鉬污染對叢枝菌根和球囊霉素的影響

尹可敬，曹利兵，徐曉峰，石兆勇，2，3，4*

（1.河南科技大學農學院，河南 洛陽 471023；2.中國科學院成都山地所山地表生過程與生態調控重點實驗室，四川 成都 610041；3.洛陽市共生微生物與綠色發展重點實驗室，河南 洛陽 471000；4.洛陽市植物營養與環境生態重點實驗室，河南 洛陽 471023）

叢枝菌根真菌（arbuscular mycorrhizal fungi，AMF）在自然界中分布廣泛，除大量分布于農田和森林土壤中外，在一些逆境環境，如沙漠、河流灘涂、鹽堿及各類礦區土壤中也均存在［1-3］。研究表明，叢枝菌根具有改善土壤結構、增加土壤肥力、提高土壤生物活性的功能［4-7］。同時，叢枝菌根真菌通過與植物形成共生關系，還能促進植物對水分和礦質養分的吸收，增強植物對不良環境的適應能力等［8-9］。球囊霉素是叢枝菌根真菌分泌的一種專性蛋白，也廣泛分布于陸地生態系統［10-11］。已有研究表明，球囊霉素難溶于水，不易被蛋白酶水解，在土壤中的性質極為穩定，隨著菌絲及孢子的分解而緩慢釋放到土壤中，成為土壤有機碳庫的重要來源［12］，同時球囊霉素還具有改善土壤結構、降低重金屬對植物毒害的作用［12］。

礦山的開采、選礦、重金屬尾礦、冶煉廢渣等，都會造成土壤重金屬污染［13］。土壤重金屬污染不僅對植物產生毒害作用，抑制作物的生長［14］，同時土壤重金屬污染對叢枝菌根真菌與植物共生關系的形成、叢枝菌根真菌的繁殖及分泌球囊霉素的能力都有著不容忽視的影響［15-17］。叢枝菌根真菌能否侵染植物是叢枝菌根真菌與植物能否形成共生關系的基礎，菌根侵染頻度（F）是植物與叢枝菌根真菌之間共生關系的直接體現，菌根侵染率是叢枝菌根真菌侵染頻度和侵染強度的綜合反映［18］。孢子密度（Spores density）則體現了叢枝菌根真菌的繁殖能力［19］。吳春華等［20］研究發現，相同試驗處理下，添加鉛能使苦荬菜、早熟禾、黑麥草等植物的菌根侵染率出現顯著下降，而無芒稗、車前草、酢漿草的菌根侵染率則出現顯著上升的情況。肖艷萍等［18］研究發現，叢枝菌根真菌廣泛分布于重金屬污染的鉛鋅礦區土壤中。班宜輝等［16］通過對鉛硐山鉛鋅礦區叢枝菌根真菌侵染特征的研究發現，一定程度重金屬脅迫能促進叢枝菌根真菌與植物共生關系的建立，而濃度過高的重金屬脅迫會抑制叢枝菌根真菌侵染，同時叢枝菌根真菌的孢子密度與侵染率間沒有顯著相關性。孔凡美等［21］研究發現，在復合重金屬污染的土壤中菌根侵染率有較高的水平，叢枝菌根真菌的孢子密度隨重金屬污染程度的加深而銳減。同時研究還發現，重金屬對叢枝菌根真菌分泌球囊霉素也有一定影響［22-23］。張旭紅等［22］在添加0～600 mg·kg-1外源鉛的旱稻盆栽試驗中發現，隨著鉛含量的增加，球囊霉素含量顯著降低。卓逢等［23］在接種叢枝菌根真菌的玉米盆栽試驗中也發現，高濃度的鉛、鎘會顯著降低土壤中球囊霉素的含量。

