改良QuEChERS技術快速篩查降尿酸類藥食同源食品中的57種非法添加藥物

綦 艷 許慶鵬 李 聰 鄧幸飛 李錦清

(廣東產品質量監(jiān)督檢驗研究院，廣東 佛山 528300)

高尿酸血癥及痛風是人體內嘌呤代謝紊亂引起的代謝異常綜合征[1-2]。中國高尿酸血癥及痛風總體患病率達13.3%，且愈來愈趨向年輕化[3]。鑒于養(yǎng)生疾病具有中醫(yī)治療的顯著特點[4]，各種宣稱降尿酸、緩解痛風類藥食同源產品應運而生。宣稱具有降尿酸、緩解痛風類藥食同源食品，主要由桑葉、銀杏葉、紫蘇葉、菊苣、絞股藍等制成的茶類或者經粉碎提煉制成的膠囊為主[5]，此類藥食同源食品雖然在一定程度上可緩解或減輕患者癥狀，但是功效性體感不強。降尿酸、緩解痛風類的藥物主要有別嘌醇和非布司他等抑制尿酸生成藥物，苯溴馬隆等促進尿酸排泄藥物，糖皮質激素、非甾體抗炎等抗痛消炎藥物，如雙氯芬酸鈉、保泰松片、強的松、萘普生、地塞米松、秋水仙堿等[6-8]。不法商家為提高功效，將上述藥物非法添加于藥食同源食品中從而達到見效快、療效好的目的，欺騙消費者，使消費者在不知情的情況下，持續(xù)服用含有未知濃度非法添加藥物的藥食同源食品，雖能短時間內緩解高尿酸血癥及痛風癥狀，但服藥量未知，如果長期服用，可能產生不可預知的不良反應[9]。

目前，藥食同源食品的研究主要集中于藥食同源食品中有效成分[10-11]、重金屬及有害元素[12-13]、雙酚類化合物[14]、真菌毒素[15-16]、農藥殘留[17]等的分析檢測，但針對藥食同源食品中的非法添加問題研究較少。QuEChERS技術是近年來發(fā)展起來的一種用于農產品檢測的快速樣品前處理技術，具有靈敏度高、分析范圍廣、溶劑使用量少、分析速度快、操作簡單等優(yōu)點[18]。研究采用改良的QuEChERS前處理技術對樣品進行凈化，運用超高效液相色譜—串聯(lián)三重四極桿質譜法(UPLC-MS/MS)對市場上宣稱降尿酸或痛風類的藥食同源食品中非法添加的57種藥物的含量進行測定，以期為藥食同源食品這一中國特色食品的監(jiān)管提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)：粒徑40～60 μm，美國安捷倫公司；

石墨化炭黑(GCB)：粒徑100～200 μm，美國安捷倫公司；

十八烷基鍵合硅膠(C18)吸附劑：粒徑40～60 μm，美國安捷倫公司；

美洛昔康、非布司他、丙磺舒等57種標準品：純度≥98%，德國Ehrenstorfer公司。

1.1.2 主要儀器設備

超高效液相色譜—串聯(lián)質譜儀：AB Triple Quad 4500型，美國SCIEX公司；

漩渦混合器：IKA MS3型，德國IKA公司；

高速冷凍離心機：3-3KS型，美國SCIEX公司；

去離子水發(fā)生器：Milli-Q型，美國Millipore公司；

高速粉碎機：A11型，德國IKA公司。

1.2 樣品前處理

茶類制品使用高速粉碎機破碎后使用，膠囊樣品取出內容物進行使用。

準確稱取1 g試樣(精確至0.01 g)于50 mL塑料離心管中，準確加入甲醇10.0 mL，蓋上蓋子，渦旋1 min后超聲提取30 min，離心5 min，移取上清液加入2 mL QuEChERS凈化管中，渦旋提取2 min，離心5 min，過0.22 μm有機相濾膜，待測。

1.3 儀器條件

1.3.1 LC-MS/MS液相條件 色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；柱溫：40 ℃；進樣量：2 μL；流動相與梯度洗脫條件見表1。

表1 流動相與梯度洗脫條件

1.3.2 LC-MS/MS質譜條件 采用正負離子同時檢測模式，毛細管電壓：5.5 kV；離子源溫度：150 ℃；脫溶劑氣溫度：500 ℃；脫溶劑氣流量：800 L/h；多反應監(jiān)測模式(MRM)模式；碰撞氣體：氦氣。質譜參考條件見表2。

