小鼠骨髓源性巨噬細胞極化的體外誘導方法探究*

辛嘉萁， 許小凡， 段麗芳， 范建偉， 吳楠， 張紅，2△

·實驗技術·

小鼠骨髓源性巨噬細胞極化的體外誘導方法探究*

辛嘉萁1， 許小凡1， 段麗芳1， 范建偉1， 吳楠3， 張紅1，2△

（1陜西中醫藥大學，陜西 咸陽 712046；2陜西省免疫炎癥相關疾病中醫藥防治國際聯合研究中心，陜西 咸陽 712046；3慕尼黑工業大學伊莎河右岸醫院胰腺病研究所，德國 慕尼黑 81675）

探究小鼠骨髓前體細胞體外誘導成為不同極化狀態（M1和M2）巨噬細胞的優化方法。健康C57BL/6小鼠麻醉處死，收集其股骨和脛骨腔內容物，經篩網過濾、紅細胞裂解后，在RPMI-1640完全培養基中培養16h，收集未貼壁的骨髓前體細胞重新接種于6孔板。根據培養基中所加刺激劑的種類、劑量不同進行實驗分組，于不同時點收集細胞，光鏡下觀察各組細胞形態學變化，流式細胞術及RT-qPCR檢測不同極化狀態巨噬細胞的相應標志物。（1）小鼠骨髓前體細胞經50 μg/L巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF）刺激72 h后，CD11b陽染率達到90%以上；刺激96 h后，F4/80的陽染率達到95%以上。40 μg/L的粒-巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）刺激96 h后，CD11b陽染率也達到了90%以上，F4/80陽染率至144 h達到峰值（58.2%）；（2）在M-CSF刺激所得單核-巨噬細胞的基礎上，給予M1型巨噬細胞誘導劑（25 μg/L LPS和10 μg/L IFN-γ）刺激24 h，可見CD86的陽染率大于90%；給予M2型巨噬細胞誘導劑（20 μg/L IL-4和IL-13）刺激后CD206的陽染率始終處于較低水平（10%左右）；（3）在GM-CSF刺激的基礎上，給予M1型巨噬細胞誘導劑刺激24 h，可見CD86的陽染率大于90%；而當細胞接受M2型巨噬細胞誘導劑刺激96 h，CD206的陽染率達68.98%；（4）RT-qPCR結果顯示在給予相應極化誘導劑刺激后，M1型巨噬細胞標志物誘導型一氧化氮合酶（iNOS）、白細胞介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、IL-12，以及M2型巨噬細胞標志物：幾丁質酶3樣蛋白3（Chi3l3/Ym1）、甘露糖受體（MR）和精氨酸酶1（Arg-1）的mRNA表達均明顯高于對照組（<0.01）。（1）C57BL/6小鼠骨髓前體細胞受到M-CSF或GM-CSF誘導后90%以上細胞均可向單核細胞分化，M-CSF可誘導90%以上的細胞為成熟巨噬細胞，GM-CSF可誘導58%的細胞為成熟巨噬細胞；（2）在M-CSF前期誘導的基礎上，聯合LPS和IFN-γ易于誘導出M1型巨噬細胞，但聯合IL-4和IL-13難以獲得M2型巨噬細胞；（3）在GM-CSF前期誘導的基礎上，聯合LPS和IFN-γ易于誘導出M1型巨噬細胞，聯合IL-4和IL-13也可將大部分細胞誘導成為M2型巨噬細胞。

小鼠骨髓前體細胞；巨噬細胞極化；M1型巨噬細胞；M2型巨噬細胞

巨噬細胞是人體重要的免疫細胞，在生命活動中具有重要的生理和病理功能。近年來的研究發現，巨噬細胞在不同組織微環境中表型和功能會發生相應改變，這種現象被稱為巨噬細胞的極化［1-2］。極化后的巨噬細胞主要分為M1型和M2型巨噬細胞兩種表型［3-4］。大量實驗證實，不同極化狀態的巨噬細胞由于分泌的細胞因子不同，在疾病進展中發揮著不同的作用，深入認識不同極化類型巨噬細胞的作用已經成為多種疾病發病機制的研究熱點［5-10］。

