鹽酸石蒜堿對TPC-1細胞增殖和周期的影響*

黃霜， 林琳， 袁琳， 張峰源， 姜旭淦， 陳盛霞

鹽酸石蒜堿對TPC-1細胞增殖和周期的影響*

黃霜， 林琳， 袁琳， 張峰源， 姜旭淦， 陳盛霞△

（江蘇大學醫學院，江蘇 鎮江 212013）

探討鹽酸石蒜堿（LH）對甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細胞增殖和周期的影響及其機制。體外培養TPC-1細胞，用不同濃度（1.25、2.5、5、10、20、40、60、80和100 μmol/L）的LH處理TPC-1細胞48 h，CCK-8法檢測LH作用TPC-1細胞的IC50。參照IC50，將對數生長期TPC-1細胞隨機分為7組：空白對照（control）組、溶劑對照（DMSO）組、1 μmol/L LH組、2 μmol/L LH組、4 μmol/L LH組、NAC（3 mmol/L）組和LH（4 μmol/L）+NAC（3 mmol/L）組。用CCK-8法、平板集落、EdU實驗檢測LH對細胞增殖的影響；透射電子顯微鏡觀察細胞線粒體超微結構；流式細胞術檢測細胞周期、活性氧（ROS）水平及線粒體膜電位變化；Western blot法檢測MAPK家族蛋白（p38 MAPK、ERK1/2、JNK、p-p38 MAPK、p-ERK1/2和p-JNK）的水平；免疫熒光檢測p-p38 MAPK、p-JNK和p-ERK1/2在細胞內的定位。（1） LH抑制TPC-1細胞增殖，抑制率與LH濃度及作用時間呈正比，LH作用48 h的IC50為2.314 μmol/L； （2） 4 μmol/L LH處理后TPC-1細胞線粒體超微結構發生變化，LH呈濃度依賴性地使線粒體膜電位去極化（<0.05）；（3） LH處理后TPC-1細胞S期比例顯著升高，G0/G1期比例顯著降低（<0.05）；（4） LH處理后的TPC-1細胞ROS水平相較對照組顯著升高（<0.01）；（5）LH處理后TPC-1細胞p38 MAPK、ERK1/2、JNK、p-p38 MAPK、p-ERK1/2和p-JNK蛋白水平均顯著升高，尤以磷酸化蛋白升高顯著，具有一定的藥物濃度依賴性，且p-p38 MAPK和p-ERK1/2在TPC-1細胞中都出現不同程度的入核現象；（6）NAC能抑制部分MAPK通路的激活。LH在體外能抑制TPC-1細胞的增殖，誘導細胞線粒體超微結構受損、線粒體膜電位去極化、細胞S期阻滯和細胞ROS水平升高，其作用機制可能是通過ROS累積誘導激活部分MAPK通路而發揮作用。

鹽酸石蒜堿；TPC-1細胞；細胞增殖；細胞周期；活性氧

天然產物及其衍生物是新藥新型結構的重要來源。在腫瘤領域，1981～2002年間天然小分子來源的新抗癌藥物保持在62%［1］。鹽酸石蒜堿（lycorine hydrochloride，LH）是從石蒜堿科植物石蒜的鱗莖中提取的異喹啉類環形生物堿，具有廣泛的藥理作用。研究表明，其具有消炎、抗病毒、抗肝纖維化、抗腫瘤、保護心血管和抗真菌（如白色念珠菌）等多種生物學功能［2-9］。然而，LH對乳頭狀甲狀腺癌細胞增殖、周期的影響及其作用機制尚不清楚。本項工作以甲狀腺乳頭狀癌細胞系TPC-1細胞為模型，探討LH對乳頭狀甲狀腺癌細胞增殖、周期和線粒體的影響，并對其機制進行研究，為LH治療甲狀腺乳頭狀癌提供參考數據。

材料和方法

1　細胞

甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細胞由江蘇大學附屬醫院毛朝明主任技師惠贈，常規培養，液氮保存。

