凍藏條件對人乳脂質及揮發性風味物質的影響

張麗娜，瞿婧妍，尹利昂，劉 君，孫趙娜，周 鵬,*

（1.江南大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2.海爾智家股份有限公司，山東 青島 266101；3.南京醫科大學附屬無錫婦幼保健院，江蘇 無錫 214002）

人乳是由乳腺上皮細胞合成分泌的汁液物質，含有嬰兒生長所需的營養素，含量適中且比例恰當，最易于嬰兒消化吸收且有助于改善循環及器官系統的功能，被譽為“白色血液”[1]。人乳中的脂肪含量約為3%～5%，在營養價值和保護功能方面具有重要作用。人乳脂肪可為嬰兒提供50%～60%的能量，促進脂溶性化合物的運輸和吸收并有助于構成細胞膜的結構，還可針對細菌、病毒等致病微生物為機體提供保護作用[2]。另外，人乳也富含一系列長鏈多不飽和脂肪酸，如二十二碳六烯酸（docosa hexaenoic acid，DHA）和二十碳五烯酸（eicosa pentaenoic acid，EPA）等，它們對嬰兒腦組織和視網膜的正常發育至關重要[3]。因此，人乳具有動植物乳以及配方奶粉無可比擬的營養價值，人乳喂養的優勢不言而喻。

然而，母親們也可能因母嬰疾病或是職業工作等因素而無法及時進行哺育。在此情況下，越來越多的女性選擇使用預存人乳喂養代替直接哺育[4]。人乳的預存方式主要分為冷藏和冷凍。兩者均通過低溫抑制人乳細菌繁殖并延緩某些理化特性的降解達到延長保存期的目的[5]。冷藏能夠在短期貯藏期內最大限度地保持細胞的結構、活力和功能；冷凍能夠在保證人乳品質安全的基礎上大大延長貯藏期限，母親斷奶后仍可使用預存的冷凍人乳進行喂養以最大程度地促進嬰幼兒的生長發育[6-7]。從長期貯藏的角度考慮，學者們更推薦使用凍乳。

已有研究表明，人乳脂質特性在凍藏過程中會發生變化，主要集中在脂肪總量、脂肪分解、脂肪氧化等方面[8-10]，對于貯藏過程中脂肪酸組成及揮發性風味物質組成等方面的研究較少。此外，以往的研究多集中于探究-18～-20 ℃或-70～-80 ℃兩個溫度區間的變化，而-18～-20 ℃雖然是家庭最常見的貯藏溫度，但貯藏期有限；另一方面，-70～-80 ℃冰箱效果雖好，但造價昂貴且噪音較大，不適合應用于家庭。近年來，越來越多的家用電器公司開始探索深低溫技術，嘗試開發專用于儲存母乳的-20～-70 ℃冰箱。與金槍魚、三文魚等高端食品低溫循環使用的商用冰箱一樣，-20～ -70 ℃可以最大限度地保持其質地和風味，滿足經濟和實際需求。然而，目前還沒有關于人乳脂肪在-20～ -70 ℃冷凍過程中變化的信息。

因此，本研究將探尋人乳脂質及揮發性風味物質在不同凍藏條件下的變化。以新鮮人乳為對比，分別探究人乳脂質在不同凍藏溫度（-18 ℃和-60 ℃）以及相同溫度下不同降溫速率（-60 ℃和-60 ℃快速冷凍（Q））的變化差異，為尋求研制合適、經濟的人乳專用貯存冰箱條件提供科學依據，為凍乳的貯藏提供科學指導意見。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

本研究受江南大學醫學倫理委員會批準，遵照相關標準選擇人乳收集對象，所有參與本研究的母親均簽署了知情同意書。篩選標準如下：

入選標準：產后1～9個月；一次性分泌大于50 mL乳汁；分娩健康足月新生兒（37～24 周），孕前和孕期身體健康。

排除標準：有抽煙、酗酒和濫用毒品史；患有乳腺炎、傳染病或精神病；患腫瘤、癌癥、糖尿病等疾病。

無菌儲奶袋 積谷（上海）貿易有限公司。

1.1.2 試劑

正庚烷（色譜純）、14%三氟化硼-甲醇溶液（BF3-Methanol） 阿拉丁試劑（上海）有限公司；十一碳酸甘油三酯標準品（純度＞99%） 美國Nu-chek公司；尼羅紅染料 美國Sigma公司；非酯化脂肪酸（nonesterified fatty acids，NEFA）試劑盒（A042-1-1）、脂質過氧化物（lipid peroxide，LPO）試劑盒（A106-1-2） 南京建成生物工程研究所；其余試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