然而，如何獲得足量、確切的極化巨噬細胞是保障大量相關研究順利進展的基礎。目前已有幾種體外分離誘導巨噬細胞極化的方法，但是尚未形成確切且統一的結論，不同文獻所提供的巨噬細胞極化誘導的方法存在較大差異［11-16］。這一現狀使相關科研人員無法參照穩定的實驗方法，增加了極化巨噬細胞相關研究的難度。因此，當前尋找一種穩定可靠的極化巨噬細胞體外誘導方法具有十分重要的意義。本實驗通過體外分離培養C57BL/6小鼠骨髓前體細胞，使用不同的刺激劑，觀察鑒定各個刺激劑作用不同時間后巨噬細胞表型的變化，進而優選出C57BL/6小鼠骨髓源性巨噬細胞極化的體外誘導方法，為巨噬細胞極化相關的實驗研究奠定基礎。

材料和方法

1　主要藥品及試劑

巨噬細胞集落刺激因子（macrophage colony-stimulating factor，M-CSF； #315-02-10UG）、粒-巨噬細胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF； #315-03-50UG）、干擾素γ（interferon-γ，IFN-γ； #315-05-20UG）、白細胞介素4（interleukin-4，IL-4； #081449）和IL-13（#1111207）均購于PeproTech；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS； 大腸桿菌055：B5，L6529）購于Sigma-Aldrich；各種鑒定用抗體，包括抗F4/80-IgG（4342459）、F4/80抗體（4329362）、抗CD11b-IgG（7194822）、CD11b抗體（7187553）、抗CD86-IgG（2234523）、CD86抗體（7075951）、CD206-IgG（7173965）和CD206（7195936）抗體均購于BD。

2　實驗方法

2.1C57BL/6小鼠骨髓前體細胞的分離培養健康的雄性C57BL/6小鼠20只，6～8周齡，體重20～25 g，購于四川成都達碩實驗動物有限公司［SCXK（川）2020-030］，在（22±2）℃的環境中自由取食飲水，適應性飼養1周后，進行以下操作：麻醉小鼠，浸泡于75%的乙醇中5 min。隨后將小鼠固定于無菌鼠板（注意不要破壞小鼠的脛骨和股骨），使用無菌剪刀和鑷子將小鼠腿部外皮剪開，剔除部分肌肉組織，將脛骨和股骨完整取下，置于RPMI-1640培養基中剔除殘余組織后將脛骨和股骨兩端剪開，用RPMI-1640培養基沖洗其內腔，收集沖洗液200目無菌篩網過濾，收集液體離心（1 000×，5 min），在沉淀中加入3 mL紅細胞裂解液混勻，室溫靜置3～5 min，加入3 mL完全1640培養基（含10%胎牛血清）終止裂解。經RPMI-1640清洗兩遍（1 000×，5 min），用完全RPMI-1640培養基重懸細胞，接種于細胞培養皿，置于37 ℃、5% CO2培養箱16 h后，收集培養皿中未貼壁的細胞，以5×105/mL密度接種于6孔板中用于后續實驗。

2.2C57BL/6小鼠骨髓前體細胞誘導極化實驗分組及操作參照已有的相關文獻［13，15-16］，初步選定了誘導劑的類型、劑量和刺激時間進行實驗。

2.2.1誘導C57BL/6小鼠骨髓前體細胞向單核-巨噬細胞分化首先采用含有M-CSF（50 μg/L）或GM-CSF（40 μg/L）的完全RPMI-1640培養基刺激小鼠骨髓前體細胞，于不同時點收集細胞，流式細胞術檢測小鼠單核細胞表面標志物CD11b和小鼠成熟巨噬細胞的表面標志物F4/80，確定體外誘導小鼠骨髓前體細胞分化為單核-巨噬細胞的最優方法。

2.2.2誘導C57BL/6小鼠骨髓來源的單核-巨噬細胞向M1或M2型巨噬細胞極化在成功得到由M-CSF或GM-CSF誘導分化的單核-巨噬細胞的基礎上，給予M1型巨噬細胞的誘導劑（25 μg/L LPS和10 μg/L IFN-γ）及M2型巨噬細胞的誘導劑（20 μg/L IL-4和20 μg/L IL-13）刺激，于不同時點收集細胞，流式細胞術檢測小鼠不同極化類型巨噬細胞的表面標志物（M1型CD86、M2型CD206）。進一步使用RT-qPCR的方法檢測不同極化類型巨噬細胞標志物mRNA的表達，M1型標志物誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）、IL-6、TNF-α和IL-12，M2型標志物幾丁質酶3樣蛋白3（chitinase 3-like protein 3，Chi3l3/Ym-1）、甘露糖受體（mannose receptor，MR）和精氨酸酶1（arginase 1，Arg-1）。