2　主要試劑及儀器

胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）和RMPI-1640基礎培養液購自BI；LH（純度≥98%）、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）和-乙酰半胱氨酸（-acetyl-L-cysteine，NAC）購自MCE；RIPA裂解液、PMSF、活性氧（reactive oxygen species，ROS）檢測試劑盒、EdU細胞增殖檢測試劑盒、抗熒光淬滅劑、Hochest 33342染液、Triton X-100和線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential，MMP）檢測試劑盒（JC-1）均購自碧云天生物技術研究所；Cell Counting Kit-8 （CCK-8）和細胞周期檢測試劑盒購自聯科生物；p38絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）、ERK1/2和JNK抗體購自萬類生物公司；p-p38 MAPK、p-ERK1/2和p-JNK抗體購自CST；HRP標記的羊抗兔Ⅱ抗和HRP標記的羊抗鼠Ⅱ抗購自康為世紀；ECL顯色液購自Millipore；細胞爬片購自NEST。LH溶解于DMSO中，配制成50 mmol/L的儲存液，實驗時稀釋成100 μmol/L的工作溶液。NAC用PBS溶解，配制成100 mmol/L的儲存液，實驗時稀釋成3 mmol/L的工作溶液。

3　主要方法

3.1細胞培養TPC-1細胞用含10% FBS的RMPI-1640培養液（完全培養液）在37 ℃、5% CO2及飽和濕度條件下培養。當細胞生長至80%左右時，胰酶消化，用于實驗。后續實驗中細胞均在37 ℃、5% CO2及飽和濕度條件下培養。

3.2CCK-8法檢測LH的IC50取對數生長期細胞，調整細胞密度為3×107/L，每孔100 μL接種96孔板，每組3個復孔，過夜培養。次日，棄去培養液，根據文獻［4］及前期的濃度篩選，加入含不同濃度（1.25、2.5、5、10、20、40、60、80和100 μmol/L）LH的培養液培養48 h，吸棄培養液，無菌PBS清洗3次，每孔加入10 μL CCK-8試劑和90 μL完全培養液，培養箱孵育2 h，用酶標儀在450 nm和630 nm測定吸光度（）。用GraphPad Prism 8計算LH作用于TPC-1細胞48 h的IC50，確定后續實驗LH的濃度。

3.3實驗分組按給予不同干預因素將細胞分為：（1）空白對照（control）組：完全培養液；（2）溶劑對照（DMSO）組：含0.01% DMSO的完全培養液；（3）1 μmol/L LH組：含1 μmol/L LH的完全培養液；（4）2 μmol/L LH組：含2 μmol/L LH的完全培養液；（5）4 μmol/L LH組：含4 μmol/L LH的完全培養液；（6）NAC組：含3 mmol/L NAC的完全培養液；（7）LH+NAC組：含4 μmol/L LH和3 mmol/L NAC的完全培養液。

3.4CCK-8法測定細胞活力同3.2處理細胞，設置組別同3.3，每組3個復孔，于培養0、24、48、72和96 h后吸棄培養液，分別加入10 μL CCK-8試劑和90 μL完全培養液，培養箱孵育2 h，用酶標儀在450 nm和630 nm測定值。

3. 5平板集落實驗檢測細胞增殖在6孔板中接種1 000個TPC-1細胞，放置培養箱過夜孵育。次日，吸棄培養液，用無菌PBS清洗3次，設置組別為control組、DMSO組、1 μmol/L LH組、2 μmol/L LH組和4 μmol/L LH組，每3 d更換1次培養液。培養7 d，有可見集落形成時，棄去培養液，用PBS小心清洗3次。加1 mL 4%多聚甲醛固定30 min后，加結晶紫染液于室溫染色15 min。光學顯微鏡觀察，拍照并計數細胞集落數。

3.6EdU檢測細胞增殖同3.2處理細胞，設置組別同3.5，每組3個復孔。培養48 h后，加入100 μL EdU工作液（20 μmol/L）孵育2 h，清洗3次，4%多聚甲醛室溫固定15 min；用含3% BSA的PBS洗滌3次，每次5 min；加入100 μL通透液，室溫孵育15 min；再洗滌3次，每次5 min；每孔加入100 μL點擊反應液，室溫避光孵育30 min；洗滌3次，每次5 min；每孔加入1× Hoechst 33342溶液100 μL，室溫避光孵育10 min；洗滌3次，每次5 min。用倒置熒光顯微鏡檢測分析。

