人原代胎盤滋養層細胞攝取轉運模型的建立及氟西汀對胎盤P-gp轉運蛋白功能的影響*

王晶晶， 馬雯婷， 王茜， 王丹， 馬翠， 張峻△

人原代胎盤滋養層細胞攝取轉運模型的建立及氟西汀對胎盤P-gp轉運蛋白功能的影響*

王晶晶1， 馬雯婷1， 王茜1， 王丹2， 馬翠3， 張峻1△

（昆明醫科大學第一附屬醫院1臨床藥學科，2神經內科，3產科，云南 昆明 650032）

建立人胎盤滋養層細胞（以下簡稱“滋養層細胞”）轉運模型，應用該模型考察氟西汀（fluoxetine，FXT）暴露下外排轉運蛋白P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）的功能變化，探討FXT對胎盤轉運能力的影響。從足月胎盤中分離、消化、培養得到合胞體滋養層細胞，并從形態學和免疫組織化學等方面對細胞進行鑒定，應用P-gp蛋白的特異性底物羅丹明123及抑制劑維拉帕米對其功能進行評估，確定最適底物濃度及抑制劑濃度，隨后采用低、中、高濃度的FXT分別干預滋養層細胞0.5 h、48 h和72 h，應用特異性底物開展細胞攝取實驗，考查FXT對P-gp功能、蛋白表達、轉錄水平的影響。基于人胎盤滋養層攝取轉運模型，P-gp底物羅丹明123的最適濃度為1 μmol/L，抑制劑維拉帕米的最適濃度為10 μmol/L；低、中、高濃度FXT分別干預滋養層細胞0.5 h、48 h和72 h后，P-gp的底物羅丹明123在細胞內蓄積水平升高（<0.05）。FXT可顯著性下調P-gp蛋白表達（<0.05），但對P-gp mRNA水平無顯著影響（>0.05）。FXT可能通過下調P-gp的蛋白表達而抑制其外排轉運功能。

人胎盤滋養層細胞；氟西汀；P-糖蛋白；抑郁癥

世界衛生組織的數據顯示，截至2017年，全球各年齡階段約超過3.5億人患有抑郁癥［1］，發展中國家的抑郁癥患病率更甚［2-3］。妊娠期是女性特殊的生理時期，由于體內激素、免疫系統和生物節律等生理變化以及社會角色的轉變導致妊娠期抑郁癥發病率是普通人群的兩倍，女性在妊娠期間的首次患病率約為7.5%，抑郁癥復發者約占12%［4］。氟西汀（fluoxetine，FXT）作為中國抑郁障礙防治指南推薦的一線抗抑郁藥，大量研究表明妊娠期服用FXT并無致畸作用［5-7］，但是近年來有部分回顧性研究指出，妊娠期使用FXT可能造成胎兒早產、心臟畸形或神經發育遲緩等風險［8-10］，可見，FXT在妊娠期使用的安全性仍存在爭議。