2.3流式細胞術鑒定細胞表型在相應時點使用PBS清洗孔內細胞2遍，每孔加入2%的胰蛋白酶消化液，于37 ℃培養箱中消化2 min后收集各組細胞，加入相應的流式抗體，于4 ℃避光孵育0.5 h。PBS清洗2遍，鞘液重懸細胞，200目濾網過濾后上機檢測。

2.4RT-qPCR檢測M1及M2型巨噬細胞相關基因的mRNA表達提取各組細胞總RNA進行逆轉錄，以GAPDH為內參照、cDNA為模板進行PCR，采用2-ΔΔCt法定量比較Ct值，計算目的基因的相對表達量。M1及M2型巨噬細胞相關引物序列如表1所示。

表1　RT-qPCR鑒定不同極化類型巨噬細胞的引物序列

3　統計學處理

所有實驗數據均采用SPSS 13.0統計軟件進行處理，計量數據采用均數±標準差（mean±SD）表示，多組間比較采用單因素方差分析，以<0.05表示差異有統計學意義。

結果

1　M-CSF和GM-CSF誘導C57BL/6小鼠骨髓前體細胞向單核-巨噬細胞分化

1.1M-CSF和GM-CSF刺激C57BL/6小鼠骨髓前體細胞的形態變化如圖1所示，分離出的小鼠骨髓前體細胞在未加入M-CSF和GM-CSF培養24 h后，大部分呈懸浮生長，形狀為不規則或圓形透明狀。隨著培養時間不斷延長，于培養48 h后發現細胞碎片逐漸增多。至96 h僅有少部分細胞貼壁生長，細胞形態呈不規則形；采用50 μg/L的M-CSF刺激48 h即可見到部分細胞呈貼壁生長，但與最初分離出的細胞形態差異不大。培養72 h后大部分細胞貼壁生長，細胞形態發生明顯變化，由最初的圓形逐漸轉化成不規則多邊形、長梭形，細胞開始增殖；采用40 μg/L GM-CSF刺激48 h后，部分細胞貼壁生長，細胞形態仍維持在圓形或類圓形，培養至72 h后，大部分細胞呈不規則形，且出現成團生長的情況。

Figure 1.Phenotypic changes of bone marrow precursor cells from C57BL/6 mice stimulated with M-CSF or GM-CSF at different time points （×200）.

1.2M-CSF和GM-CSF刺激小鼠骨髓前體細胞流式鑒定結果如圖2、3所示，50 μg/L M-CSF刺激小鼠骨髓前體細胞72、96和120 h后，流式細胞術檢測小鼠單核細胞表面標志物CD11b，發現刺激72 h后，90%以上的細胞呈現CD11b陽性表達；而成熟小鼠巨噬細胞表面標志物F4/80的陽性表達率隨著時間的延長不斷增高，于刺激96 h后達到峰值（≥90%）。

Figure 2.Flow cytometry results of CD11b and F4/80 in C57BL/6 mouse bone marrow precursor cells induced by M-CSF at different time points. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs control group.

Figure 3.Flow cytometry results of F4/80 and CD11b in mouse bone marrow precursor cells stimulated with M-CSF after 96 h.

如圖4、5流式細胞術檢測結果所示，小鼠骨髓來源的前體細胞經40 μg/L GM-CSF刺激96 h后，CD11b陽染率始終維持在90%以上，但F4/80陽染率僅為8.86%，進一步延長刺激時間，F4/80陽染率在120 h略有升高、至144 h達到峰值（58.2%），隨后呈下降趨勢。

Figure 4.Flow cytometric results of CD11b and F4/80 in bone marrow precursor cells from C57BL/6 mice induced by GM-CSF at different time points. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs control group.

Figure 5.Flow cytometry result of CD11b and F4/80 in mouse bone marrow precursor cells after GM-CSF stimulation （representative result of 144 h）.

2　不同刺激劑誘導單核-巨噬細胞向M1、M2型極化

2.1M-CSF誘導的單核-巨噬細胞經LPS & IFN-γ或IL-4 & IL-13刺激后極化表型改變收集M-CSF刺激96 h后的單核-巨噬細胞，分別給予M1誘導劑（25 μg/L的LPS和10 μg/L的IFN-γ）和M2誘導劑（20 μg/L的IL-4和IL-13），觀察細胞的形態學及用流式細胞術檢測陽染率的變化。

如圖6所示，單核-巨噬細胞經M1誘導劑刺激24 h，發現大部分細胞形態呈長梭形，與文獻報道的M1型巨噬細胞形態基本吻合；但M2誘導劑刺激24 h，大部分細胞的形態變化不大，沒有呈現出文獻報道的M2型巨噬細胞所特有的荷包蛋形。進一步延長刺激時間至48 h，細胞形態依然未發生明顯變化，72 h和96 h少量細胞呈現類荷包蛋型，但是細胞數量明顯減少。

Figure 6.The morphological changes of M-CSF-induced monocyte-macrophages at different time points after stimulation with LPS & IFN-γ or IL-4 & IL-13 （×200）.