鉬是一種十分重要的礦產資源，我國目前探明的鉬金屬礦有300多處，鉬儲量約為850萬t［24］。河南省鉬儲量占全國總儲量的30.0%以上，其中以洛陽市欒川縣鉬礦資源最為豐富，被譽為“中國鉬都”，其已探明的鉬儲量達206萬t，礦石的日開采量達1.3萬t，是亞洲最大的鉬礦開采基地［25］。但是，鉬礦開采也導致了嚴重的環境問題［26-30］，余蔥蔥等［26］在河南洛陽鉬礦區的研究發現，受鉬礦開采的影響，當地陸渾水庫飲用水的鉬含量達到嚴重污染的水平，鉬含量超過了標準限值的2.44倍。Yin等［29］研究發現，鉬是洛陽鉬礦區土壤重金屬污染的首要污染物，不同區域鉬的污染貢獻率均超過了90%。研究進一步證明，土壤中鉬含量過高，也會對植物產生毒害作用，造成褪綠和黃化現象，從而影響植物的正常生長［31］，而叢枝菌根作為植物與微生物的共生體，其形成和功能也有可能受到鉬污染的影響。但目前對鉬礦區叢枝菌根真菌與植物的共生關系及其繁殖和分泌球囊霉素能力的研究還較少。因此，本文采用單因子指數法對土壤受鉬污染程度進行分級，對不同鉬污染級別下土壤叢枝菌根真菌與植物的共生關系、叢枝菌根真菌的產孢量及其分泌球囊霉素的能力進行分析，以期探明鉬污染對叢枝菌根及其重要的分泌物——球囊霉素的影響，為摸清礦區污染土壤中叢枝菌根真菌的特性提供數據支持，以便為今后鉬礦區耐重金屬的叢枝菌根真菌資源開發及利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 研究區概況與樣品的采集和處理

本研究選擇河南省洛陽市典型鉬礦區為研究區域。研究區域內共設置15個采樣點，每個采樣點內設置5個20 m×20 m的樣方，對各樣方內優勢植物的植物種進行記錄（表1），同時采集每個樣方內同種優勢植物及其根系周圍0～20 cm土壤3～5份，并混合成1份植物和土壤樣品。將采集的植物土壤樣品帶回實驗室，風干處理，采用王水消解［32］，用ICP-MS測定土壤鉬含量。

根據鉬含量的測定值，采用國內外較為普遍的用于某一污染物對土壤污染程度的評價方法——單因子指數法［33-34］。由于中國尚無土壤中鉬的環境質量標準，參考對鉬污染土壤評價的前人研究［27，35-36］，本文選擇法國土壤鉬的限定值100 mg·kg-1作為評價標準，計算鉬的單項污染指數( Pi，公式為Pi=土壤鉬含量/評價標準值)，并參考前人的單項土壤鉬污染程度分級標準[27]，將洛陽鉬礦區土壤受鉬污染程度（Pi）分為4個級別，同時將每個級別下土壤平均鉬含量列于表2。

表2 土壤單項污染程度分級標準

1.2 叢枝菌根真菌侵染率和孢子密度的測定

將根系用自來水沖洗干凈，剪成約1 cm長根段，采用醋酸-墨水染色法對根系進行染色處理后，在顯微鏡下觀察根系的侵染狀況，據Trouvelot等［37］的方法，采用MYCOCALC計算菌根侵染頻度（F）、侵染率（M）和叢枝豐度（A）。其中侵染頻度反映了所有含有真菌結構的根系占整個根系的比例，而侵染率是在整個根系中真菌侵染出現的頻度和侵染強度的綜合反映。叢枝豐度表示的是真菌侵染的根段中叢枝結構出現的頻度和侵染強度的綜合反映。稱取10 g風干土樣，采用濕篩傾析法［38］對孢子進行分離，在體視鏡下對分離出的孢子進行計數，以每克風干土中的孢子數記為孢子密度（Spores density，SD）。

1.3 球囊霉素的測定

球囊霉素，包括總提取球囊霉素（Total GRSP，TG）和易提取球囊霉素（Easily extractable GRSP，EEG），根據Wright等［11］和David等［39］的方法進行測定。

1.4 數據處理

使用SPSS 21.0分別對不同鉬污染級別下植物及不同鉬污染級別下草本和木本植物的侵染率、孢子密度、球囊霉素含量進行單因素方差分析，對鉬礦區所有樣品的鉬含量、侵染率、孢子密度、球囊霉素間的關系進行Spearman相關分析。