胎盤是母體與胎兒之間進行物質交換的重要場所，亦是胎兒的第一道屏障。胎盤主要由羊膜、葉狀絨毛膜和底蛻膜構成，其主體部分為葉狀絨毛膜，葉狀絨毛膜從外層到內層分別是滋養層、結締組織及胎兒毛細血管。妊娠初期，胎盤中含有大量滋養層細胞，隨著妊娠的發展，滋養層細胞逐漸融合形成合胞體滋養層細胞，合胞體滋養層細胞是構成胎盤屏障的主要組成部分，其細胞膜表達了大量的轉運蛋白，這些轉運蛋白的定位受合胞體滋養層細胞極化生長影響而分布在母體側或者子體側。合胞體滋養層細胞母體側的刷狀絨毛膜上主要表達ATP結合盒轉運蛋白（ATP-binding cassette transporters，ABC），又稱ABC轉運蛋白，其中P糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）是合胞體滋養層細胞所表達的ABC轉運蛋白之一［8-10］。P-gp底物譜廣泛，包括臨床上常用的HIV蛋白酶抑制劑、抗抑郁藥和抗癲癇藥等藥物以及具有致畸作用的乙醇、尼古丁等環境毒物［11］。P-gp可將其底物從合胞體滋養層細胞泵出，外排至母體循環，從而減少有關物質對胎兒的暴露，起到保護胎兒的作用；P-gp功能異常則可能增加其底物在胎兒側的暴露量，增加安全性風險。多項研究表明妊娠早期胎盤上P-gp蛋白表達量顯著高于妊娠晚期甚至到40倍以上［12］。妊娠早期是胚胎器官分化及發育的關鍵時期，因此P-gp的功能與胚胎暴露于藥物或環境毒物等危險因素密切相關。課題組前期應用體外人類胎盤灌注模型研究發現FXT可以透過胎盤屏障（與國外小樣本體內研究結果一致），那么長期服用FXT是否會改變胎盤P-gp功能目前尚不清楚。因此，通過研究FXT對胎盤轉運能力的影響，可為妊娠期服用FXT的安全性評估提供實驗依據，同時對臨床妊娠期抑郁癥患者開展藥物治療具有重要的指導意義。

材料和方法

1　材料

1.1胎盤組織由昆明醫科大學第一附屬醫院婦產科提供，胎盤在獲取前經由產婦及其家屬知情同意，并簽署胎盤處置告知書。選取足月（37～41周）自然分娩或剖宮產娩出的新鮮健康胎盤，排除需進行病理學檢查、產婦自留、產婦有基礎疾病且放置時間過久（放置時間>1 h）的胎盤。收集的胎盤立即放入4 ℃含1%青霉素-鏈霉素-兩性霉素B（penicillin-streptomycin-amphotericin B solution，PSN）混合液的生理鹽水中，并在0.5 h內轉移至實驗室進行細胞提取。

1.2試劑及儀器DMEM/high glucose（HyClone）；胰蛋白酶、PSN溶液、小牛血清（Gibco）；DNaseI酶（Sigma）；胎牛血清（BI）；Percoll分離液（GE Healthcare Bio-Sciences）。生物安全柜（中國山東博科生物產業有限公司）；Water-Jacketed二氧化碳培養箱（Thermo）；倒置顯微鏡DMi1（Leica）；酶標儀（Molecular Devices）；高速低溫離心機（Eppendorf）；臺式離心機（中國上海安亭科學儀器廠）。

2　方法

2.1滋養層細胞提取在無菌操作臺中，將胎盤剪成2～3 cm3的小塊狀，無菌手術剪去除組織的蛻膜、羊膜、血管及血塊，生理鹽水反復沖洗組織至表面呈淡粉色，隨后，載玻片刮取組織至肉糜狀，再次去除其中血塊、血管及鈣化部分，取120 g肉糜狀組織，加入150 mL含1% PSN、胰酶以及DNase I的DMEM高糖培養基，置于37 ℃水浴搖床中進行第1次消化，時間為20 min，消化后的肉糜組織用350目網篩過濾，棄去第1次消化液，保留濾渣，加入150 mL上述消化液進行第2次消化（20 min），然后用350目網篩過濾，保留消化液并加入小牛血清以終止消化，消化液在常溫狀態以1 260×離心15 min，棄去上清液并加入含1% PSN、10%胎牛血清的DMEM高糖培養基（即完全培養基）重懸細胞。

2.2滋養層細胞分離純化采用Percoll連續密度梯度分離法進行細胞分離，在50 mL離心管中緩慢的依次加入5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%和65%共13個密度梯度的Percoll溶液，每個濃度3 mL。將細胞懸液緩慢加至Percoll分離液上，常溫狀態1 340離心20 min，取離心管20%～30%位置（即密度為1.04～1.06 g/mL）的云霧狀細胞（即滋養層細胞）轉移至新離心管中，加入適量完全培養基進行重懸，室溫狀態1 200 r/min離心5 min，棄去上清液，加5 mL完全培養基將所得細胞充分混勻，隨后進行細胞計數，按照2×109/L種于6孔板，置于細胞孵育箱中培養。