如圖7、8所示，進一步采用流式細胞術檢測發現，M1誘導劑刺激24 h后大部分細胞表達小鼠M1型巨噬細胞的表面標志物CD86，陽染率可達到96.81%，與對照組相比存在顯著差異。而M2誘導劑于不同時點刺激后，小鼠M2型巨噬細胞的表面標志物CD206陽染率均低于15%，除了72 h，其余時點與對照組相比沒有明顯變化。

Figure 7.Flow cytometry results of M-CSF-induced mouse monocyte-macrophages stimulated with LPS & IFN-γ for 24 h or IL-4 & IL-13 for 24 to 96 h. MeanSD. n=3. **P<0.01 vs control group.

Figure 8.Representative images of flow cytometry for analyzing M-CSF-induced monocyte-macrophages stimulated with LPS & IFN-γ for 24 h （A） or IL-4 & IL-13 for 72 h （B）.

2.2GM-CSF誘導的單核-巨噬細胞經LPS & IFN-γ或IL-4 & IL-13刺激后，極化表型改變收集GM-CSF刺激96 h后的單核-巨噬細胞，分別給予M1誘導劑和M2誘導劑，觀察細胞的形態并用流式細胞術檢測細胞陽染率的變化。

如圖9所示，M1誘導劑刺激24 h，發現細胞逐漸變為不規則形，部分細胞轉化為多邊形或長梭形；M2誘導劑刺激24～120 h后，發現細胞形態逐漸改變，呈圓形或類圓形貼壁生長。

Figure 9.The morphological changes of GM-CSF-induced monocyte-macrophages at different time points after stimulation with LPS & IFN-γ or IL-4 & IL-13 （×200）.

進一步采用流式細胞技術檢測發現，M1誘導劑刺激24 h后，大部分細胞表達M1型巨噬細胞表面標志物CD86（≥90%）。而M2誘導劑刺激96 h后，大部分細胞表達CD206陽性（68.98%），繼續延長IL-4&IL-13刺激時間至120 h，發現CD206的陽性比例沒有明顯增加（68.03%）。結果見圖10、11。

Figure 10.Flow cytometry results of GM-CSF-induced mouse monocyte-macrophages stimulated with LPS & IFN-γ for 24 h or IL-4 & IL-13 for 24 to 120 h. MeanSD. n=3. **P<0.01 vs control group.

Figure 11.Representative results of flow cytometry of GM-CSF-induced monocyte-macrophages stimulated with LPS & IFN-γ for 24 h （A） or IL-4 & IL-13 96 h （B）.

3　PCR鑒定巨噬細胞表型

經過上述實驗探究，我們基本確定出可靠的M1及M2型巨噬細胞極化誘導方法，將誘導完成的不同極化類型的巨噬細胞收集，進行RT-qPCR鑒定。如圖12所示，經M1刺激劑誘導后M1型巨噬細胞相關基因如iNOS、IL-6、TNF-α和IL-12的mRNA表達顯著增加，與對照組相比差異具有統計學意義（<0.01），而M2刺激劑誘導后巨噬細胞相關基因如Ym-1、MR和Arg-1的mRNA表達增加，與對照組相比差異具有統計學意義（<0.01）。

Figure 12.RT-qPCR was used to detect the mRNA expression of M1 and M2 macrophage-related molecules. A： the M1 macrophage-related mRNA expression in GM-CSF-induced monocyte-macrophages stimulated with LPS & IFN-γ for 24 h； B： the M2 macrophage-related mRNA expression in GM-CSF-induced monocyte-macrophages stimulated with IL-4 & IL-13 for 24 h. Mean±SD. n=3. *P<0.05，**P<0.01 vs control group.

