胸腔積液LPS、IL-35、RORα表達在結核性胸膜炎、惡性胸膜炎鑒別診斷中的價值

雷朝君 蔣晨春 高嫵媚

胸膜炎是由于炎癥、腫瘤等各種因素刺激胸膜所產生的胸膜炎癥，其主要病因為結核和惡性腫瘤[1]。對于結核性胸膜炎和惡性胸膜炎早期做出鑒別，對于臨床采取針對性干預措施改善預后具有重要意義，目前對于結核性胸膜炎和惡性胸膜炎的鑒別，多依賴于結核分枝桿菌檢測或胸膜組織活檢，但胸腔積液中結核分枝桿菌較少，常規檢測方法難以檢測出來；胸膜穿刺活檢會對患者帶來一定創傷，且標本采集困難，可重復性差[2]。近年來生物標志物逐漸應用于胸膜炎的診斷，雖然目前國內外尚未發現單一、有效的鑒別良惡性胸膜炎的生物學標志物，但多種生物標志物聯合檢測有望大幅度提高良惡性胸膜炎的鑒別診斷準確性[3]。脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)是構成革蘭氏陰性菌細胞壁的主要成分，在結核局部免疫炎癥反應中發揮重要作用[4]；維甲酸相關孤兒受體α(retinoic acid related orphan receptor α, RORα ) 也是一種與結核病的發生密切相關的小分子調控蛋白，可對機體的多種生理過程發揮調節作用[5]；白細胞介素(Interleukin,IL)-35是一種對炎癥反應、細胞增殖具有抑制作用的細胞因子，與感染性疾病、自身免疫性疾病的病情發展有一定關系[6]。近年來國內研究表明，胸腔積液中LPS、IL-35、RORα與結核性胸膜炎病情密切相關[7-8]。但三種生物標志物能否用于結核性胸膜炎與惡性胸膜炎鑒別診斷尚不得而知。本研究對比分析結核性胸膜炎、惡性胸膜炎患者胸腔積液中LPS、IL-35、RORα表達情況，探討三種生物標志物單獨和聯合檢測，在結核性胸膜炎和惡性胸膜炎鑒別診斷中的價值。

資料與方法

一、 一般資料

前瞻性納入本院2017年1月至2020年12月收治的結核性胸膜炎患者126例(良性組)，男性72例，女性54例，年齡最小19歲，最大77歲，平均(57.32±9.79)歲。并選擇同期與本院接受診治的惡性胸膜炎患者88例(惡性組)，其中男51例，女37例，年齡最小20歲，最大78歲，平均(57.86±9.73)歲，致病原因：肺癌胸腔轉移47例，胃癌胸腔轉移16例，胸膜間皮瘤11例，子宮內膜癌胸腔轉移8例，卵巢癌胸腔轉移6例。納入標準：①年齡>18歲；②胸腔積液為滲出液；③良性組符合《肺結核診斷和治療指南(2001年訂)》[9]中結核性胸膜炎的診斷標準，并由結核分枝桿菌細菌學檢查或病理檢查確診；④惡性組經細胞學或病理學檢查確診；⑤初次接受診治；⑥自愿參加本研究，并簽署協議書。排除標準：①未獲得明確診斷；②入組前曾接受相關治療；③合并肺炎、肺膿腫等其他感染性疾病；④合并凝血系統疾病；⑤合并心肝腎嚴重器質性疾病或內分泌疾病、自身免疫性疾病、代謝性疾病、精神類疾病等。⑥妊娠或哺乳期女性。

二、方法

兩組患者均于無菌條件下進行胸腔穿刺術，術前經超聲定位引導，常規消毒、鋪單，局麻下將穿刺針穿入胸腔，抽取胸腔積液約10mL，試管肝素抗凝，以3000r/min轉速離心10min，離心半徑r=12cm，室溫下靜置60min，分離上清液置于-80℃冰箱內待測，免疫熒光法測定胸水腺苷脫氨酶(Adenosine deaminase， ADA)含量，應用酶聯免疫法測定胸水LPS、IL-35、RORα、鱗癌抗原(squamouse cell carcinoma antigen、SCC)神經源特異性烯醇化酶(neuron-specific enolase，NSE)含量，具體操作：在微孔酶標板上設10個標準孔，將稀釋的標準品按照濃度順序依次加樣，稀釋后各孔加入待測樣品50μl，37℃下孵育30min，緩沖液洗滌5次，之后每孔加入酶標試劑50μl，再次按上述過程進行孵育、洗滌，先后加入顯色劑A和顯色劑B各50μl，混勻后避光顯色15min，每孔各加入終止液50μl，終止反應后以450nm波長測量各孔吸光度。LPS、RORα試劑盒由南京森貝伽生物科技有限公司提供， IL-35、CA125、SCC、NSE試劑盒由深圳晶美生物制品有限公司提供，實驗過程均嚴格按照試劑盒說明書進行。并測定兩組胸腔積液中白蛋白、乳酸脫氫酶(LDH)含量及白細胞計數和單核細胞計數。