3.7流式細胞術檢測MMP取對數生長期細胞3×105個接種6孔板，設置組別同3.5。培養48 h后，無菌PBS輕柔清洗3次，每孔加入1 mL胰酶消化2 min后終止，收集細胞懸液，離心棄上清。PBS洗滌1次。加入0.5 mL完全培養液和0.5 mL JC-1染色工作液重懸，顛倒混勻。細胞培養箱中孵育20 min，離心棄上清，加入1 mL預冷的JC-1染色緩沖液（1×）洗滌3次，離心棄上清，沉淀加入300 μL JC-1染色緩沖液重懸后，用流式細胞儀進行檢測分析。

3.8流式細胞術檢測細胞周期同3.7處理細胞，設置組別同3.5，培養48 h后，棄去培養液，PBS輕柔清洗2次，每孔加入1 mL胰酶消化2 min，加入培養液終止消化并收集細胞懸液，離心棄上清。用PBS再洗滌1次，離心棄上清。每個檢測樣本加入1 mL PI和10 μL破膜劑，漩渦震蕩5～10 s混勻。室溫避光孵育30 min。選擇最低上樣速度，在流式細胞儀上進行細胞周期檢測。

3.9細胞ROS水平檢測同3.7處理細胞，設置組別同3.3，培養48 h后，棄去培養液，PBS清洗3次，加入用無血清培養液配制的5 μmol/L的H2DCFDA染色液，37 ℃避光孵育30 min。孵育結束，棄去培養液，PBS清洗2次，每孔加入1 mL無血清培養液，立即用熒光顯微鏡觀察拍照；或胰酶消化重懸細胞，離心棄上清，500 μL無血清培養液重懸，立即用流式細胞儀檢測分析。

3.10Western blot實驗分析MAPK家族蛋白表達水平同3.7處理細胞，設置組別同3.3，培養48 h收集細胞，用RIPA裂解液提取蛋白，核酸蛋白儀測定其濃度后，加入5×上樣緩沖液煮沸變性，用12% SDS-PAGE進行分離，再用350 mA恒流、90min將蛋白轉印至PVDF膜，5% BSA封閉2 h，Ⅰ抗4 ℃過夜孵育；次日，TBST洗膜3次，每次15 min，HRP標記的Ⅱ抗室溫孵育1 h，TBST洗膜3次后ECL顯色，檢測MAPK家族p38 MAPK、ERK1/2和JNK蛋白表達及活化水平的變化。利用ImageJ圖像分析軟件進行分析，以目的條帶與GAPDH的灰度值比值作為目的蛋白表達的相對水平。

3.11免疫熒光檢測磷酸化p38 MAPK、ERK和JNK蛋白的分布細胞爬片輕放入24孔板中，加入1.5×104個對數生長期細胞，設置組別為DMSO組和4 μmol/L LH組，培養48 h后，用PBS洗滌3次，每次3 min；用預冷甲醛固定細胞15 min，PBS洗滌3次，每次3 min；用0.25% Triton X-100于4 ℃通透5 min，PBS洗滌3次，每次3 min；5% BSA室溫封閉1 h，棄去液體；每孔加入500 μL p-JNK抗體（1∶500）、p-p38 MAPK抗體（1∶1 000）或p-ERK抗體（1∶300），放入濕盒中，4 ℃過夜孵育；次日，棄掉Ⅰ抗，用PBS清洗細胞爬片5次，每次5 min；每孔加入300 μL Cy3標記的羊抗兔熒光Ⅱ抗（1∶200），室溫避光孵育2 h，PBS洗滌5次，每次5 min；每孔加入300 μL Hochest 33342染液，避光孵育10 min，PBS洗滌5次，每次5 min；濾紙吸干爬片多余液體，滴加5 μL熒光淬滅劑于載玻片上封片；4 ℃避光保存，熒光顯微鏡觀察結果。