討論

巨噬細胞在人體中承擔著重要的生理和病理功能，近來研究發現［17-18］，巨噬細胞不僅在病變組織中發生浸潤，其表型和功能在不同微環境也會發生相應改變，即巨噬細胞的極化。極化后的巨噬細胞主要分為M1和M2兩種表型［19-20］。兩種極化類型的巨噬細胞在形態和功能等方面均有明顯差異。M1型巨噬細胞主要由脂多糖和γ干擾素誘導形成，能夠分泌促炎癥細胞因子如IL-1β、IL-6和TNF-α等，在炎癥的早期發揮主要作用［21-22］。M2型巨噬細胞主要通過IL-4和IL-13誘導生成，能夠分泌促纖維化細胞因子，如TGF-β和IL-10等，在炎癥反應的中后期發揮主要作用［23-24］。

近年來的大量研究表明，巨噬細胞極化參與多種疾病的發生和發展［8，11-12，25］，調控巨噬細胞的極化或回輸不同極化類型的巨噬細胞，在許多疾病都展示出了不同的效果［8，11-12，15-16］。然而，體外誘導巨噬細胞極化的方法目前尚未形成確切且統一的共識，難以收獲足量、確切的極化巨噬細胞已經成為阻礙相關研究順利進展的瓶頸。

目前巨噬細胞極化誘導多采用骨髓來源的前體細胞，但是具體的誘導方法，如刺激劑的選擇、刺激濃度和培養時間等方面存在較大差別［11-13，15-16］。多數學者［11，13，15-16］采用M-CSF或GM-CSF作為前期誘導劑將骨髓前體細胞誘導成為單核-巨噬細胞后，在此基礎上進一步采用極化刺激劑誘導出M1或M2型巨噬細胞，也有部分研究采用L929細胞條件培養基誘導單核-巨噬細胞［26］。但在少數研究中［27］沒有采用前期誘導劑，直接采用極化刺激劑將骨髓來源的前體細胞誘導成M1或M2型巨噬細胞。然而，我們的研究發現，對照組（未加前期誘導劑）在培養72h后細胞的增殖狀態明顯欠佳。而經M-CSF或GM-CSF誘導后的細胞增殖活躍，有利于下一步的極化誘導。

目前，巨噬細胞的極化誘導劑已基本形成共識，即M1誘導劑為LPS/IFN-γ，M2誘導劑為IL-4/IL-13［28］。但是，前期誘導劑的選擇是否對巨噬細胞的極化結果也有一定影響呢？有學者采用40 μg/L 的GM-CSF作為前期誘導劑，繼而聯合100 μg/L LPS和20 μg/L IFN-γ誘導24 h，經PCR檢測發現M1型標志物iNOS、IL-12和TNF-α的mRNA表達升高；聯合20 μg/L IL-4誘導24 h，發現M2型標志物Arg-1、MR、Ym-1的mRNA表達升高。該課題組繼而在另一項研究中以20 μg/L M-CSF作為前期誘導劑，聯合50 μg/L LPS和20 μg/L IFN-γ誘導24 h得到M1型巨噬細胞；聯合20 μg/L IL-4誘導24 h得到M2型巨噬細胞［15-16］。由于這兩項研究中極化巨噬細胞的鑒定均是采用PCR的鑒定方法，我們課題組使用了流式細胞術對單核巨噬細胞表面標志物（CD11b&F4/80）和M1、M2型巨噬細胞的表面標志物（CD86/CD206）進行鑒定。結果發現，C57BL/6小鼠的骨髓前體細胞，經M-CSF或GM-CSF前期誘導作用后，向單核-巨噬細胞分化的效應及進一步極化結果存在一定差異。

我們的研究顯示，50 μg/L M-CSF刺激小鼠骨髓前體細胞后，CD11b和F4/80的陽性表達均大于90%；而GM-CSF誘導后F4/80的陽染率為58%，但CD11b的陽染率始終維持在90%以上，提示M-CSF和GM-CSF均可將骨髓前體細胞誘導成為單核-巨噬細胞，但是M-CSF更易誘導出成熟的巨噬細胞。

在進一步的巨噬細胞極化誘導實驗中我們發現，由50 μg/L M-CSF誘導得到的巨噬細胞進一步接受25 μg/L LPS和10 μg/L IFN-γ刺激24 h后，M1型巨噬細胞表面標志物CD86陽染率≥90%。隨后，我們采用20 μg/L IL-4和IL-13將巨噬細胞向M2型誘導，但是經過多次實驗發現，M2型巨噬細胞的陽染率不理想（CD206陽染率<15%）。提示以M-CSF作為前期誘導劑易于誘導出M1型巨噬細胞，但難以誘導出M2型巨噬細胞。采用GM-CSF作為前期誘導劑得到的巨噬細胞，進一步聯合M1刺激劑培養24 h發現CD86陽染率大于90%；聯合M2刺激劑培養96 h后CD206陽染率大于65%。提示，以GM-CSF作為前期誘導劑能成功誘導出M1型巨噬細胞，也可成功誘導M2型巨噬細胞。雖然本研究得到的M2型巨噬細胞誘導比例只有68%左右，但回顧同類研究發現：多數研究未使用流式細胞術鑒定M2型巨噬細胞的具體誘導比例，僅采用RT-qPCR的方法進行巨噬細胞極化鑒定［15-16］。少數使用流式細胞術鑒定巨噬細胞極化的實驗，M2型巨噬細胞誘導比例沒有顯示或低于50%［12-13，29］。