BC/BD-318HD臥式冷凍柜、DW/BD-55W321E臥式單溫深冷凍柜 中國海爾集團；UT322高精度接觸式溫度計（K型熱電偶） 優利德集團有限公司；EL204電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；UV-2700紫外-可見分光光度計 日本島津公司；Microtrac S3500激光粒度分析儀 美國Microtrac公司；TCS SP8 STED 3X超高分辨率多光子激光共聚焦顯微鏡 德國徠卡公司； SCIONSQ-456-GC氣相色譜-質譜聯用儀 美國布魯克公司。

1.3 方法

1.3.1 人乳收集與處理

本研究共收集了無錫市20 位母親的乳汁。乳汁由母親清潔雙手及乳房后，用電動吸奶泵采集，并用無菌儲奶袋貯存。采集時間為上午8:00—10:00，所有樣品收集后立即放入冰盒，在2 h內運送至實驗室。所有樣品運送至實驗室后，在無菌燒杯中進行混合，混合后按要求分裝至各無菌儲奶袋中。

新鮮樣品立即進行指標測定；將分裝好的樣品分成3 組，先置于4 ℃預冷。其中2 組分別置于-18 ℃和 -60 ℃條件下冷凍貯存；在相同-60 ℃條件下放入風機，調節風速為2 m/s，將剩余一組置于其中貯存，記為-60 ℃（Q）組。將3個熱電偶探頭分別置于3 組儲奶袋的中心位置，監測樣品從離開預冷狀態至冷凍4 h之間的中心溫度變化。以上樣品同時置于3 組冷凍條件開始進行冷凍處理并開始溫度監測，貯存60 d和180 d后取出，隨即置于45 ℃水浴環境，以振蕩方式使凍乳完全解凍，解凍后立即進行指標測定。

1.3.2 人乳脂肪含量測定

脂肪含量的測定參考羅茲-哥特里（Rose-Gottlieb）法，并進行適當修改。脂肪酸成分的測定參考Lacomba等[9]的方法，并進行適當修改。吸取2.5 mL樣品于具塞試管中，加入0.4 mL氨水混勻30 s，于60 ℃水浴5 min，再振搖2 min，加入2.5 mL 96%乙醇溶液搖勻2 min，于冷水冷卻，依次加入6.25 mL乙醚振搖30 s，6.25 mL石油醚振搖30 s，靜置30 min，待上層液澄清后，讀取醚層體積。用移液管移取1 mL有機層到恒質量的稱量瓶，于通風櫥揮發30 min，再置于烘箱中于105 ℃干燥至恒質量，記錄稱量瓶烘干前后質量。人乳脂肪含量按式（1）計算：

式中：X為脂肪質量濃度/（mg/mL）；V為樣品體 積/mL；m1為稱量瓶烘干后質量/g；m2為稱量瓶烘干前質量/g；V1為醚層上體積/mL；V2為醚層下體積/mL。

1.3.3 NEFA及LPO含量的測定

使用試劑盒測定，參照試劑盒說明書進行操作。

1.3.4 脂肪酸成分的測定

參考Lacomba等[9]的實驗方法，并進行適當修改。取5 mL人乳，加入15 mL的三氯甲烷-甲醇混合液（2∶1，V/V）及2 mL 2 mg/mL的十一碳酸甘油三酯標準品，隨后渦流振蕩2 min；靜置10 min后加入5 mL 20%氯化鈉溶液，于25 ℃、3 500×g離心10 min；取下層氯仿層，于3 g無水硫酸鈉脫水后氮氣吹干；吹干后加入5 mL 0.5 mol/L氫氧化鈉-甲醇溶液，70 ℃回流10 min；加入5 mL 14%三氟化硼-甲醇溶液，70 ℃回流5 min；加入2 mL正庚烷及5 mL飽和氯化鈉溶液，混合后靜置10 min；取1 mL上層清液于0.22 μm有機系濾膜過濾。