4　統計學處理

所有實驗獨立重復3次。用GraphPad Prism 8軟件進行統計分析。計量資料以均數±標準差（mean±SD）表示。組間均數比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）。以<0.05為差異有統計學意義。

結果

1　鹽酸石蒜堿對TPC-1細胞增殖的影響

CCK-8實驗結果表明，LH作用細胞48 h的IC50為2.314 μmol/L（圖1A）。根據IC50確定后續實驗LH的濃度分別為1、2和4 μmol/L。LH能夠顯著地呈時間和濃度依賴性抑制TPC-1細胞的活力（圖1B）。平板集落實驗結果顯示（圖1C），LH處理組細胞集落數減少，各組細胞集落數分別為227.3±143.2（1 μmol/L LH組）、10.0±7.0（2 μmol/L LH組）、2.3±1.5（4 μmol/L LH組）、696.3±117.3（control組）和645.3±189.9（DMSO組）；且顯微鏡下集落細胞群隨LH濃度增加而變小，細胞固縮深染，各組細胞集落面積分別為（8 522.0±2 022.0） μm2（1 μmol/L LH組）、（1 302.0±74.5） μm2（2 μmol/L LH組）、（417.2±20.4） μm2（4 μmol/L LH組）、（68 608.0±34 108.0） μm2（control組）和（74 184.0±19 901.0） μm2（DMSO組）。EdU結果（圖1D）顯示，與control組和DMSO組比較，LH處理組EdU陽性細胞率下降，其中4 μmol/L LH組EdU陽性細胞率顯著下降（<0.05）。

Figure 1.Lycorine hydrochloride （LH） inhibited the proliferation of TPC-1 cells. A： IC50 of LH for TPC-1 cells after 48 h of treatment； B： CCK-8 was used to determine the effects of LH on the viability of TPC-1 cells； C： the effect of LH on plate colony formation （scale bar=100 μm）； D： Hoechst 33342 and EdU staining （scale bar=100 μm）. Mean±SD. n=3. *P<0.05，**P<0.01 vs control group； #P<0.05，##P<0.01 vs DMSO group； △P<0.05，△△P<0.01 vs 1 μmol/L LH group； &P<0.05，&&P<0.001 vs 2 μmol/L LH group.

2　LH對TPC-1細胞線粒體超微結構及MMP的影響

透射電鏡結果顯示，對照組TPC-1細胞線粒體結構完整，輪廓清晰；4 μmol/L LH處理48 h后，線粒體數量減少，線粒體完整性被破壞，表現為外膜缺損、嵴排列不規則、部分線粒體出現溶解以及基質模糊不清、線粒體變小，見圖2A。JC-1染色后流式細胞術檢測細胞MMP的變化，結果顯示，LH以劑量依賴性的方式去極化MMP，各組相對MMP分別為（6.18±0.31）% （1 μmol/L LH組）、（7.11±0.94）%（2 μmol/L LH組）、（10.62±1.87）% （4 μmol/L LH組）、（1.64±0.94）% （control組）和（1.85±0.79）% （DMSO組），去極化的膜電位增加（<0.05），見圖2B。

Figure 2.Effects of lycorine hydrochloride （LH） on mitochondrial ultrastructure and mitochondrial membrane potential of TPC-1 cells. A： the ultrastructure of the cells was observed by transmission electron microscopy （scale bar=1 μm）. In control group，the mitochondrial structure was intact and the outline was clear. The integrity of mitochondria in 4 μmol/L LH group was destroyed，which was manifested as dissolution of mitochondria in the outer membrane defect with irregular ridge arrangement and matrix blurring. B： the mitochondrial membrane potential of TPC-1 cells treated with different concentrations of LH was measured by flow cytometry. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs control group； ##P<0.01 vs DMSO group； △P<0.05 vs 1 μmol/L LH group； &&P<0.01 vs 2 μmol/L LH group.