2 結果與分析

2.1 不同鉬污染程度對植物叢枝菌根共生關系的影響

通過對4個鉬污染級別土壤中叢枝菌根真菌的侵染指標測定發現，叢枝菌根真菌的菌根侵染頻度、侵染率及叢枝豐度在4個鉬污染級別間均沒有顯著差異（P＜0.05）。4個鉬污染級別下叢枝菌根真菌的平均菌根侵染頻度、侵染率、叢枝豐度分別為50.64%、12.84%、3.92%（圖1a）。進一步比較4個鉬污染級別的草本植物和木本植物根際的叢枝菌根真菌侵染狀況也得到相似的結果（P＜0.05），其中4個鉬污染級別下草本植物的平均菌根侵染頻度達到55.81%，而木本植物則為44.42%（圖1b，圖1c）。

圖1 不同鉬污染級別下AM真菌的侵染狀況

2.2 不同鉬污染程度對叢枝菌根繁殖能力的影響

通過比較不同級別鉬污染土壤樣品中的孢子密度發現，叢枝菌根真菌的孢子密度隨鉬污染程度的加深呈下降趨勢，但不同鉬污染級別間沒有顯著差異（P＞0.05），其孢子密度處于14.93～23.83個·g-1風干土范圍內（圖2a）。通過對相同生活型植物根際的孢子密度在不同鉬污染程度下的測定發現，雖然中度鉬污染程度下草本植物根際的孢子密度（11.96個·g-1風干土）顯著低于無鉬污染程度下草本植物根際的孢子密度（27.11個·g-1風干土），但草本植物和木本植物根際的孢子密度在4個鉬污染程度間均沒有顯著差異，草本植物根際的孢子密度變化范圍為11.96～27.11個·g-1風干土，木本植物根際的孢子密度變化范圍則為17.96～24.88個·g-1風干土（圖2b）。

圖2 不同鉬污染級別下植物根際的孢子密度

2.3 不同鉬污染程度對植物根際球囊霉素含量的影響

總體來看，洛陽鉬礦區土壤的總提取球囊霉素含量變化范圍為1.53～2.85 mg·kg-1，其中重度鉬污染條件下的總提取球囊霉素的含量顯著低于其他3個級別下的含量。易提取球囊霉素含量的變化范圍為0.72～1.47 mg·kg-1，其中無鉬污染土壤中的易提取球囊霉素含量顯著高于重度鉬污染程度下的含量（圖3a）。進一步比較4個鉬污染級別下草本或木本植物根際土壤的總提取球囊霉素含量發現，在無鉬污染和輕度鉬污染條件下，草本植物根際的總球囊霉素含量高于重度鉬污染條件下的含量（P＜0.05），分別是重度鉬污染土壤中總球囊霉素含量的1.77和1.74倍（圖3b）。而輕度鉬污染和中度鉬污染程度下木本植物根際的總球囊霉素含量則顯著高于重度鉬污染程度下的含量（P＜0.05），分別是重度鉬污染土壤中總球囊霉素含量的1.97和1.77倍（圖3c）。同時，無論是草本還是木本植物根際的易提取球囊霉素在4個鉬污染級別下均沒有顯著差異。

圖3 不同鉬污染級別下球囊霉素的含量

2.4 鉬含量與叢枝菌根真菌侵染指標、孢子密度及球囊霉素的相關性分析

對鉬礦區土壤鉬含量與叢枝菌根真菌侵染指標、孢子密度及球囊霉素進行相關性分析，結果（表3）表明，鉬礦區土壤的鉬含量與叢枝菌根的菌根侵染頻度、侵染率、叢枝豐度沒有明顯的相關關系，而鉬礦區土壤的鉬含量與孢子密度呈顯著負相關（P＜0.05），與總球囊霉素、易提取球囊霉素呈極顯著負相關（P＜0.01）。

表3 鉬含量與叢枝菌根侵染率、孢子密度、球囊霉素的相關系數

2.5 不同鉬污染程度下叢枝菌根真菌的菌根侵染頻度、孢子密度和球囊霉素間的關系

對不同鉬污染程度下叢枝菌根真菌的菌根侵染頻度、孢子密度和球囊霉素進行相關性分析，三者之間的相關分析結果（表4）表明，在4個鉬污染級別下，菌根侵染頻度與孢子密度間均沒有相關性。菌根侵染頻度與總提取球囊霉素僅在無鉬污染級別下呈負相關關系。中度鉬污染條件下，孢子密度與總提取球囊霉素間呈正相關關系。此外還發現，總提取球囊霉素和易提取球囊霉素在4個鉬污染級別下均表現出極顯著的正相關關系。

