良惡性胸腔積液中mRNA表達(dá)譜分析

彭丹 侯子亮 王愛麗 王金祥

胸腔積液是臨床常見疾病，研究發(fā)現(xiàn)[1]42%～77%的胸腔積液是惡性胸腔積液，其中1/3以上的是肺癌胸膜轉(zhuǎn)移。超過半數(shù)的惡性胸腔積液患者在診斷后6個月內(nèi)死亡[2]，惡性胸腔積液的早期診斷和治有助于療改善預(yù)后。但是，現(xiàn)有的診斷技術(shù)如胸水細(xì)胞學(xué)檢查，難以鑒別惡性細(xì)胞和反應(yīng)性間皮細(xì)胞，細(xì)胞學(xué)檢查僅能鑒別40%的惡性胸腔積液[3]。研究提示[4-5]癌胚抗原(carcinoembryonic antigen ，CEA)和 細(xì)胞角蛋白19片段(Cyfra21-1)診斷惡性胸腔積液的敏感性較高，但其假陽性率又會削弱它的診斷效能。目前尚無有效的生物標(biāo)記物鑒別良性及惡性胸腔積液，并且對于惡性胸腔積液的形成機制尚不明確。mRNA是由DNA的一條鏈作為模板轉(zhuǎn)錄而來，攜帶遺傳信息，并能指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成，mRNA參與多種生物學(xué)過程，并且參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。我們在前期研究中[6]發(fā)現(xiàn)良惡性胸腔積液中有大量差異表達(dá)的mRNA，惡性胸腔積液沉淀物中相關(guān)的mRNA可能參與惡性胸腔積液的發(fā)生機制。本研究分析良惡性胸腔積液中差異mRNA，篩選出關(guān)鍵mRNA，并通過分析探索可能參與的調(diào)節(jié)機制。

資料與方法

一、一般資料

本研究符合《赫爾辛基宣言》的原則，我們收集首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京潞河醫(yī)院2018年1月至2018年12月收治的胸腔積液患者6例，均簽署知情同意書，其中3例經(jīng)胸膜活檢或胸腔積液病理證實為肺腺癌患者，另3例胸水涂片鏡檢或PCR檢測確診為結(jié)核性胸膜炎，在樣本采集時所有患者未接受任何抗腫瘤、抗結(jié)核治療。

二、研究方法

標(biāo)本處理：患者入院24小時內(nèi)采用標(biāo)準(zhǔn)胸腔穿刺術(shù)抽取胸腔積液，10mL胸腔積液置于經(jīng)肝素抗凝的離心管中，1200rpm離心5分鐘，棄上清，留取沉淀物，使用TRIzol (Invitrogen, NY, USA)重懸沉淀物，按照廠家說明書提取總RNA，-80°冰箱保存。

mRNA芯片檢測：首先對樣品中總mRNA進(jìn)行質(zhì)控，采用Qubit 3.0 Fluorometer對微量RNA濃度進(jìn)行精確定量，進(jìn)行進(jìn)一步基因芯片檢測。將片段化標(biāo)記后的樣品加入對應(yīng)型號芯片，放入GeneChip Hybridization Oven 645雜交爐，到達(dá)指定時長后使用基因芯片洗脫工作站GeneChip Fluidics Station 450按對應(yīng)Protocol進(jìn)行洗染，使用3000 7G的基因芯片掃描儀(Affymetrix, Santa Clara, CA, USA)對陣列進(jìn)行掃描。掃描儀通過捕獲熒光信號獲得每個探針的信號值，生成CEL文件。使用R軟件包(R version 3.4.4)進(jìn)行原始數(shù)據(jù)數(shù)歸一化和標(biāo)準(zhǔn)化處理，再對所有mRNA進(jìn)行差異表達(dá)分析，得到差異表達(dá)的mRNA。

差異表達(dá)mRNA功能分析及關(guān)鍵mRNA選擇：我們在DAVID(Annotation, Visualization and Integrated Discovery https://david.ncifcrf.gov/)網(wǎng)站進(jìn)行GO(gene ontology)和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)富集分析，對差異mRNA進(jìn)行功能注釋和分類，構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖，并篩選出前20名的關(guān)鍵mRNA，找到基因間相互關(guān)系。在oncomine(https://www.oncomine.org/resource/login.html)中驗證該20個mRNA在肺癌中的表達(dá)差異，提取出同時在oncomine中具有表達(dá)差異的mRNA，分析其在肺癌中與患者生存的關(guān)系。