2.3滋養層細胞鑒定（1）免疫組化分析檢測細胞滋養層細胞的標志物E-鈣粘蛋白（E-cadherin）和細胞角蛋白7（cytokeratin-7）［4，9］：在細胞培養4 h及72 h時，取出置于6孔板中的細胞爬片，冰PBS清洗3次，在4%多聚甲醛中固定15 min，0.1%Triton X-100孵育20 min，加入含5% BSA的PBS孵育細胞1 h以阻斷可能存在的非特異性染色。隨后，分別加入鼠抗人cytokeratin-7及鼠抗人E-cadherin單克隆抗體在4 ℃孵育過夜。PBS清洗細胞3次，加入生物素標記的Ⅱ抗并在37 ℃孵育1 h，PBS清洗后，DAB顯色，蘇木精復染并用乙醇脫水，晾干封固，鏡下觀察并拍照。（2）滋養層細胞功能分化的主要標志物人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，hCG）［11］含量的測定：分別在12 h、24 h、36 h、48 h及60 h取出6孔板內的培養基，將其送至昆明醫科大學第一附屬醫院核醫學科進行分析測定。

2.4滋養層細胞P-gp功能的評估應用P-gp特異性底物羅丹明123在加或不加抑制劑情況下進行滋養層細胞攝取實驗，以考查滋養層細胞中轉運蛋白的功能。將提取的滋養層細胞以1×108/L接種到96孔板中培養72 h，預熱HBSS清洗細胞2次，再孵育細胞15 min以排除培養基對細胞可能產生的影響。隨后，加入P-gp抑制劑維拉帕米（0、2.5、5和10 μmol/L）預孵育0.5 h，再加入羅丹明123（1、2和5 μmol/L）于37 ℃、5% CO2孵箱中孵育90 min，冰PBS清洗細胞2次以終止反應，加入100 μL裂解液（1% Triton X-100）裂解細胞后進行熒光測定。

2.5FXT對滋養層細胞P-gp功能的影響根據FXT血藥濃度峰值確定了使用低、中、高（200 μg/L、600 μg/L和1 800 μg/L）共3個濃度的FXT孵育滋養層細胞，分別孵育0.5 h、48 h和72 h。待孵育結束后，再加入最適濃度P-gp底物羅丹明123孵育90 min，棄去廢液，冰PBS清洗細胞2次，隨后每孔加入1% Triton X-100裂解液100 μL裂解細胞后進行熒光測定。

2.6FXT對滋養層細胞P-gp蛋白表達的影響使用200、600和1 800 μg/L共3個濃度的FXT孵育滋養層細胞，分別孵育0.5 h和48 h。待孵育結束，每孔加入150 μL RIPA裂解液進行裂解，收集上清液進行蛋白定量及Western blot實驗，檢測滋養層細胞轉運蛋白P-gp蛋白的表達。

2.7FXT對滋養層細胞P-gp轉錄水平的影響利用RT-qPCR技術對滋養層細胞上轉運蛋白P-gp的mRNA水平進行檢測，引物見表1。

表1　RT-qPCR引物

3　統計學處理

采用GraphPad Prism 8.0作圖。實驗數據以均數±標準差（mean±SD）表示，采用雙因素方差分析（two-way ANOVA）進行統計學分析，以<0.05為差異有統計學意義。

結果

1　細胞形態學觀

鏡下觀察所提取的滋養層細胞，培養4 h后可見均一、圓形的單核細胞開始貼壁生長；培養72 h后可見單核細胞融合為多核的合胞體滋養層細胞并連接成片生長，見圖1。

Figure 1.Microscopic observation of primary trophoblast cells. After cultured for 72 h，the cytotrophoblasts consistently transformed into syncytiotrophoblasts.