脂肪酸測定采用氣相色譜-質譜聯用儀。氣相色譜條件：反式色譜柱（100 m×0.25 mm，0.20 μm），載氣為氦氣，載氣流速為1 mL/min，進樣口溫度240 ℃，進樣量200 μL，分流比為100∶1。采用程序升溫，初始溫度為60 ℃，保持1 min，然后以20 ℃/min升至120 ℃，保持1 min；然后以5 ℃/min升至240 ℃，保持15 min。質譜條件：離子源溫度300 ℃；傳輸線溫度240 ℃；質量掃描范圍m/z50～500；溶劑延遲時間4 min。

1.3.5 激光共聚焦顯微鏡觀察

采用超高分辨率多光子激光共聚焦顯微鏡觀察人乳脂肪球（human milk fat globule，HMFG）的形態。使用丙酮配制質量濃度為1.0 mg/mL的尼羅紅染液。取200 μL乳樣，加入2 μL尼羅紅染液用以標記脂肪，混勻后于室溫避光反應20 min。取8 μL已標記好的樣液置于載玻片上，隨后小心蓋上蓋玻片，封片處理。設定尼羅紅激發波長為552 nm，使用20 倍物鏡進行觀察。

1.3.6 揮發性風味成分分析

參考Spitzer等[11]的方法，并進行修改。取5 mL人乳，加入10 μL 50 mg/L 4-甲基-2-戊酮作為內標，萃取頭50/30 μm DVB/CAR/PDMS于60 ℃頂空萃取30 min。 吸附完成后將進樣針插入氣相色譜-質譜聯用儀在250 ℃解吸6 min。

色譜條件：載氣為高純氦氣，不分流進樣，流速為0.80 mL/min。采用DB-WAX彈性毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），40 ℃柱初溫條件下保持3 min，接著以5 ℃/min升溫至90 ℃，之后以6 ℃/min升溫至230 ℃并保持6 min。質譜條件：進樣口和接口溫度均為250 ℃；采用電子電離源；電離電壓和發射電流分別為70 eV和200 μA；溫度200 ℃；四極桿溫度150 ℃；檢測器電壓1 kV；質量掃描范圍33～400 u。

1.4 數據分析與處理

所有指標的測定結果均以±s表示。數據統計分析使用IBM SPSS Statistics 20版軟件進行處理。方差使用通用線性模型程序，數據之間的顯著性差異使用Duncan模型在P值小于0.05水平進行分析。

色譜原始文件用Xcalibur分析，經檢索數據庫NIST 2005和Willey 7檢索后，選出純度與匹配度均大于800的檢測結果，各組分含量以μg/100 mL表示。按式（2）計算氣味活度值（odour activity value，OAV），用以評價該揮發性組分對人乳總體風味的影響，OAV大于1的物質對樣品風味的形成具有重要貢獻。

式中：Cx為化合物x的質量濃度/（μg/100 mL）；OTx為該化合物的感覺閾值/（μg/100 mL）。

2 結果與分析

2.1 凍結方式差異

由圖1A可知，-18、-60 ℃和-60 ℃（Q）三組人乳樣品到達各條件目標溫度（-18 ℃/-60 ℃/ -60 ℃）的時間分別為117、72.5 min和55 min。在4 h監測期內，-18 ℃冷凍條件存在輕微的溫度波動， -60 ℃兩組條件下溫度變化較為穩定。由圖1B可知，當樣品通過最大冰晶形成區時，樣品中心溫度在0～-1 ℃范圍內下降速度最慢，3 組樣品通過0～-1 ℃溫度區間的時間分別為60、17.5 min和7.5 min。

圖1 不同凍藏條件下中心溫度變化曲線Fig. 1 Freezing curves of human milk under different freezing conditions