綜上所述，我們認為骨髓前體細胞經前期誘導劑M-CSF或GM-CSF刺激后，有利于單核細胞的分化和增殖。M-CSF相較于GM-CSF更易誘導出成熟的小鼠巨噬細胞；當以M1型巨噬細胞作為研究對象時，M-CSF或GM-CSF均可作為前期誘導劑；而以M2型巨噬細胞作為研究對象時，建議選用GM-CSF作為前期誘導劑。

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Methods ofinduction of polarization from mouse bone marrow-derived macrophages

XIN Jia-qi1，XU Xiao-fan1，DUAN Li-fang1，FANG Jian-wei1，WU Nan3，ZHANG Hong1，2△

（1，712046，；2，712046，；3，，81675，）

To explore the optimal method for isolation of mouse bone marrow precursor cells and induction into different polarization states （M1 and M2）.The contents of femur and tibia were collected from C57BL/6 mice. After filtering through meshes and erythrocyte lysis，cells were cultured in RPMI-1640 complete medium for 16 h. Non-adherent cells were collected and re-seeded in culture plates. The cells were collected at different time points. The morphological changes of the cells were observed under light microscope. The corresponding markers of macrophages in different polarization states were detected by flow cytometry and RT-qPCR.（1） After stimulation with 50 μg/L M-CSF for 72 h，the positive staining rate of CD11b was more than 90%. The positive staining rate of F4/80 was over 95% after stimulation for 96h. After 96 h of stimulation with 40 μg/L GM-CSF，the positive staining rate of CD11b also reached more than 90%. The positive staining rate of F4/80 reached the peak at 144 h （58.2%）. （2） On the basis of pre-induction of M-CSF，followed by 25 μg/L LPS and 10 μg/L IFN-γ stimulation for 24 h，the positive staining rate of CD86 was greater than 90%. Under the same circumstances，20 μg/L IL-4 and IL-13 were given at different time points which showed that the positive staining rate of CD206 was always low （<10%）. （3） On the basis of pre-induction of GM-CSF，followed by 25 μg/L LPS and 10 ng/mL IFN-γ stimulation for 24 h，the positive staining rate of CD86 was greater than 90%. When the cells were stimulated with 20 μg/L IL-4 and IL-13 for 96 h，the positive staining rates of CD206 were 68.98%. （4） RT-qPCR results showed that after simulation the mRNA expression of the markers for M1 macrophages （iNOS，IL-6，TNF-α and IL-12） and M2 macrophages （Ym1，MR and Arg-1） were significantly higher than that in the control group （<0.01）.（1） Both M-CSF and GM-CSF induce more than 90% of bone marrow precursor cells from C57BL/6 mouse into monocytes. 90% of bone marrow precursor cells differentiate to mature macrophages by M-CSF，and 58% of bone marrow precursor cells induced by GM-CSF become mature macrophages. （2） On the basis of pre-induction of M-CSF，LPS joint with IFN-γ is easy to induce M1 macrophages. However，it is difficult to obtain M2 macrophages by combination of IL-4 and IL-13. （3） On the basis of pre-induction of GM-CSF，LPS joint with IFN-γ is easy to induce M1 macrophages. Combined stimulation of IL-4 and IL-13 induces most cells to M2 macrophages.

Mouse bone marrow precursor cells； Macrophages polarize； M1 macrophages； M2 macrophages

R363； R329.2+5

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2022.02.024

1000-4718（2022）02-0375-10

2021-09-07

2021-12-24

［基金項目］國家自然科學基金資助項目（No. 81673816； No. 82174201； No. 82104815）；陜西中醫藥大學創新團隊項目（No. 2019-YL14）；陜西省特支計劃（No. 303/141020047）

Tel： 029-38183453； E-mail： zhangh1227@163.com

（責任編輯：余小慧，羅森）