三、統(tǒng)計方法

我們采用 R (http://www.bioconductor.org/)軟件中的“gcrma”包對基因芯片CEL文件進(jìn)行歸一化和標(biāo)準(zhǔn)化處理。再使用“l(fā)imma”包對所得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行差異表達(dá)分析。良惡性胸腔積液中的差異表達(dá)mRNA根據(jù)t檢驗的方法，設(shè)定FC(fold-change)≥2且p≤0.05為統(tǒng)計學(xué)差異。前期研究中[6]通過聚類分析顯示兩組標(biāo)本間mRNA表達(dá)譜的差異。并采用火山圖的方式展現(xiàn)出兩組差異表達(dá)的mRNA。使用Cytoscape繪制蛋白互作網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖。使用在線工具h(yuǎn)ttp://gepia.cancer-pku.cn/對有差異的基因進(jìn)行生存分析。

結(jié) 果

一、良惡性胸腔積液患者一般資料比較

我們收集6例胸腔積液患者入組，其中3例為肺腺癌合并胸膜轉(zhuǎn)移，3例為結(jié)核性胸腔積液，所有患者均經(jīng)組織病理學(xué)確診。6例患者的人口學(xué)特征(見表1)。

表1 入組患者的人口學(xué)特征

二、兩組患者中差異表達(dá)的mRNA及GO、KEGG分析

基因芯片(Clariom D Human Array)用于檢測良惡性胸腔積液mRNA表達(dá)譜。經(jīng)統(tǒng)計分析，共得到差異表達(dá)的mRNA1716個，其中上調(diào)mRNA1098個，下調(diào)mRNA618個(FC≥2.0 and p < 0.05)。前期研究[6]中對差異表達(dá)的mRNA進(jìn)行GO富集分析發(fā)現(xiàn)，所有差異表達(dá)的mRNA生物學(xué)過程主要集中在細(xì)胞遷移、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞黏附、T細(xì)胞活化、細(xì)胞表面受體信號通路等；其所參與的細(xì)胞組分，主要有細(xì)胞外外泌體、漿膜、原生質(zhì)膜的組成部分、細(xì)胞表面、黏著斑等；另外其參與的分子功能多集中在蛋白結(jié)合、肌動蛋白絲綁定、整合素結(jié)合、鈣粘蛋白結(jié)合及細(xì)胞粘附、細(xì)胞黏附分子結(jié)合等。KEGG分析提示差異mRNA功能，主要集中在以下信號通路：腫瘤信號通路、細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用、細(xì)胞黏附分子、PI3K-Akt信號通路、Rap1信號通路、腫瘤中的蛋白聚糖、黏著斑、T細(xì)胞受體信號通路等。

三、構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，篩選關(guān)鍵基因：我們利用DAVID網(wǎng)站對差異表達(dá)mRNA構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖(圖1)，并篩選出前20個關(guān)鍵基因：APP、CKAP4、LAMB1、LAMC1、SDC2、GPC3、APLP2、RCN1、WFS1、BMP4、SPP1、MSLN、IGFBP3、F5、CSF1、CALU、IGFBP7、CYR61、GOLM1、PDIA6，相互關(guān)系圖(圖2)。其中LAMC1、SPP1、IGFBP3、F5四個基因參與不同KEGG通路(表2)。我們目前無大樣本臨床資料及胸水標(biāo)本進(jìn)行生存分析，考慮我們所收錄的惡性胸腔積液均為肺癌胸膜轉(zhuǎn)移，故我們在http://gepia.cancer-pku.cn/網(wǎng)站利用肺癌數(shù)據(jù)對該4個基因做生存分析，結(jié)果顯示該4個基因的生存曲線均有統(tǒng)計學(xué)差異(圖3)，3個上調(diào)基因(LAMC1、SPP1、IGFBP3)的高表達(dá)及下調(diào)基因F5的高表達(dá)提示較短的生存時間，預(yù)后不良。

圖1 差異表達(dá)mRNA蛋白互作網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖

圖2 關(guān)鍵mRNA蛋白互作網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖

表2 關(guān)鍵mRNA參與的KEGG信號通路

圖3 LAMC1(A)、SPP1(B)、IGFBP3(C)、F5(D)在肺癌患者中的生存曲線LAMC1、SPP1、IGFBP3、F5在肺癌患者中高表達(dá)和低表達(dá)總生存時間比較