-18、-60 ℃和-60 ℃（Q）三種凍結方式的主要差異在于冷凍溫度及冷卻速率。在食品凍藏過程中，冰晶的形成和變化對食品品質有至關重要的作用[12]。冰晶的大小與冷卻速率和成核溫度密切相關，冷卻速率越低，成核溫度越高，形成的冰晶越大[13]。本研究中設置的-18 ℃條件更貼合普通家用冰箱的冷凍環境，凍結速率緩慢且存在小幅溫度波動；-60 ℃的2 組冷凍條件凍結速率顯著高于-18 ℃且達到恒溫冷凍效果， 其中-60 ℃（Q）條件在最大冰晶形成區的凍結速率約為-60 ℃條件的2 倍，這表明2 m/s風機在本研究體系中成功應用。

2.2 脂質含量變化

圖2結果顯示，人乳樣品在-18 ℃條件下凍藏60 d后，脂肪含量出現明顯下降。而在-60 ℃條件下，以不同速率凍藏的2 組樣品，其脂肪含量在凍藏180 d后與新鮮樣品在統計學上沒有顯著差異。該結果與翟英辰[10]監測-18 ℃與-80 ℃條件下人乳宏量營養素變化的結果相似。目前已有的相關研究表明，無論是冷藏還是冷凍，低溫保存都可能引發乳中各營養素的一系列物理化學變化。人乳中的脂肪，主要以乳脂肪球（milk fat globules，MFG）的形式存在于水相中，約98%的甘油三酯（triacylglycerol，TAG）呈層狀排列在內部，由極性酯（如磷脂、膽固醇等）組成的膜包裹在MFG外部[14]。造成不同低溫條件下脂肪含量差異的原因主要是TAG分解程度不同，分解程度的關鍵在于脂肪酶活性的大小。此前有研究表明即使在-20 ℃條件下，脂肪酶也能夠保持一定活性，從而造成TAG的水解[15-16]。因此，相比于普通-18 ℃低溫條件，深低溫條件能夠更好地延緩脂肪的降解。另一方面，García-Lara等[17]測得超聲勻化復溫人乳的宏量營養素含量高于手動勻化樣品，指出人乳中的營養素分子在凍融過程中可能附著于器壁表面。因此，除脂質分解外，-18 ℃條件下也可能出現脂肪附著的現象，使測得的脂肪含量下降。

圖2 不同凍藏條件下人乳脂肪含量Fig. 2 Fat contents of human milk under different frozen storage conditions

2.3 NEFA含量變化

脂質除98%甘油三酯外，0.5%～1%的脂質含量由磷脂組成，0.2%的乳脂以甾醇的形式存在，極微量的游離脂肪酸、二甘油酯和單甘酯則以脂肪分解副產物的形式存在[18]。如圖3所示，新鮮人乳中的NEFA較少，濃度僅為0.37 mmol/L。在-18 ℃凍藏期內，NEFA持續顯著增加，由60 d的12.68 mmol/L增加至180 d的33.07 mmol/L； 在-60 ℃凍藏期內，NEFA含量增幅較小，維持在1.62～1.90 mmol/L范圍內，且-60 ℃條件下的2種凍結速率對人乳脂解水平的影響并不顯著。這與Ahrabi[19]及Berkow[20]等的研究報道相符，表明-18 ℃條件下脂質水解更嚴重（圖3）。NEFA含量的增加對人乳品質及消化的影響尚無定論。一方面，Hernell等[21]指出當嬰兒十二指腸內膽鹽較低時，NEFA比酯化脂肪酸吸收更好，因此NEFA的增加有可能提高嬰兒的生物利用度；另一方面，NEFA也可能會在貯存過程中形成離子化脂肪酸，與乳中的鈣或其他成分結合，使其無法被吸收[22]。

圖3 不同凍藏條件下NEFA含量Fig. 3 Contents of non-esterified fatty acids under different frozen storage conditions

NEFA的形成主要源于脂肪酶的作用。人乳中含有2種脂肪酶，分別為膽鹽刺激脂肪酶（bile salt-stimulated lipase，BSSL）和脂蛋白脂肪酶或血清刺激脂肪酶（serum-stimulated lipase，SSL）[23]。BSSL能改善脂肪的消化和吸收，并在視黃醇酯、膽固醇酯等多種物質的消化中發揮作用[24]。SSL在嬰兒消化中暫無相關功能報道，但其在乳腺中對循環脂肪酸的吸收有一定作用[25]。由于人乳中缺乏激活BSSL所需的膽鹽濃度，學者們更傾向于將脂解現象的發生歸因于SSL。目前有研究證實SSL與牛乳及人乳的脂解有關，且闡明了SSL在牛乳加工中的自發性和誘導性水解脂肪作用，而人乳貯藏過程的具體脂解機制還有待進一步探究[26]。