3　LH對TPC-1細胞周期的影響

不同濃度的LH處理TPC-1細胞48 h后，細胞周期發生改變。隨著LH濃度的升高，S期細胞比例增加，G0/G1期細胞比例降低；其中2 μmol/L LH組和4 μmol/L LH組S期細胞比例顯著增加（<0.01），G0/G1期細胞比例顯著降低（<0.05）；且2 μmol/L LH組和4 μmol/L LH組相較于1 μmol/L LH組，S期細胞比例也顯著增加（<0.05），見圖3。

Figure 3.Effect of lycorine hydrochloride on the cell cycle of TPC-1. A： control group； B： DMSO group； C： 1 μmol/L lycorine hydrochloride group； D： 2 μmol/L lycorine hydrochloride group； E： 4 μmol/L lycorine hydrochloride group. Mean±SD. n=3. *P<0.05，**P<0.01 vs control group； #P<0.05，#P<0.01 vs DMSO group； △△P<0.01 vs 1 μmol/L LH group.

4　LH對TPC-1細胞ROS生成的影響

熒光顯微鏡和流式細胞術檢測結果顯示，與control組和DMSO組相比，各LH組ROS水平顯著增高（<0.01），且ROS的含量與LH濃度呈正比，其中2 μmol/L LH組和4 μmol/L LH組ROS升高更為顯著，因此選用最高濃度4 μmol/L作為后續實驗的LH組，見圖4。

Figure 4.Effect of lycorine hydrochloride （LH） on ROS production in TPC-1 cells. A： the content of ROS was observed by immunofluorescence （scale bar=100 μm）； B： the content of ROS was detected by flow cytometry； C： statistics of relative mean fluorescence intensity （RMFI）. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs control group； ##P<0.01 vs DMSO group； △△P<0.01 vs 1 μmol/L LH group； &P<0.05 vs 2 μmol/L LH group.

5　Western blot法檢測細胞MAPK通路的變化

Western blot結果顯示，隨著LH濃度的增加，p38 MAPK總蛋白和磷酸化蛋白（圖5A）、JNK總蛋白和磷酸化蛋白（圖5B）以及ERK1/2總蛋白和磷酸化蛋白（圖5C）水平均發生改變，p38 MAPK、JNK和ERK1/2隨著LH濃度的增加而被逐漸激活，磷酸化水平呈現上升趨勢（<0.05）。

6　免疫熒光檢測MAPK通路中磷酸化蛋白質的分布情況

免疫熒光結果顯示，DMSO組p-p38 MAPK、p-JNK和p-ERK1/2蛋白大部分分布于細胞質中，而LH組的p-p38 MAPK和p-ERK1/2較多出現在細胞核中，胞質中相對較少，但p-JNK仍大部分位于胞質中，且LH組比DMSO組MAPK通路的磷酸化蛋白熒光強度高，見圖6。

Figure 5.Effect of lycorine hydrochloride （LH） on p38 MAPK （A），ERK1/2 （B） and JNK （C） protein levels. Mean±SD. n=3. *P<0.05，**P<0.01 vs control group； #P<0.05，##P<0.01 vs DMSO group； △P<0.05，△△P<0.01 vs 1 μmol/L LH group； &P<0.05，&&P<0.01 vs 2 μmol/L group.

Figure 6.Intracellular localization of p-p38 MAPK，p-JNK and p-ERK1/2 detected by immunofluorescence （scale bar=100 μm）.

7　NAC和LH共處理對細胞增殖及MAPK通路的影響

活性氧清除劑NAC和LH共處理TPC-1細胞后，與LH組相比，NAC+LH組ROS含量顯著降低（<0.01），見圖7A、B；TPC-1細胞的活力顯著增加（<0.01），見圖7C；且能部分降低MAPK通路蛋白的表達水平，p38 MAPK總蛋白和磷酸化蛋白、JNK總蛋白和磷酸化蛋白以及ERK1/2磷酸化蛋白水平顯著降低（<0.05），見圖7D～F。

Figure 7.Effects of co-treatment with NAC and LH on ROS content，cell viability，and p38 MAPK，ERK1/2 and JNK protein levels in TPC-1 cells. A： the content of ROS was detected by immunofluorescence （scale bar=100 μm） and flow cytometry； B： statistics of relative mean fluorescence intensity （RMFI）； C： the viability of TPC-1 cells pretreated with NAC was determined by CCK-8 assay； D： analysis of relative expression of proteins related to p38 MAPK； E： analysis of relative expression of proteins related to JNK； F： analysis of relative expression of proteins related to ERK1/2. Mean±SD. n=3. *P<0.05，**P<0.01 vs control group； ##P<0.01 vs NAC group； △P<0.05，△△P<0.01 vs LH group.