2　免疫組化細胞鑒定

由圖2可見，與培養4 h的細胞相比，培養72 h的滋養層細胞基本分化為合胞體滋養層細胞，E-cadherin定位于合胞體滋養層細胞的細胞膜表面，cytokeratin-7則多分布于合胞體滋養層細胞內部。

Figure 2.Expression of E-cadherin and cytokeratin-7 on the surface of isolated trophoblast cells. Representative images （×200） of E-cadherin or cytokeratin-7 （red） in the syncytiotrophoblasts after 4 h and 72 h of culture were showed.

3　hCG含量的測定

收集12 h、24 h、36 h、48 h、60 h和72 h滋養層細胞培養基上清液檢測hCG含量，結果顯示，隨著時間延長，hCG含量逐漸升高，可確定所提取的細胞為合胞體滋養層細胞，見圖3。

Figure 3.Secretion of hCG by cultured trophoblasts at different time points. The hCG was concomitant with increasing numbers of syncytiotrophoblasts. Mean±SD. n=3.

4　外排轉運蛋白P-gp的功能驗證

使用P-gp的特異性底物羅丹明123和抑制劑維拉帕米進行滋養層細胞轉運蛋白功能的驗證并確定不同轉運蛋白的最適底物濃度和抑制劑濃度，結果見圖4。

當羅丹明123濃度為1和2 μmol/L時，隨著維拉帕米濃度的升高，細胞內羅丹明123含量逐漸增加，表明P-gp外排轉運功能受到抑制，所提取滋養層細胞的P-gp外排功能正常；當羅丹明123濃度為5 μmol/L時，隨著維拉帕米濃度升高細胞內羅丹明123未出現明顯升高的趨勢，推測底物在該濃度下已過飽和。因此羅丹明123最適濃度為1 μmol/L，維拉帕米最適濃度為10 μmol/L（<0.01）。

Figure 4.Verification of P-gp transplacental capability. Mean±SD. n=3. *P<0.05，**P<0.01 vs 0μmol/L verapamil group.

5　FXT對滋養層細胞P-gp功能的影響

低、中、高濃度FXT與滋養層細胞共孵育0.5 h、48 h和72 h后，應用羅丹明123進行細胞攝取實驗以評估轉運蛋白的功能。結果顯示，與空白對照組比，中濃度FXT干預48 h后細胞內羅丹明123顯著性升高（<0.05），表明在FXT的干預下P-gp外排功能受到抑制，見圖5。

Figure 5.The effect of FXT on transporter fuction of P-gp in primary human trophoblast cells. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs0 μg/L FXT group.

6　FXT對P-gp蛋白表達和mRNA水平的影響

低、中、高濃度FXT與滋養層細胞共孵育0.5 h和48 h后，分析P-gp的mRNA轉錄及蛋白表達水平的變化，結果見圖6。

（1）與空白對照組相比，FXT干預0.5 h后，P-gp蛋白的表達水平隨FXT濃度的升高而升高，其中低濃度組與高濃度組差異均具有統計學意義；P-gp的mRNA水平隨FXT濃度升高而先升高后降低，但差異無統計學顯著性。與空白對照組相比，高濃度FXT干預48 h后，P-gp蛋白的表達水平隨FXT濃度的升高而顯著性降低（<0.01）；P-gp的mRNA轉錄水平隨FXT濃度升高先升高后降低，但差異無統計學顯著性，見圖6。

Figure 6.Relative protein （A and B） and mRNA （C and D） expression levels of P-gp after FXT intervention for 0.5 h （A and C） or for 48 h （B and D）. Mean±SD. n=5. *P<0.05，**P<0.01 vs 0 μg/L FXT group.

