外周血CD4+CD25+調節性T細胞在妊娠合并ITP患者中的表達及意義*

李明亮，田 笑，馬 昂，欒 亮，劉 靜，劉婷婷

北部戰區總醫院檢驗科，遼寧沈陽 110016

妊娠合并原發免疫性血小板減少癥(ITP)是產科較為常見的一種血液系統合并癥，發病率為0.1%～0.2%，它可以引起凝血功能障礙進而導致產后出血，產后出血一旦發生就很難控制，嚴重后果可能導致產婦死亡，因此對妊娠合并ITP發病機制的研究相當重要。ITP是一種自身免疫性疾病，以骨髓中血小板生成減少、血小板自身抗體的產生、網狀系統血小板清除這3種機制致病[1]，以不明原因血小板減少及出血為主要臨床表現。妊娠過程實際上是一次成功的“母胎耐受”，因此不論是妊娠還是ITP，兩者均與機體自身免疫耐受密切相關，而 CD4+CD25+調節性T(Treg)細胞是一類具有免疫抑制作用的重要輔助性淋巴細胞亞群[2-3]。本試驗通過對妊娠合并ITP患者外周血CD4+CD25+Treg細胞和血小板計數的測定及二者的相關性分析來初步探討CD4+CD25+Treg細胞在妊娠合并ITP中的作用。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2020年1-12月在本院就診的妊娠合并ITP患者100例作為試驗組，其中急性ITP 患者36例，慢性ITP(把妊娠前即有ITP病史的患者定義為慢性ITP)患者64例。患者年齡21～42歲,中位年齡28歲，孕周8～32周。納入標準：(1)至少兩次血常規檢測血小板計數<100×109/L；(2)無其他并發癥；(3)無繼發性血小板減少的因素存在；(4)無其他疾病史。排除標準：一切可以引起血小板減少的其他血液系統疾病；系統性紅斑狼瘡；抗心磷脂抗體綜合征；重度子癇前期；嚴重的產科出血及貧血等。對照組為同期到本院產檢的100例健康產檢孕婦，年齡25～40歲，中位年齡29歲，孕周8～32周。本研究經醫院倫理委員會通過，所有研究對象簽署知情同意書。

1.2儀器和試劑

1.2.1儀器 美國BD FACS Calibur流式細胞儀、德國西門子ADVIA2120全自動血細胞分析儀、新康醫療器械有限公司XK96-A快速旋渦混勻器、離心機等。

1.2.2試劑 異硫氰酸熒光素(FITC)標記的鼠抗人CD4單克隆抗體、藻紅蛋白(PE)標記的鼠抗人CD25單克隆抗體、PE標記的鼠抗人IgG1、經去離子水1∶10稀釋至正常工作濃度的FACS溶血素、磷酸鹽緩沖液，所有試劑均購自美國BD公司。

1.3方法

1.3.1標本采集與處理 試驗組和對照組均用含有EDTA-K2的抗凝管采集清晨空腹靜脈血，每人采集2管，每管約2 mL，采集后立即顛倒混勻10次，注意不要用力振蕩，并于4 ℃冰箱保存，備用。其中一管用于檢測血小板計數，另一管用于流式細胞儀分析。要求所有標本均無凝集、無乳糜、無溶血。

1.3.2血小板計數的檢測 用德國西門子ADVIA2120全血細胞分析儀對兩組標本進行全血細胞分析從而獲得血小板計數結果。

1.3.3CD4+T細胞及CD4+CD25+Treg細胞的檢測 用美國BD流式細胞儀檢測CD4+T細胞及CD4+CD25+Treg細胞。具體步驟：(1)將待測標本從冰箱取出放置室溫后，充分混勻，分別取50 μL于2個上樣管中，一管作為樣品檢測管(T管)，一管作為同型對照管(C管)。T管加入FITC標記的鼠抗人CD4單抗和PE標記的鼠抗人CD25單抗各10 μL，C管加入FITC標記的鼠抗人CD4單抗和PE標記的鼠抗人IgG1各10 μL。漩渦振蕩混勻后，室溫避光孵育15 min。(2)加500 μL溶血素后，漩渦振蕩混勻，室溫避光孵育15 min，裂解紅細胞。(3)1 500 r/min離心5 min，棄上清液，加2 mL PBS清洗細胞，漩渦振蕩混勻。(4)1 500 r/min離心5 min，棄上清液，加500 μLPBS重懸細胞，振蕩混勻。(5)上機檢測，調整電壓和熒光補償，每個上樣管收集10 000個細胞，使用CellQuest軟件進行分析。同樣方法檢測CD4+T細胞，只是不需要加入PE標記的鼠抗人CD25單克隆抗體。

2 結 果

2.1血小板計數結果 妊娠合并急性ITP患者血小板計數為(53.33±18.26)×109/L，妊娠合并慢性ITP患者血小板計數為(76.19±11.23)×109/L，對照組血小板計數為(193.36±46.27)×109/L。

2.2CD4+T細胞、CD4+CD25+Treg細胞測定結果 試驗組 CD4+T細胞、CD4+CD25+Treg細胞及CD4+CD25+Treg細胞/CD4+T細胞比值均低于對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表1。急性ITP患者的CD4+T細胞和CD4+CD25+Treg細胞低于慢性ITP患者，差異均有統計學意義(P<0.05)；急性ITP患者的CD4+CD25+Treg細胞/CD4+T細胞比值低于慢性ITP患者，但差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。

