湘產濃香型白酒釀造過程中氨基甲酸乙酯含量變化規律

黃雄偉 李文祥 曾憲峰 李 青 張建輝

(1. 湖南省產商品評審中心，湖南 長沙 410000；2. 湖南志成食品技術服務有限公司，湖南 長沙 410000；3. 廣電計量檢測〔湖南〕有限公司，湖南 長沙 410007)

氨基甲酸乙酯(Ethyl carbamate，EC)又名尿烷、胺甲酸乙酯等，是一種具有致突變性、免疫抑制性及心率抑制性的2A類致癌物質[1-2]，廣泛存在于釀造酒等發酵產品中[3-4]。因此，部分國家制定了酒精飲料中EC的限量標準。如加拿大對佐餐葡萄酒限量值為0.03 mg/L，加強葡萄酒限量值為0.1 mg/L，蒸餾酒限量值為0.15 mg/L，烈性酒和水果白蘭地限量值為0.4 mg/L[5]。美國FDA規定：1988年以后生產的佐餐葡萄酒(酒精度≤14%)EC含量不能超過0.015 mg/L，1989年以后生產的甜葡萄酒(酒精度≥14%)EC含量不能超過0.06 mg/L。2002年聯合國糧農組織將其作為重點監控物質，并制定了國際標準，含量不得超過0.02 mg/L[6]。

湘產濃香型白酒具有悠久的歷史。近年來，白酒中EC的含量調查、機理形成，含量控制以及風險評估等研究日益引起人們的關注[7-9]，但研究對象均為基酒(包括生產企業自產的基酒和實驗室蒸餾后的基酒)，而有關窖泥、酒醅和酒糟中EC含量的測定及變化規律研究尚未見報道。研究擬對原糧、窖泥、酒醅、酒糟以及基酒中的EC含量進行檢測，并采用統計分析手段對不同工藝流程中的含量進行分析，旨在為提高濃香型白酒的安全性提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

自2021年3月起，于湖南省內某濃香型白酒生產企業采集183批次樣品，其中糧食原料樣品7批次，窖泥樣品36批次，酒醅樣品64批次，酒糟樣品10批次，新釀基酒樣品48批次，貯存年份基酒18批次。

1.2 試劑和設備

二氯甲烷、正己烷、乙腈：色譜純，默克化工技術(上海)有限公司；

氯化鈉、乙二胺-N-丙基(PSA)：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

氨基甲酸乙酯標準品：上海安譜實驗科技股份有限公司；

氣相色譜—質譜儀：Agilent 7890B-5977A型，安捷倫科技(中國)有限公司；

旋轉蒸發儀：Hei-VAP Advantage ML/G3型，廣州市京度進出口有限公司；

電子天平：ME204E型，梅特勒—托利多科技(中國)有限公司；

離心機：TDL-5A型，廣州云星科學儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 色譜條件 毛細管色譜柱為HP-INNOWAX，30 m×0.25 mm×0.25 μm；進樣口溫度220 ℃；不分流進樣；進樣量1 μL；柱溫：初溫50 ℃，保持1 min，以8 ℃/min升至180 ℃，以20 ℃/min升至220 ℃。載氣為氦氣，純度≥99.999%，流速1 mL/min。

1.3.2 質譜條件 電子轟擊源(EI)，能量為70 eV；四級桿溫度150 ℃；離子源溫度230 ℃；傳輸線溫度250 ℃；溶劑延遲5 min；選擇離子監測(SIM)；氨基甲酸乙酯選擇監測離子(m/z) 44，62，74，89，定量離子62。

1.3.3 檢測方法 準確稱取10.00 g試樣于濃縮瓶，40 ℃ 水浴減壓濃縮至液體少于2 mL，用水洗滌轉移至50 mL離心管中，加水使液體最終體積為10 mL，加入適量氯化鈉振搖使其過飽和。加入10 mL二氯甲烷，渦旋混勻1 min，4 000 r/min離心3 min，將下層有機相轉移入濃縮瓶中。水相中加入10 mL二氯甲烷，重復提取2次，合并下層有機相，40 ℃水浴減壓濃縮至近干。

準確移取2 mL乙腈至濃縮瓶中，溶解殘渣并轉移至10 mL離心管中，加入2 mL正己烷，渦旋混勻1 min，4 000 r/min 離心3 min，棄去正己烷相，加入2 mL正己烷重復凈化1次。向乙腈相中加入0.05 g PSA填料，渦旋混勻1 min，過0.45 μm有機相濾膜。GC-MS外標法定量測定。

1.4 數據處理與統計

采用Excel 2016統計軟件進行數據統計與整理；t檢驗采用SPSS 22.0數據分析軟件。

2 結果與分析

2.1 釀造過程中不同物料氨基甲酸乙酯含量

由表1可知，7批次原糧均未檢出EC，窖泥、酒糟、酒醅、新釀基酒(含酒頭、酒尾)和貯存基酒(貯存期1～10年不等)的EC平均檢出值分別為84，124，170，270，325 μg/kg，EC檢出率分別為72.2%，90.0%，98.4%，98.0%，100.0%。

表1 樣品檢測結果?