2.4 LPO含量變化

人乳中含有大量抗氧化物質，有助于新生兒應對氧化應激現象[27]。脂質過氧化作為氧化應激的一種指標，是氧或其他氧化劑對不飽和脂肪酸直接作用的結果[8]。當乳中自由基負荷超過抗氧化系統中和能力時，不飽和脂肪酸易受過氧化作用產生有細胞毒性的LPO，其分解產物有丙二醛（malondialdehyde，MDA）和4-羥基烯烴類等物質[28]。此前，Miranda等[8]對比了人乳在4 ℃下貯藏24 h和-20 ℃貯藏10 d的脂質氧化情況，發現MDA只在冷藏乳中增加，而不在冷凍乳中增加；Silvestre等[29]發現人乳在-20 ℃和-80 ℃貯藏1個月后，MDA含量均保持穩定，繼續貯藏1個月后穩定性喪失。

本研究中的脂質過氧化情況與脂解趨勢相似。新鮮人乳中LPO濃度約為1.33 μmol/L。-18 ℃條件下，LPO濃度持續顯著增加，由60 d的3.34 μmol/L增加至180 d的7.60 μmol/L；LPO含量在-60 ℃兩組條件下凍藏60 d后與新鮮樣品無差異，但凍藏180 d后出現少量增加，-60 ℃濃度為3.02 μmol/L，-60 ℃（Q）濃度為2.94 μmol/L。 一方面，冷凍會造成乳脂肪球膜（milk fat globule membrane，MFGM）不同程度的破壞，使脂質暴露，加劇氧氣與其他氧化劑對脂肪酸的作用，同時隨著貯藏時間的延長，LPO含量逐漸增加（圖4）。另一方面，乳中過氧化物的增加與抗氧化成分活性的下降有關[30]。本研究暫未探究相關活性的變化，但Miranda[8]和Silvestre[29]等均報道了在-20 ℃條件下，谷胱甘肽過氧化物酶活性下降的現象。因此，相比于普通-18 ℃條件，本研 究-60 ℃冷凍體系能夠更好保護脂質免受過氧化傷害。然而，隨貯藏時間的延長，脂質過氧化不可避免，如何評價脂質過氧化程度值得進一步探討。

圖4 不同凍藏條件下LPO含量Fig. 4 Lipid peroxide contents under different frozen storage conditions

2.5 脂肪酸組成變化

如表1所示，共測得10種飽和脂肪酸（saturated fatty acid，SFA），9種單不飽和脂肪酸（monounsaturated fatty acid，MUFA）和13種多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid，PUFA）。總脂肪酸中SFA以棕櫚酸（C16:0）為主，UFA以油酸（C18:1,ω-9）和亞油酸（C18:2,ω-6）為主。該結果與夏袁等[31]報道相似。

表1 不同凍藏條件下脂肪酸組成Table 1 Fatty acid compositions under different frozen storage conditions

目前關于凍藏條件下脂肪酸組成的研究較少。Lacomba等[9]觀察到-20 ℃冷凍30 d后人乳脂肪酸含量沒有顯著降低；Romeu-Nadal等[32]分析了脂肪酸在-20 ℃和-80 ℃條件下貯藏12個月的變化，結果表明脂肪酸不受冷凍過程的影響。與該結果類似，本研究中SFA和PUFA占比在統計學上沒有顯著差異，而-18 ℃凍藏180 d的人乳MUFA占比略有下降。然而，本研究發現一些UFA，如棕櫚油酸（C16:1,ω-7）、油酸、亞油酸和亞麻酸（C18:3,ω-3），在-18 ℃凍藏180 d后的絕對含量下降較為明顯，而花生四烯酸（C20:4,ω-6）、EPA（C20:5,ω-3）和DHA（C22:6,ω-3）在3種條件下凍藏180 d后均出現下降。該結果表明，冷凍處理可能不會影響人乳脂肪酸的總體組成占比，但會造成DHA等長鏈多不飽和脂肪酸含量的下降。這種下降可能是貯藏過程中人乳脂質水解和氧化反應共同作用的結果。過長的凍藏時間可能會導致人乳脂所具備的生理功能作用下降。