討論

妊娠期抑郁癥輕者易引起妊娠劇吐、自發性流產、產后出血等并發癥［5］，重者可能增加產婦的自殺風險［6］；另一方面，抑郁情緒亦可能對胎兒產生影響，導致胎兒早產、新生兒低出生體重［7-9］以及影響學前初期孩童大腦神經的發育［10］。因此，妊娠期抑郁癥的治療顯得尤為重要。妊娠期抑郁癥常使用的治療方法包括心理治療、藥物治療和物理療法等。對于輕度妊娠期抑郁患者而言可首選心理治療。原發中重度妊娠期抑郁癥患者或懷孕前已在使用藥物治療的抑郁癥患者則首選藥物治療合并心理療法作為治療方案。藥物治療可以顯著改善中重度妊娠期抑郁患者的癥狀，其有效率可達60%～70%［11］。氟西汀是目前妊娠期抗抑郁治療中使用較多的藥物之一［12-14］，但其妊娠安全性尚存在爭議［15-18］。

P-gp是胎盤合胞體滋養層細胞上表達較多的外排轉運蛋白之一，P-gp底物譜廣，包括各種藥物及環境毒物等，其可將底物外排至母體側。在妊娠早期也就是發育敏感期，P-gp在合胞體滋養層的表達量遠遠高于妊娠晚期，因此，P-gp的功能在一定程度上與胎盤的功能及子代安全性密切相關。針對合胞體滋養層細胞相關研究的細胞類型有原代培養滋養層細胞和BeWo、JAR及JEG-3等細胞系，細胞系來源于癌細胞且P-gp的表達量較低，幾乎都不表達［19］。因此，本研究采用原代合胞體滋養層細胞開展研究。原代合胞體滋養層細胞提取效率受多種因素影響，本研究應用Percoll連續密度梯度分離法［20］提取分離合胞體滋養層細胞，并通過胎盤篩選等方法大大提高了細胞提取分離效率及細胞活性。首先，在選取胎盤時，將妊娠女性生理狀況、飲食習慣和基礎疾病等情況考慮在內，排除體重指數異常、患有基礎疾病及未能正常膳食等妊娠女性的胎盤，以提高滋養層細胞的提取效率及活性；其次，實驗發現胎盤分娩后0.5 h內且放置時間不超過1 h的新鮮胎盤，其細胞提取效率和活性比分娩后長時間放置的更高。實驗結果發現當FXT低中高濃度與胎盤滋養層細胞共孵育0.5 h后，P-gp的mRNA和蛋白表達水平均有升高趨勢，其原因可能為：短期的FXT暴露，細胞出于自我保護機制逐漸上調P-gp mRNA的表達來增加蛋白的外排作用，從而減少外源性物質的暴露［21］。但隨時間增加，特別是在48 h高濃度組中P-gp的mRNA轉錄水平、蛋白表達均受到抑制。進一步對P-gp的功能進行驗證，發現長時間暴露于FXT后胎盤滋養層細胞內羅丹明123的水平顯著升高，表明其功能受到抑制，該結果與mRNA轉錄水平及蛋白表達水平一致。在發育敏感期的妊娠早期，胎盤高表達P-gp有助于減少胚胎外源性物質的暴露達到保護胚胎正常發育的目的。目前，在胎盤上進行FXT對P-gp轉運功能影響的研究較少，僅有部分血腦屏障上的研究表明FXT可輕度抑制血腦屏障上P-gp的功能［22］。P-gp轉錄及蛋白表達水平受多種核受體及轉錄因子調控，包括孕烷X受體（pregnane X receptor，PXR）和雌激素受體等。PXR是配體依賴性轉錄因子，其結構包括配體結合域和DNA結合域，當配體與PXR結合后，復合物可與視黃醛X受體結合，之后形成的異二聚體可調控靶基因的轉錄與表達［23］。近年來有研究發現，FXT可下調PXR的表達，并在轉錄水平抑制PXR［24］。由此推測FXT可能通過影響PXR的表達從而抑制P-gp的功能；此外，雌二醇可通過與雌二醇β受體結合影響P-gp的轉錄與表達［25］，而部分動物研究發現FXT可通過5-羥色胺-雌激素系統降低體內雌二醇水平，因此FXT亦可能通過5-羥色胺-雌二醇系統影響P-gp的轉錄、表達及功能［26］。

因此，根據本文實驗結果可知妊娠期長時間暴露于FXT可能改變胎盤屏障上外排轉運蛋白的功能，從而帶來妊娠安全性風險。

［1］ World Health Organization. Depression and other common mental disorders： global health estimates［M］. Geneva： World Health Organization，2017.