原糧中未檢出EC，說明原糧本身不含有EC，但原料產區和品種的不同會影響白酒中EC含量，這與原糧發酵過程產生的尿素等前體物質的含量高低有關[10]。白酒中EC的產生和積累與前體物質尿素含量具有較大相關性[11]，由尿素與乙醇反應生成；窖泥中含有一定量的尿素，但乙醇含量較低，因此其EC含量相較于酒醅、酒糟的要低；白酒在蒸餾過程中溫度可達100 ℃，EC沸點為184 ℃，但由于其溶于水和乙醇，有少量酒醅中的EC經蒸汽流入基酒中，因此酒醅中的EC含量要高于酒糟；而基酒中的EC主要在蒸餾過程中和蒸餾后貯存過程中產生。

2.2 不同蒸餾段基酒中氨基甲酸乙酯含量

由表2可知，酒頭和酒尾EC含量顯著性檢驗P=0.041<0.05，說明酒頭和酒尾間存在顯著差異，且酒頭EC含量顯著高于酒尾；中間段基酒和酒頭、酒尾間顯著性檢驗P值分別為0.516，0.071，不顯著，具體原因尚需進一步研究，這與張瑩等[12]的結果基本一致，進一步證實了濃香型白酒在蒸餾過程中“掐頭”的重要性。

表2 不同蒸餾段基酒t檢驗方差分析表(LSD多重比較)?

2.3 不同層酒醅和基酒中氨基甲酸乙酯含量

對采集的上、中、下3層酒醅和基酒(掐頭去尾后)按試驗方法分別進行含量檢測，采用SPSS對檢測結果進行方差分析，結果表明不同層酒醅EC含量顯著性P=0.770>0.05，不同層基酒EC含量顯著性P=0.980>0.05，因此不同層酒醅和基酒間的EC含量無顯著性差異。不同層酒醅EC含量無顯著性差異可能是由于不同層酒醅之間的活性微生物數目差異較小，群落組成無明顯差異[13]，使得產生的尿素等EC前體物質無顯著性差異。而不同層基酒EC含量無顯著性差異的原因與基酒中的EC含量形成機理(主要為蒸餾過程中產生)有關[7]。

2.4 貯藏時間對氨基甲酸乙酯含量的影響

由圖1可知，隨著貯藏時間的延長，無論是酒頭、酒尾還是中間段基酒，EC含量均有不同程度的升高，升高幅度為0.5～2.0倍，EC含量隨貯藏時間的延長而升高的原因可能與其前體物質尿素或氰化物等含量有關[14-15]。從絕對增長幅度來看，酒頭>中間段基酒>酒尾，其原因可能是酒頭、中間段基酒中EC的前體物質繼續與乙醇生成EC。

圖1 基酒EC含量與貯藏時間關系圖

由圖2可知，不同品種濃香型白酒貯存3～5年后，EC含量逐漸達到峰值，隨后慢慢回落至1年貯存期水平，與張瑩等[12]的結論基本一致，具體原因尚需進一步研究。

圖2 年份基酒EC含量與貯藏年份關系圖

3 結論

試驗表明，濃香型白酒各工藝階段中，酒糟、酒醅、基酒以及窖泥中普遍存在氨基甲酸乙酯，酒醅中氨基甲酸乙酯含量高于酒糟，且不同蒸餾段基酒中酒頭的氨基甲酸乙酯含量顯著高于酒尾。基酒存放過程中，酒頭中氨基甲酸乙酯含量的絕對增幅高于中間段基酒和酒尾，因此，“掐頭”是降低成品酒中氨基甲酸乙酯含量的有效手段。濃香型白酒的基酒和酒醅中氨基甲酸乙酯含量無相關性，個別基酒中的氨基甲酸乙酯含量甚至高于酒醅，說明濃香型白酒中的氨基甲酸乙酯主要來源于蒸餾過程和貯存過程。因此如何降低發酵過程中產生的氨基甲酸乙酯前體物質含量，減少蒸餾和貯存過程中氨基甲酸乙酯的生成，是企業控制成品白酒中氨基甲酸乙酯含量的重點。同時，濃香型白酒貯存3～5年后，氨基甲酸乙酯含量逐漸達到峰值，隨后有所下降，具體原因尚需進一步研究。