2.6 微觀結構的變化

對不同凍藏條件下的HMFG微觀結構進行測定后，得到結構變化如圖5所示。不同于新鮮樣品的均勻分布，冷凍后的HMFG均有不同程度的聚集，其中，-18 ℃條件下的HMFG聚集融合現象最為明顯。這主要是因為HMGF的組織結構對溫度和變溫速率高度敏感[33]。一方面，凍藏溫度越低，MFGM上各磷脂的降解速率越慢[34]。 同時，MFGM也會在冷卻過程中釋放一些蛋白和磷脂，造成穩定性下降[14]。另一方面，在本研究凍結體系中，不同冷凍條件生成形態不一的冰晶，從而導致MFGM不同程度的破裂，而穩定性降低的MFG會相互聚集或在膜破裂處進行融合。由于-18 ℃屬于普通低溫而非深低溫條件且凍結速率緩慢，因此MFGM的結構與組成在此條件下更易發生改變，微觀結構與粒徑的變化比-60 ℃更為明顯（圖5）。

圖5 不同凍藏條件下乳脂肪球微觀結構Fig. 5 Microstructure of milk fat globules under different frozen storage conditions

值得注意的是，MFGM結構復雜獨特，其上存在的多種蛋白和脂質在大腦發育與腸道微生物菌群等方面具有重要的生理學意義[35]。目前，有關人乳MFGM的研究多集中在物種差異或特定功能物質等方面，其在貯藏過程中的變化機制及功能影響還有待研究。

2.7 揮發性物質的變化

本研究體系共測得53種主要的揮發性成分，分別為19種烴類化合物、4種醇類化合物、9種醛類化合物、4種酮類化合物、6種酸類化合物、9種酯類化合物及2種含硫含氮化合物。各類化合物的具體組成如表2所示。

新鮮人乳含有的揮發性物質含量較少，風味特征并不明顯；隨凍藏時間的延長，各類物質均有所增加。其中-18 ℃條件下揮發性風味物質含量的增幅最為明顯，而-60 ℃兩種條件下的增速則顯著放緩，增長物質以酸類及醛類為主，烴類物質次之。

基于所有揮發性物質的主成分分析（principal component analysis，PCA）評分結果（圖6A）顯示，在-60 ℃及-60 ℃（Q）條件下凍藏60 d的2 組樣品的得分點與新鮮樣品最為接近；其次是在-60 ℃及 -60 ℃（Q）條件下凍藏180 d的2 組樣品，其中-60 ℃（Q）相比于-60 ℃略顯優勢；而在-18 ℃凍藏60 d與180 d的樣品得分點則明顯與其分開，且60 d與180 d的得分點按逆PC1方向逐漸分離，表明這2 組樣品的揮發性組成物質存在顯著差異。該結果表明，凍藏溫度越低，時間越短，人乳原有風味物質保持越好。

計算各組分OAV并將OAV大于1的關鍵物質進行PCA后可知，各凍藏組得分的分布趨勢（圖6B）與基于所有揮發性物質的得分點分布一致。結合表2及圖6B可知，醛類及酸類化合物含量高且閾值低，是凍藏過程中的主要揮發性化合物，2 類化合物的關鍵貢獻性物質分別為己醛、庚醛、辛醛、壬醛、(E)-2-辛烯醛和(E,E)-2,4-壬二烯醛，以及己酸、辛酸和癸酸。酮類及醇類化合物含量雖低，但由于個別物質閾值較低，因而也對風味有一定程度的貢獻，如1-辛烯-3-酮、2-壬酮及1-辛烯-3-醇。此外，烴類化合物雖增幅明顯，但因其風味閾值較高，故在醛類及酸類等化合物風味強度較明顯的情況下，其現有濃度對人乳風味的貢獻程度較弱。

表2 不同凍藏條件下的揮發性物質組成Table 2 Composition of volatile compounds under different frozen storage conditions μg/100 mL