［2］ Huang YQ，Wang Y，Wang H，et al. Prevalence of mental disorders in China： a cross-sectional epidemiological study［J］. Lancet Psychiatry，2019，6（3）：211-224.

［3］ Evans J，Heron J，Francomb H，et al. Cohort study of depressed mood during pregnancy and after childbirth［J］. BMJ，2001，323（7307）：257-260.

［4］ Bloch M，Daly RC，Rubinow DR. Endocrine factors in the etiology of postpartum depression［J］. Compr Psychiatry，2003，44（3）：234-246.

［5］ Oberlander TF，Warburton W，Misri S，et al. Neonatal outcomes after prenatal exposure to selective serotonin reuptake inhibitor antidepressants and maternal depression using population-based linked health data［J］. Arch Gen Psychiatry，2006，63（8）：898-906.

［6］ Shi P，Ren H，Li H，Dai Q. Maternal depression and suicide at immediateprenatal and early postpartum periods and psychosocial risk factors［J］. Psychiatry Res，2018，261：298-306.

［7］ Nordentoft M，Lou HC，Hansen D，et al. Intrauterine growth retardation and prematuredelivery： the influence of maternal smoking and psychosocial factors［J］. Am J Public Health，1996，86（3）：347-354.

［8］ Doyle LA，Yang W，Abruzzo LV，et al. A multidrug resistance transporter from human MCF-7 breast cancer cells［J］. Proc Natl Acad Sci U S A，1998，95（26）：15665-15670.

［9］ Thiebaut F，Tsuruo T，Hamada H，et al. Cellular localization of the multidrug-resistance gene product P-glycoprotein in normal human tissues［J］. Proc Natl Acad Sci U S A，1987，84（21）：7735-7738.

［10］ Maliepaard M，Scheffer GL，Faneyte IF，et al. Subcellular localization and distribution of the breast cancer resistance protein transporter in normal human tissues［J］. Cancer Res，2001，61（8）：3458-3464.

［11］ Staud F，Ceckova M，Micuda S，et al. Expression and function of p-glycoprotein in normal tissues： effect on pharmacokinetics［J］. Methods Mol Biol，2010，596：199-222.

［12］ V?h?kangas K，Myllynen P. Drug transporters in the human blood-placental barrier［J］. Br J Pharmacol，2009，158（3）：665-678.

［13］ Weisskopf E，Fischer CJ，Bickle Graz M，et al. Risk-benefit balance assessment of SSRI antidepressant use during pregnancy and lactation based on best available evidence［J］. Expert Opin Drug Saf，2015，14（3）：413-427.

［14］ Gentile S. Drug treatment for mood disorders in pregnancy［J］. Curr Opin Psychiatry，2011，24（1）：34-40.

［15］ Gao SY，Wu QJ，Sun C，et al. Selective serotonin reuptake inhibitor use during early pregnancy and congenital malformations： a systematic review and meta-analysis of cohort studies of more than 9 million births［J］. BMC Med，2018，16（1）：205.

［16］ Gao SY，Wu QJ，Zhang TN，et al. Fluoxetine and congenital malformations： a systematic review and meta-analysis of cohort studies［J］. Br J Clin Pharmacol，2017，83（10）：2134-2147.

［17］ Millard SJ，Weston-Green K，Newell KA. The effects of maternal antidepressant use on offspring behaviour and brain development： implications for risk of neurodevelopmental disorders［J］. Neurosci Biobehav Rev，2017，80：743-765.

［18］ O'Brien FE，Clarke G，Dinan TG，et al. Human P-glycoprotein differentially affects antidepressant drug transport： relevance to blood-brain barrier permeability［J］. Int J Neuropsychopharmacol，2013，16（10）：2259-2272.