表4 不同鉬污染程度下菌根侵染率、孢子密度、球囊霉素三者的相關關系

3 討論

叢枝菌根真菌廣泛分布于陸地生態系統，能與大部分陸地植物形成良好的共生關系［1-3］。Shi等［40］通過對不同鉬含量梯度下叢枝菌根真菌侵染玉米根系的研究發現，叢枝菌根真菌對鉬表現出較強的耐性，且植物的菌根侵染率在鉬含量為0～4000 mg·kg-1時沒有顯著差異，這一結果在本研究中也得到證實。無論是從全部植物的叢枝菌根真菌侵染參數（F、M、A）來看，還是從草本植物或是木本植物的叢枝菌根真菌侵染參數來看，在不同鉬污染級別下菌根侵染率均沒有顯著差異。相關分析結果表明土壤鉬含量與叢枝菌根真菌侵染參數之間不存在相關性，說明鉬污染不影響叢枝菌根真菌與植物共生關系的形成。在本研究中，洛陽鉬礦區植物的菌根侵染頻度為49.04%～51.62%，平均達到50.64%。與其他區域相比較高，如鳳縣鉛鋅礦區叢枝菌根真菌的菌根侵染頻度為28.50%～56.97%，平均值為44.64%［41］；南非西北省某金礦叢枝菌根真菌的菌根侵染頻度為9.2%～58.8%，平均值為29.3%［42］；安徽某銅礦叢枝菌根真菌的菌根侵染頻度最高值為27.5%［43］，洛陽鉬礦區叢枝菌根真菌的菌根侵染頻度較高，也說明洛陽鉬礦區植物與叢枝菌根真菌能形成良好的共生關系。此前研究發現，土壤中重金屬含量高時，叢枝菌根真菌的侵染率和叢枝豐度均較低。如Zarei等［44］在鋅含量高達2359.1 mg·kg-1的礦區土壤中發現，叢枝菌根真菌的侵染率和叢枝豐度分別只有9.4%和3.8%；Baba等［45］在鋅、鎘、鉛復合污染的土壤中發現，叢枝菌根真菌的侵染率和叢枝豐度均低于3%。在本研究中，盡管鉬礦區植物的菌根侵染頻度較高，但輕度鉬污染到重度鉬污染級別下叢枝菌根真菌的平均侵染率僅達到11.06%，平均叢枝豐度只有3.01%，這一結果與之前的研究結果相一致［44-45］。叢枝是植物與菌根真菌之間進行物質和能量交換的主要場所［46］，洛陽鉬礦區較低的叢枝豐度還說明，鉬污染雖然不影響植物與叢枝菌根真菌共生關系的形成，但很可能通過抑制叢枝等結構的形成來影響叢枝菌根真菌在菌根共生體中功能的正常發揮。

孢子是菌根真菌儲存營養的重要器官和繁殖體［47］。已有研究表明，土壤中重金屬的含量對叢枝菌根真菌的產孢能力有一定的影響［21］。Wu等［15］研究發現，叢枝菌根真菌的孢子密度隨土壤重金屬（鉛、鋅、銅、鎘等）含量的增加而顯著降低。孔凡美等［21］研究發現，孢子密度在輕、中度復合污染土壤中較高，隨重金屬污染程度的增加而銳減。通過對鉬礦區土壤的孢子密度測定發現，盡管不同鉬污染級別下叢枝菌根真菌的孢子密度間沒有顯著差異，但叢枝菌根真菌的孢子密度隨鉬污染程度加深表現出下降趨勢（圖2a、圖2b）。同時，相關性分析結果表明鉬含量與孢子密度存在顯著的負相關，說明鉬含量的提高對叢枝菌根真菌的產孢能力具有明顯的抑制作用。此外，洛陽鉬礦區土壤的平均孢子密度為19.20個·g-1風干土，其中草本植物和木本植物根際土壤的平均孢子密度分別為18.2和20.3個·g-1風干土。與其他區域，如鉛硐山鉛鋅礦區的孢子密度（平均孢子密度為1.5個·g-1風干土）［16］、曲江砷礦區的孢子密度（平均孢子密度為9.5個·g-1風干土）［15］、郴州鉛礦區的孢子密度（平均孢子密度為8.6個·g-1風干土）［15］相比，洛陽鉬礦區具有較高的孢子密度，表明該區域中的叢枝菌根真菌對鉬污染土壤具有較好的適應能力。