續表2 μg/100 mL

圖6 不同凍藏條件下揮發性物質的PCA評分圖 Fig. 6 Principal component analysis score plot of volatile compounds under different frozen storage conditions

具體分析看，烴類化合物來源復雜并且出現頻率不穩定，它可能源自乳中游離脂肪酸的自動氧化[36]。相比于烴類化合物，醇類及酮類化合物的變化相對穩定，種類無明顯變化，但閾值較低的1-辛烯-3-酮和1-辛烯-3-醇含量在-18 ℃有所提升，這2種物質具有蘑菇香氣。酯類化合物整體呈現甜香、果香等令人愉悅的氣味特征，OAV及PCA（圖6B）結果表明，酯類化合物中只有乙酸乙酯對整體氣味貢獻較大，且主要存在于新鮮人乳及 -60 ℃凍藏人乳中。在酸類化合物中，具有脂肪味、汗臭味的癸酸、辛酸、己酸對凍乳風味貢獻較大。醛類化合物是本研究中對氣味變化貢獻最大的一類化合物，主要呈現青草香、脂肪味及腐臭味。貢獻顯著的組分均主要存在于-18 ℃凍藏人乳中，按OAV評價貢獻依次為己醛、壬醛、辛醛、(E,E)-2,4-壬二烯醛、庚醛以及(E)-2-辛烯醛，其中，(E,E)-2,4-壬二烯醛以及(E)-2-辛烯醛僅存在于-18 ℃凍藏人乳中（表2）。雜環化合物中，表現出黃油味和青豆味的2-正戊基呋喃在-18 ℃凍藏180 d后，氣味特征開始顯現。

綜上所述，相比于-60 ℃兩種條件，-18 ℃凍藏人乳各類物質增幅較大且更易產生青草香、脂肪味、腐臭味、汗臭味等異味物質。具有青草香、脂肪味等氣味的物質，其生成機制主要是脂質的降解與氧化[37]。這些異味物質的前體以PUFA為主，典型前體是亞油酸或亞麻酸，也包含EPA和DHA，可通過酶催化過程或自動氧化機制形成相應的羰基氧化物[11,38]。酮類和醇類異味物質的產生主要源自亞油酸，亞油酸在脂肪氧化酶E2及裂解酶的作用下經過一系列氧化降解反應，生成C8及C10的羰基化合物，如1-辛烯-3-酮和1-辛烯-3-醇；醛類異味物質的產生主要源自亞麻酸，亞麻酸在脂肪氧化酶、裂解酶、氫化酶及異構酶的作用下可生成C6及C9的羰基化合物，如己醛、(E,E)-2,4-壬二烯醛等。具有腐臭味和汗臭味物質的增加可歸因于游離脂肪酸濃度的增加[39]。該結果與NEFA、LPO、PUFA含量的變化，均表明-60 ℃兩種條件可更好地維持人乳脂質在凍藏過程中的性能。

然而，有學者指出，雖然嬰兒的嗅覺與味覺敏感度高于成人，但其對異味的接受度也高于成人，這主要與嬰兒早起接觸的環境與經歷有關[40]。因此，即便是成人不可接受的風味，對于嬰兒來說也可能在可接受范圍內，這也為人乳風味研究帶來了一定的難度。未來的研究可將對嬰兒喂養行為的觀察與風味化合物的定量分析相結合，以確定嬰兒對異味風味物質的可接受閾值。

3 結 論

不同凍藏條件對人乳脂質及揮發性風味物質的影響具有顯著差異。與傳統的家庭-18 ℃冷凍條件相比， -60 ℃深低溫冷凍條件具有凍藏溫度低、凍結速度快、溫度波動小的特點，有利于延緩脂質的降解和過氧化水平的升高，減少冰晶對脂質結構的破壞，減少醛類及酸類等異味物質的產生，盡可能保持人乳脂所具備的生理功能。雖然-60 ℃（Q）的快速凍結方式在脂質降解與氧化方面與-60 ℃無顯著差異，但-60 ℃（Q）的快速凍結能夠更有效地維持人乳的原有風味。該結果為研制人乳專用貯藏冰箱提供數據支撐，也為進一步研究人乳貯藏方式提供思路和依據。