討論

2020年全球腫瘤統計分析結果顯示，全球甲狀腺癌發病率為58.6萬例，發病率排第九［10］。據預測，2030年甲狀腺癌將取代直腸癌成為第四大腫瘤［11］。甲狀腺癌中最常見的病理類型是甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC），約占80%，且PTC近年來的發病率呈現上升趨勢［12］。雖然PTC在各型甲狀腺癌中惡性程度較低，對手術治療反應良好，治愈率高［13］；但是PTC侵襲性強，容易發生淋巴結轉移，影響患者預后［14-15］。甲狀腺激素抑制療法治療時有短期副作用和長期副作用［16-17］。因此，尋找有效而低毒的化療藥物很有必要。

近年來LH的抗腫瘤作用也受到了國內外學者的關注。目前研究顯示，LH對食管癌、黑色素瘤、乳腺癌、腎癌、卵巢癌和胃癌有抑制作用［2-7］。如LH可能通過SAPK/JNK/GSK-3β信號通路阻滯細胞在G1期，進而誘導細胞凋亡［8］；LH通過誘導卵巢癌細胞G2/M期阻滯抑制其生長［4］；LH通過上調泛素E3連接酶FBXW7，降低MCL1蛋白的穩定性，使細胞周期阻滯在S期，觸發胃癌細胞的增殖抑制［5］。由此可見，LH會導致腫瘤細胞周期紊亂，進而抑制腫瘤發生。但LH是否影響乳頭狀甲狀腺癌細胞的細胞周期，目前尚未見報道。本研究結果顯示，LH能顯著抑制TPC-1細胞增殖，細胞周期發生變化且停滯在S期，表明LH可能通過阻滯TPC-1細胞在S期，進而抑制其增殖。

MAPK通路調控多種細胞生理病理過程，包括細胞增殖、凋亡、炎癥和應激反應等，其主要包括ERK1/2、p38 MAPK、JNK和ERK5這4條主要的信號通路［18-20］。已有研究表明，ROS產生的氧化損傷釋放的端粒片段和細胞損傷物質會促進p38 MAPK的激活，最終導致細胞端?？s短、細胞周期阻滯和細胞增殖阻滯［19，21］。紫草素可促使多種癌細胞ROS的積累，導致細胞MMP喪失，JNK和p38 MAPK通路激活，進而癌細胞發生氧化應激損害后自噬、凋亡增強［22］。本研究也同樣觀察到，LH作用TPC-1細胞后，ROS含量升高，細胞周期S期阻滯，細胞活力降低，MMP呈濃度依賴性下降，同時線粒體超微結構發生改變，MAPK通路被激活且呈濃度依賴性。由此推測，LH對TPC-1細胞的作用，可能是因TPC-1細胞對ROS的清除能力下降，進而導致細胞氧化應激損傷，激活MAPK通路，并引起細胞周期阻滯和細胞增殖受阻。

腫瘤細胞中ROS累積升高也可通過其他途徑導致細胞凋亡。例如，順鉑可通過提升CNE-2Z細胞ROS水平，上調氯通道ClC-3蛋白水平，從而誘導細胞凋亡，用NAC抑制細胞產生ROS后，可緩解順鉑誘導的ClC-3蛋白表達和凋亡，而下調ClC-3蛋白表達對ROS水平影響不大［23］。本研究結果顯示，用NAC抑制TPC-1細胞ROS生成后，細胞增殖率升高，僅p38 MAPK總蛋白、JNK磷酸化蛋白及ERK1/2磷酸化蛋白表達水平降低，MAPK通路的激活被部分抑制，表明除了氧化應激導致ROS升高而激活MAPK通路外，還存在其他靶點參與了MAPK通路的激活，有待于進一步研究。