三、觀察指標

比較良性組、惡性組年齡、性別、體質量指數、吸煙史、飲酒史、胸腔積液的實驗室檢查等臨床資料，將上述組間比較有統計學意義的資料帶入logistic回歸模型，采用多因素logistic回歸分析良性胸膜炎發生的影響因素。繪制受試者工作特征(ROC)曲線，評價胸水LPS、IL-35、RORα單獨和聯合應用對結核性胸膜炎和惡性胸膜炎鑒別診斷價值。

四、 統計學方法

應用SPSS23.0軟件分析統計數據，計量資料以均數±標準差表示，組間比較應用t檢驗，計數資料以頻數表示，組間比較應用χ2檢驗，良性胸膜炎發生的影響因素應用多因素logistic回歸分析，ROC曲線評價胸水LPS、IL-35、RORα對結核性胸膜炎和惡性胸膜炎的鑒別診斷價值，三項指標聯合應用與各項指標單獨應用ROC曲線面積的比較應用Z檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、兩組臨床資料比較

良性組胸水ADA、LDH、LPS、IL-35、RORα含量及白細胞計數、單核細胞計數均顯著高于惡性組，差異有統計學意義(P<0.05)，兩組性別、年齡、體質量指數、吸煙史、飲酒史、胸水SCC、NSE含量差異均無統計學意義(P>0.05)(見表1)。

二、結核性胸膜炎發生影響因素分析

以發生結核性胸膜炎為因變量，以表1中具有統計學意義的變量為自變量，將正常值作為分界點分別賦值1和0(見表2)。多因素logistic回歸分析顯示胸水中LPS、IL-35、RORα是結核性胸膜炎的影響因素(見表3)。

表1 良性組和惡性組臨床資料比較

表2 表1中自變量的賦值表

表3 良性胸膜炎多因素logistic回歸分析結果

三、胸水LPS、IL-35、RORα在結核性胸膜炎和惡性胸膜炎鑒別診斷中的價值

繪制受試者工作特征曲線，顯示胸水LPS、IL-35、RORα鑒別結核性胸膜炎和惡性胸膜炎的ROC曲線下面積分別為0.683、0.602、0.647，三項指標聯合應用ROC曲線下面積為0.903，三項指標聯合應用鑒別結核性胸膜炎和惡性胸膜炎價值均高于各指標單獨應用(P<0.05)，差異均有統計學意義(見圖1、表4、5)。