球囊霉素是由叢枝菌根真菌分泌的一種含金屬離子的糖蛋白物質，對穩定土壤碳庫和固存土壤重金屬起著至關重要的作用［12，48-50］。目前，關于球囊霉素與土壤重金屬含量之間的關系已有大量研究，但研究結果并不一致。Comejo等［50］發現銅污染區土壤中球囊霉素的含量與重金屬銅、鋅含量之間存在正相關性。Vodnik等［51］發現鉛污染土壤中球囊霉素含量與土壤鉛含量之間呈顯著正相關關系。而Leal等［17］研究則發現在鋅污染區土壤中球囊霉素含量與重金屬鋅、銅、鉛、鎘存在負相關性。李華健等［52］也發現土壤總球囊霉素含量與土壤鎘含量呈負相關關系。本研究通過對鉬礦區土壤中總提取和易提取球囊霉素含量的測定發現，土壤中總提取和易提取球囊霉素含量隨鉬污染程度的加深表現出下降的趨勢，其中重度鉬污染土壤中總提取和易提取球囊霉素含量顯著低于無鉬污染土壤中總提取和易提取球囊霉素的含量。同時相關性分析結果表明，土壤鉬含量與總提取和易提取球囊霉素含量呈極顯著負相關關系，以上結果說明鉬污染程度的加深對叢枝菌根真菌分泌球囊霉素的能力具有明顯的抑制作用，這與前人的研究結果相類似。

目前，國內外學者對侵染率和孢子密度之間的關系已開展大量研究，如有結果表明，當叢枝菌根真菌的侵染率高時，叢枝菌根真菌的產孢能力也較高［2，53］，也有一些研究表明二者之間沒有明顯的相關性［16，54］。本研究通過對洛陽鉬礦區叢枝菌根真菌的菌根侵染率和孢子密度間的關系調查發現，不同鉬污染程度下，菌根侵染率與孢子密度均沒有明顯的相關關系，這一結果與班宜輝等［16］和楊梅等［54］的研究結果相一致。同時還發現，總提取和易提取球囊霉素含量與菌根侵染率在無鉬污染、中度鉬污染及重度鉬污染條件下均沒有相關關系，上述結果說明叢枝菌根真菌的繁殖能力和分泌球囊霉素的能力受叢枝菌根真菌侵染能力的影響較小，可能與其他土壤理化性質如土壤鉬含量的關系更為密切。

4 結論

鉬含量與叢枝菌根真菌侵染指標沒有相關關系，同時在4個鉬污染級別的土壤中，各寄主植物的菌根侵染頻度、侵染率及叢枝豐度差異不顯著，可見，鉬含量不影響叢枝菌根真菌與植物共生關系的形成。

重度鉬污染程度下總提取和易提取球囊霉素的含量顯著低于無鉬污染程度下總提取和易提取球囊霉素的含量，同時鉬含量與孢子密度和球囊霉素的相關分析結果表明，鉬含量與孢子密度及球囊霉素呈顯著負相關，可見，鉬含量影響叢枝菌根真菌的產孢能力及其分泌球囊霉素的能力，鉬含量的提高對兩者有明顯的抑制作用。

與之前一些研究結果相一致的是，洛陽鉬礦區植物根際土壤的菌根侵染率與孢子密度和球囊霉素間沒有顯著相關性，可見，叢枝菌根真菌的產孢和分泌球囊霉素的能力受叢枝菌根真菌侵染能力的影響較小。通過對鉬礦區叢枝菌根真菌侵染狀況、產孢能力及其分泌球囊霉素的調查與研究，為摸清礦區污染土壤中叢枝菌根真菌的特性提供數據支持，以便為今后鉬礦區耐重金屬的叢枝菌根真菌資源開發及利用提供依據。