綜上所述，我們的體外實驗結果顯示，LH可濃度和時間依賴性地抑制TPC-1細胞增殖；LH濃度依賴性地升高細胞ROS水平，導致細胞S期阻滯，線粒體超微結構發生改變且MMP呈濃度依賴性下降；同時，細胞MAPK家族蛋白被激活，且用ROS清除劑NAC作用后，MAPK家族蛋白的激活受到部分抑制。該研究為LH治療乳頭狀甲狀腺癌提供了一定的體外基礎實驗數據。

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Effects of lycorine hydrochloride on proliferation and cell cycle of TPC-1 cells

HUANG Shuang，LIN Lin，YUAN Lin，ZHANG Feng-yuan，JIANG Xu-gan，CHEN Sheng-xia△

（，，212013，）

To investigate the effects of lycorine hydrochloride （LH） on the proliferation and cell cycle of thyroid papillary carcinoma TPC-1 cells and its mechanism.The TPC-1 cells were treated with LH at different concentrations （1.25，2.5，5，10，20，40，60，80 and 100 μmol/L） for 48 h，and IC50of LH for TPC-1 cells was detected by CCK-8 method. According to the IC50，TPC-1 cells at logarithmic growth stage were randomly divided into 7 groups： blank control （control） group，solvent control （DMSO） group，1 μmol/L LH group，2 μmol/L LH group，4 μmol/L LH group，NAC （3 mmol/L） group and LH （4 μmol/L）+NAC （3 mmol/L） group. The effects of LH on cell proliferation were detected by CCK-8，plate colony and EdU assays. Mitochondrial ultrastructure was observed by transmission electron microscopy，and the changes of cell cycle，reactive oxygen species （ROS） and mitochondrial membrane potential were detected by flow cytometry. The levels of MAPK family proteins （p38 MAPK，ERK1/2，JNK，p-p38 MAPK，p-ERK1/2 and p-JNK） were measured by Western blot. The intracellular localization of p-p38 MAPK，p-JNK and p-ERK1/2 was observed by immunofluorescence.（1） The proliferation of TPC-1 cells was inhibited by LH，and the inhibitory rate was proportional to the concentration and action time of LH. The IC50of LH at 48 h was 2.314 μmol/L. （2） Mitochondrial ultrastructure of TPC-1 cells changed after 4 μmol/L LH treatment，and LH depolarized mitochondrial membrane potential in a concentration-dependent manner （<0.05）. （3） The proportion of S phase in TPC-1 cells after LH treatment were significantly increased，and the proportion of G0/G1phase was significantly decreased （<0.05）. （4） The level of ROS in TPC-1 cells treated with LH was significantly higher than that in control group （<0.01）. （5） After LH treatment，the protein levels of p38 MAPK，ERK1/2，JNK，p-p38 MAPK，p-ERK1/2 and p-JNK were increased，especially the phosphorylated proteins，with a certain drug concentration dependence. Moreover，p-p38 MAPK and p-ERK showed different degrees of nuclear translocation in TPC-1 cells. （6） Partial MAPK pathway activation was inhibited by NAC pretreatment.，LH inhibits the proliferation of TPC-1 cells，damages the ultrastructure of mitochondria，depolarizes mitochondrial membrane potential，and induces S-phase arrest and ROS increase. The mechanism may be related to ROS accumulation induction and partial MAPK pathway activation.

Lycorine hydrochloride； TPC-1 cells； PCell proliferation； Cell cycle； Reactive oxygen species

R736.1； R730.23

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2022.02.013

1000-4718（2022）02-0292-11

2021-07-13

2022-01-12

［基金項目］科技部基礎平臺資助項目（No. 2019-194-30）

Tel： 0511-86102011； E-mail： chensxia@ujs.edu.cn

（責任編輯：林白霜，羅森）