(d) plots of intensity along blue solid line in panels (a)—(c);(e) plots of intensity along white solid line in panels (a)—(c).

3.2 小鼠腎切片的三維超分辨成像

為了測試FM-MSIM 系統的三維成像能力，使用小鼠腎切片標準樣片(FluoCellTM prepared slide#3 mouse kidney section，*AF 488 WGA，AF568 phalloidin，Product of US)進行成像.相機采集頻率200 Hz，使用“4×1 ”多像素復用點陣模板對樣品進行二維橫向掃描，并通過Labview控制納米位移臺實現z軸步進掃描成像，如圖6 所示，整個成像區域大小為55.3 μm×55.3 μm，每幅圖成像時間為0.36 s，軸向的成像位置分別是0，3 和6 μm.從圖6 可以明顯觀察到小鼠腎切片不同層樣品結構的變化和超分辨的效果，同時，FMMSIM 處理后的圖像分辨率具有顯著的提高，進一步驗證了所提出和搭建的FM-MSIM 的三維超分辨成像能力.

4 結論

本文提出和搭建了一套基于數字微鏡器件和光束整形器件的平場復用的多焦點結構光照明快速超分辨顯微成像系統.利用DMD 同時完成了新型“4×1 ”多像素復用點陣結構光的產生和快速掃描，提高了信噪比，減少了采樣時間，成像速度提升為原來MSIM 成像速度的4 倍;同時，在系統中加入了光束整形器，將高斯分布的光束調制為均勻分布的平場光束，提高了點陣均勻性和系統分辨率;建立了基于多重測量矢量模型的稀疏貝葉斯學習FM-MSIM 圖像重構算法，實現了超分辨圖像重構.最后，利用該系統，對細胞微管和小鼠腎切片進行三維超分辨成像，證明了該系統具有快速三維超分辨成像能力，為進一步開展活細胞及組織的超分辨成像打下了基礎.