［19］ Iqbal M，Audette MC，Petropoulos S，et al. Placental drug transporters and their role in fetal protection［J］. Placenta，2012，33（3）：137-142.

［20］ Kliman HJ，Nestler JE，Sermasi E，et al. Purification，characterization，and in vitro differentiation of cytotrophoblasts from human term placentae［J］. Endocrinology，1986，118（4）：1567-1582.

［21］ Han LW，Gao C，Mao Q. An update on expression and function of P-gp/ABCB1 and BCRP/ABCG2 in the placenta and fetus［J］. Expert Opin Drug Metab Toxicol，2018，14（8）：817-829.

［22］ Weiss J，Dormann SM，Martin-Facklam M，et al. Inhibition of P-glycoprotein by newer antidepressants［J］. J Pharmacol Exp Ther，2003，305（1）：197-204.

［23］ Han LW，Gao C，Mao Q. An update on expression and function of P-gp/ABCB1 and BCRP/ABCG2 in the placenta and fetus［J］. Expert Opin Drug Metab Toxicol，2018，14（8）：817-829.

［24］ Shang W，Liu J，Chen R，et al. Fluoxetine reduces CES1，CES2，and CYP3A4 expression through decreasing PXR and increasing DEC1 in HepG2 cells［J］. Xenobiotica，2016，46（5）：393-405.

［25］ Paxton JW，Keelan JA. Independent regulation of apical and basolateral drug transporter expression and function in placental trophoblasts by cytokines，steroids，and growth factors［J］. Drug Metab Dispos，2007，35（4）：595-601

［26］ Hudon Thibeault AA，Sanderson JT，Vaillancourt C. Serotonin-estrogen interactions： what can we learn from pregnancy？［J］. Biochimie，2019，161：88-108.

Establishment of human placental trophoblasts cell transport model and influence of fluoxetine on P-gp function in placenta

WANG Jing-jing1，MA Wen-ting1，WANG Xi1，WANG Dan2，MA Cui3，ZHANG Jun1△

（1，，650032，；2，，650032，；3，，650032，）

To establish a placental transport model with primary human placental trophoblasts （hereinafter referred to as "trophoblast cells"） and investigate the influence of fluoxetine （FXT） on the function of P-glycoprotein （P-gp） during pregnancy and the transporter involved.The primary human placenta trophoblast cells were isolated and validated by morphological observation and immunocytochemical staining. Rhodamine 123，the specific substrates were used to assess the functions of P-gp and to find out the optimal concentrations of substrate and inhibitor. A serials concentration of FXT were incubated with trophoblast cells for 0.5 h，48 h and 72 h and then the function of P-gp and BCRPwere assessed with specific substrate uptake assay.The function of P-gp was conducted with specific substrate and inhibitor. For P-gp the optimal concentration of substrate was 1 μmol/L and the optimal concentration of inhibitors was 10 μmol/L. The cellular accumulation of Rhodamine123 in trophoblast cells was significantly increased after incubation FXT for 0.5 h，48 h and 72 h（<0.05）. FXT significantly inhibited the trans-placental transport of P-gp and BCRP. The protein expression of P-gp was significantly downregulated in the presence of FXT （<0.05）.The exposure of FXT may inhibit the expression and function of P-gp.

Human placental trophoblasts； Fluoxetine； P-glycoprotein； Depression

R329.21+1； R749.1

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2022.02.016

1000-4718（2022）02-0318-07

2021-08-09

2021-12-24

［基金項目］云南省科技廳-昆明醫科大學應用基礎研究聯合專項資金項目［No. 2018FE001（-167）； No. 2018FE001（-207）； No. 2019FE001（-208）］；云南省高層次衛生計生技術人才培養專項經費資助（No. H-2017050）

Tel： 0871-65324888-2550； E-mail： zhangjunyang@126.com

（責任編輯：宋延君，余小慧）