表1 試驗組和對照組CD4+T細胞、CD4+CD25+Treg細胞測定結果

表2 急性ITP和慢性ITP患者CD4+T細胞、CD4+CD25+Treg細胞測定結果

2.3CD4+CD25+Treg細胞與血小板計數的相關性分析 結果顯示，試驗組CD4+CD25+Treg細胞與血小板計數呈較強正相關(r=0.759,P<0.001)，CD4+CD25+Treg細胞/CD4+T細胞比值與血小板計數呈中等程度正相關(r=0.539,P<0.001)。見圖1、圖2。

圖1 試驗組CD4+CD25+Treg細胞與血小板計數相關性分析

圖2 試驗組 CD4+CD25+Treg細胞/CD4+T細胞與血小板計數相關性分析

3 討 論

ITP是一種由體液免疫和細胞免疫共同介導的自身免疫性疾病[4]，患者體內常不明原因地產生血小板抗體，該抗體與血小板膜蛋白結合，導致血小板在單核-巨噬細胞系統(MPS)中過多過快地被破壞，引起血小板減少。妊娠是一種復雜的生理過程，從免疫學角度來看，類似于器官移植，攜帶父源性人類白細胞抗原的胎兒理應受到母體免疫系統的排斥，但事實上母體對胎兒形成了免疫耐受。由此可見，ITP存在免疫耐受異常，妊娠需要免疫耐受維持，二者均與機體免疫耐受密切相關。另外經過臨床病例分析發現，部分ITP患者在妊娠期進行性加重或孕后發病，提示妊娠可能是誘導或加重血小板減少的一個因素[5-7]。

Treg細胞尤其是CD4+CD25+Treg細胞，是一類重要的具有獨立免疫調節能力的T細胞亞群，具有免疫低反應性和免疫抑制性，高表達CD25，低表達CD127，特征性表達叉狀頭轉錄因子3(FOXP3)，與多種自身免疫性疾病、器官移植耐受有關[8-10]。在妊娠過程中，母體外周血及胎兒臍帶血中均存在CD4+CD25+Treg細胞，數量隨著妊娠的進程發生變化，妊娠早期開始升高，中期達到峰值，分娩時降至最低，這種變化說明其參與母胎耐受[11]。還有研究發現，去除受精小鼠體內的CD4+CD25+Treg細胞，小鼠胚胎植入過程嚴重紊亂，導致胚胎無法植入，也說明了CD4+CD25+Treg細胞在妊娠過程中發揮重要的免疫功能[12]。

目前已經有研究表明對于非孕期的慢性ITP患者，血液中CD4+CD25+Treg細胞的數量和比例在其發病機制中發揮了重要作用[13]。然而，對于妊娠合并ITP的患者CD4+CD25+Treg細胞是否也是同樣發揮著作用少見報道。在本試驗中筆者對100例不同孕周、不同年齡的妊娠合并ITP患者按照急性、慢性進行了分組研究，通過數據的比對，發現試驗組CD4+T細胞、CD4+CD25+Treg細胞及CD4+CD25+Treg細胞/CD4+T細胞比值均明顯低于對照組(P<0.05)，并且急性ITP患者的CD4+T細胞和CD4+CD25+Treg細胞低于慢性ITP患者(P<0.05)，但是急性ITP患者的CD4+CD25+Treg細胞/CD4+T細胞比值與慢性ITP患者之間無明顯差異(P>0.05)，這就表明無論在急性還是慢性ITP中，CD4+CD25+Treg細胞同樣發揮著非常重要的作用，并且CD4+CD25+Treg細胞比例與血小板計數呈較強的正相關，而CD4+CD25+Treg細胞/CD4+T細胞比值與血小板計數 呈中等程度正相關。這是因為受妊娠這一特殊狀態的影響，ITP患者免疫功能的變化表現為細胞免疫更加活躍，其發生、發展與妊娠期間機體的免疫系統對自身抗原的識別和耐受異常相關[14-15]。這一現象提示CD4+CD25+Treg細胞數量減少后，導致免疫抑制功能減弱，對效應T細胞的免疫抑制功能不足，可能導致了妊娠期間ITP的發生[16]。有研究表明，其機制可能與表達于CD4+CD25+Treg細胞表面的FOXP3蛋白有關。當阻斷 FOXP3表達后Treg細胞的免疫抑制功能明顯下降，FOXP3 突變或缺乏將導致多種自身免疫性疾病，如系統性紅斑狼瘡、類風濕性關節炎、自身免疫性肝病[17-18]等，因此FOXP3是決定CD4+CD25+Treg細胞免疫抑制功能的關鍵性分子，FOXP3的突變或缺失將會導致Treg細胞的功能缺陷[19]。

本試驗結果顯示，妊娠合并ITP患者外周血CD4+CD25+Treg細胞數量較健康孕婦明顯減少，且在急性ITP患者體內下降更明顯，并且CD4+CD25+Treg細胞與血小板計數呈正相關，這就說明CD4+CD25+Treg細胞在妊娠合并ITP中起著重要的作用。