表4 胸水LPS、IL-35、RORα單獨和聯合應用鑒別結核性胸膜炎和惡性胸膜炎的價值

圖1 胸水LPS、IL-35、RORα單獨和聯合應用鑒別結核性胸膜炎和惡性胸膜炎的ROC曲線

表5 胸水LPS、IL-35、RORα單獨和聯合應用鑒別結核性胸膜炎和惡性胸膜炎的價值比較結果

討 論

胸膜積液是胸部多種疾病的并發癥，肺部、胃腸道、女性生殖系統、乳腺等多部位的惡性腫瘤及結核性胸膜炎、肺炎等多種良性炎癥性疾病均可導致胸腔積液的發生[10]。結核性胸腔積液和惡性胸腔積液(包括轉移瘤、間皮瘤)是滲出性胸腔積液的最為常見原因。且兩種原因所致胸膜炎性反應的臨床特點、影像學檢查及實驗室檢查結果相似，鑒別診斷存在一定困難[11-13]。結核性胸膜炎是由結核分枝桿菌入侵胸膜腔所致的胸膜炎性反應性疾病，是丙類法定傳染病；而惡性胸膜炎是由惡性腫瘤細胞刺激胸膜所產生的胸膜炎癥，是惡性腫瘤進展至晚期的常見并發癥，惡性胸膜炎的發生往往提示機體存在全身轉移，患者生存期縮短[14]，結核性和惡性胸膜炎對機體產生的影響不同，其治療方法也存在很大差異，因此對于結核性和惡性胸膜炎早期鑒別診斷對于臨床治療方案的選擇至關重要。目前臨床醫師對于結核性和惡性胸膜炎的鑒別主要結核分枝桿菌檢出或胸膜組織穿刺活檢，但胸腔積液中結核分枝桿菌檢出率較低，且細菌培養時間較長；胸膜穿刺存在一定創傷，可重復性差，且多數檢測結果特異性較差[15]。尋求敏感、特異性好的生物學指標或幾種生物學治療聯合應用對于結核性和惡性胸膜炎的鑒別診斷具有重要意義。

LPS是革蘭氏陰性菌細胞壁的重要組成部分，其主要成分為脂質和多糖，也是革蘭氏陰性細菌主要的致病物質。LPS可與細胞膜表面的Toll樣受體4結合，并通過特定的信號傳導通路激活絲裂原活化蛋白酶信號途徑和轉錄因子κB信號途徑，促進炎癥介質的大量合成和釋放；并可促進血管平滑肌細胞釋放IL-8，對中性粒細胞發揮趨化作用；LPS還可刺激動脈外膜的成纖維細胞，使之產生IL-8、調節活化蛋白等多種趨化因子，促進炎癥反應的發生和發展[16]。本研究發現良性組胸水LPS含量顯著高于惡性組，LPS可能參與了胸膜結核的局部炎癥反應和免疫反應，促進了結核性胸腔積液的形成。IL-35是IL-12家族重要組成部分，也是一種具有炎癥抑制作用的細胞因子；由調節性T細胞分泌的Ebi3和IL-12的P35亞基組成，可誘導傳統的T淋巴細胞分化為抑制性的CD4+Foxp3的調節性T細胞[17]。IL-35可誘導Th1細胞分化免疫病原體的清除，同時還對Th17細胞的增殖具有較強的抑制作用，從而抑制機體過度的免疫應答。Kong等[18]的研究發現活動性肺結核患者機體內IL-35呈現高表達，提示IL-35與肺結核病灶的活動性相關，血液中IL-35含量有望成為活動性肺結核免疫狀態、預后評估的有效的生物指標。目前關于IL-35與胸腔積液的相關性研究不多，本研究發現良性組胸水IL-35含量顯著高于惡性組，提示IL-35可能在結核性胸膜炎發生機制中發揮了重要的免疫調節作用。RORα是維甲酸相關孤兒受體的重要組成部分，在腎臟、肝臟、腦組織、肺臟等多種臟器中廣泛表達，可調控腦組織、淋巴組織的發育等生理過程。研究表明，RORα是參與Th17細胞分化的重要物質之一，RORα激動劑逐漸成為抗炎治療的重要靶點，研究表明，敲除RORα基因的小鼠對于卵白蛋白誘導的肺部炎癥易感性明顯降低[19]，另有文獻報道結核性胸腔積液中RORαmRNA含量顯著高于非結核性胸腔積液[20]。本研究結果顯示結核性胸膜炎患者胸水中RORα含量高于惡性組，與文獻報道一致，表明RORα可能在結核性胸腔積液的形成中發揮了積極的作用。

結核病是一種遲發型過敏反應，胸膜的炎癥反應使血管通透性增加，進而大量淋巴細胞和蛋白質進入胸腔積液，本研究發現胸水中LPS、IL-35、RORα含量升高是結核性胸膜炎發生的影響因素，上述3項指標聯合檢測對于結核性、惡性胸膜炎的鑒別具有較高的臨床價值。根據ROC曲線分析結果，胸腔積液同時滿足LPS含量>274.34μg/L、IL-35含量>188.48ng/L和RORα含量>147.63μg/L時，診斷為結核性胸膜炎的可能性較大，籍此可與惡性胸膜炎鑒別。

綜上所述，結核性胸膜炎胸腔積液中，LPS、IL-35、RORα呈高表達，胸腔積液LPS、IL-35、RORα在結核性和惡性胸膜炎的鑒別診斷中具有較高的臨床價值，但具體機制尚需要進一步探討。