討 論

胸腔積液是臨床上常見的疾病，在肺癌中常常以首發(fā)癥狀出現(xiàn)，合并胸腔積液多提示III～I(xiàn)V期肺癌[7]。胸腔積液的診斷首先依據(jù)Light氏標(biāo)準(zhǔn)和胸水生化等明確胸水性質(zhì)為滲出液還是漏出液，如果是滲出液，則需進(jìn)一步完善胸水腫瘤系列、胸水沉淀病理以及微生物檢測等鑒別良惡性胸腔積液，對一些難以鑒別的胸腔積液，甚至需要行胸腔鏡胸膜活檢術(shù)明確。整個診斷過程耗時、耗力，因此臨床上需要靈敏性及特異性更高的生物標(biāo)志物鑒別良惡性胸腔積液。對于惡性胸腔積液的治療在臨床上仍然是個難點，在分子層面探索胸腔積液的生成機制，為胸腔積液的治療提供有利的線索。在我們的研究中發(fā)現(xiàn)LAMC1、SPP1、IGFBP3、F5與肺癌患者的預(yù)后相關(guān)，本文重點分析了LAMC1、SPP1在惡性胸腔積液中的作用。

LAMC1(laminin γ1)是層黏連蛋白家族中的一員，是腫瘤微環(huán)境中一部分，調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)，參與細(xì)胞的分化、遷移、粘附[8]。已有研究[9-11]顯示LAMC1在腦膜瘤細(xì)胞、前列腺癌、子宮癌等多種腫瘤中表達(dá)增高，促進(jìn)癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。Ye GuanXiong[12]等研究發(fā)現(xiàn)LAMC1下調(diào)使 AKT通路失活從而調(diào)節(jié)PKM2的表達(dá)，進(jìn)而抑制肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和Warburg效應(yīng)。目前LAMC1對肺癌的影響鮮有報道，本研究中發(fā)現(xiàn)惡性胸腔積液中LAMC1明顯升高，我們推測LAMC1同樣影響著惡性胸腔積液的進(jìn)展及預(yù)后。

分泌性磷蛋白(secreted phosphoprotein l，SPP1)是一種分泌性磷酸化糖蛋白，屬于細(xì)胞外基質(zhì)(extracell matrix，ECM)，該蛋白參與破骨細(xì)胞粘附于骨礦化基質(zhì)的過程，可促進(jìn)細(xì)胞的黏附和遷移，大量研究證實[13-14]spp1在多種浸潤性癌中發(fā)揮重要作用，如乳腺癌、肺癌、胃癌、結(jié)直腸癌等。一項989例NSCLC的研究[15]顯示SPP1過表達(dá)與NSCLC預(yù)后不良有相關(guān)性。另一項研究亦揭示SPP1可促進(jìn)小細(xì)胞肺癌的增殖活力，抑制凋亡和自噬[16]。有實驗檢測了腫瘤和宿主來源的SPP1在MPE形成中的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SPP1在惡性胸腔積液中起到以下重要作用，SPP1協(xié)同促進(jìn)胸膜積液和胸膜內(nèi)癌擴散; SPP1還可以產(chǎn)生血管內(nèi)皮生長因子非依賴性高通透性作用; 宿主SPP1誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞進(jìn)入胸膜轉(zhuǎn)移瘤內(nèi)并促進(jìn)腫瘤血管生成，而腫瘤SPP1在體內(nèi)抑制癌細(xì)胞凋亡; 腫瘤和宿主SPP1通過不同途徑影響胸膜TNF、基質(zhì)金屬蛋白酶-2、IL-6含量，此外 SPP1還可以激活肺癌細(xì)胞中的NF-kB通路[17]。有研究使用ELISA檢測良惡性胸腔積液中的SPP1表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)惡性胸腔積液中SPP1表達(dá)明顯升高，胸腔積液中SPP1表達(dá)量診斷MPE的準(zhǔn)確性為71.5%(95%CI：64%～80%)，我們試驗中采用基因芯片技術(shù)同樣檢測到惡性胸腔積液中SPP1表達(dá)水平明顯高于良性胸腔積液，證實了SPP1參與惡性胸腔積液的發(fā)生、發(fā)展。

在我們的試驗中發(fā)現(xiàn)多種mRNA存在表達(dá)差異，其中最為顯著且在肺癌中與生存相關(guān)的mRNA有LAMC1、SPP1、IGFBP3、F5，其他研究中也發(fā)現(xiàn)LAMC1、SPP1在惡性腫瘤中存在表達(dá)差異，尤其是SPP1在多項研究中發(fā)現(xiàn)惡性胸腔積液中表達(dá)水平明顯增高，作為診斷指標(biāo)可以提高惡性胸腔積液診斷準(zhǔn)確性，我們的研究中，入組樣本量偏少，且入組樣本都是肺腺癌胸膜轉(zhuǎn)移合并惡性胸腔積液，不能覆蓋肺癌其他病理類型，在后續(xù)研究中增大樣本量，重點研究上述4個mRNA的表達(dá)水平，根據(jù)大樣本數(shù)據(jù)可以聯(lián)合多項指標(biāo)通過簡便快速的方法診斷出惡性胸腔積液。