1.4 數(shù)據(jù)處理

通過AB Triple Quad 4500儀器配置工作站SCIEX OS-MQ Software系統(tǒng)進行數(shù)據(jù)采集分析，利用Microsoft Excel 2010軟件、Origin 2018進行數(shù)據(jù)分析及圖形繪制。

2 結果與分析

2.1 儀器條件優(yōu)化

57種非法添加藥物種類多，結構復雜，據(jù)文獻[18]報道丙磺舒和苯溴馬隆在負離子模式下響應值高，而別嘌醇在正離子模式下有較好響應，研究對藥食同源食品中57種非法添加藥物標準溶液進行質譜全掃描，得到57種非法添加藥物的一級母離子，通過二級質譜掃描得到信號穩(wěn)定、信號強度較大的特征碎片離子，選擇無干擾、靈敏度高、相對豐度最高的離子作為定量離子，相對較弱的作為定性離子，并優(yōu)化57種非法添加藥物的母離子和子離子所需的最佳去簇電壓和碰撞氣能量，以MRM模式進行掃描，除苯溴馬隆、丙磺舒、吲哚美辛、雙氯芬酸鈉在負離子模式較正離子模式下響應更好外，其余53種物質均在正離子模式下響應更好(見表2)。

表2 質譜參考條件?

續(xù)表2

2.2 色譜條件的選擇

為確定最佳分離條件，研究考察了Shim-pack ODS-Ⅱ(75 mm×2.0 mm，1.6 μm)、Agilent SB-C18(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)以及ACQUITY UPLC BEH C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)3種型號的色譜柱對57種非法添加藥物的分離效果，Agilent SB-C18色譜柱由于具有較大的二異丁基側鏈基團，使增加空間位阻的關鍵基團硅氧烷鍵合到了硅膠表面，從而此柱在低pH條件下的峰形更為出色。在電噴霧正離子、負離子同時掃描模式下，Agilent SB-C18色譜柱存在峰形較差，負離子響應度不好的情況。Shim-pack ODS-Ⅱ能夠耐受更高的壓力，色譜柱長度越長分離度越好，使用Shim-pack ODS-Ⅱ色譜柱地塞米松與倍他米松不能實現(xiàn)完全分離，改變流動相及流動相比例均未實現(xiàn)分離，可能由于此柱較短，物質的保留時間短，較難分離母離子相同的物質；ACQUITY UPLC BEH C18是三鍵鍵合式烷基柱，在不同pH的條件下均有穩(wěn)定的靈敏度和分離度。在相同色譜條件下ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱分離得到的色譜峰峰型較好，且57種非法添加藥物分離度良好，ACQUITY UPLC BEH C18柱與Shim-pack ODS-Ⅱ柱分離地塞米松與倍他米松的效果圖見圖1(a)和圖1(b)。綜上所述，選擇ACQUITY UPLC BEH C18柱進行進一步試驗。

試驗考察了甲醇和乙腈作為流動相的差異，發(fā)現(xiàn)糖皮質激素在色譜柱上的保留較強，乙腈洗脫能力較甲醇強，能將57種非法添加藥物較快速洗脫，且分離效果較好，為了得到更好的分離效果以及更好的峰形，試驗考察了乙腈—0.1%甲酸溶液、乙腈—10 mmol/L乙酸銨溶液、乙腈—水3種流動相體系。在乙腈—0.1%甲酸溶液流動相體系中，57種非法添加藥物中地塞米松醋酸酯和倍他米松雙丙酸酯兩種標準物質不能實現(xiàn)分離且丙磺舒、苯溴馬隆響應度不高，可能由于0.1%甲酸溶液流動相適用于正離子模式下物質的分離。而在乙腈—10 mmol/L乙酸銨溶液流動相體系中57種物質均響應度不高，在乙腈—水流動相體系中57種非法添加藥物分離度較好且各物質響應度較高，經過優(yōu)化確定該試驗的最佳梯度洗脫條件見表1。

2.3 樣品前處理條件的確定

宣稱降尿酸、緩解痛風類藥食同源食品成分多樣、基體復雜、干擾嚴重且含有大量植物色素，固相萃取技術能有效去除基質干擾提高富集倍數(shù)，但是研究在凈化階段遇到多次堵塞固相萃取柱現(xiàn)象，使試驗難以進行。QuEChERS前處理技術能解決傳統(tǒng)固相萃取柱的凈化過程慢且堵塞固相萃取柱的缺陷。QuEChERS提取技術常規(guī)處理過程第一步為萃取，通常以乙腈為提取試劑，提取后加入無水MgSO4和NaCl，離心分層，但試驗過程發(fā)現(xiàn)乙腈作為提取試劑時，糖皮質激素及部分非甾體抗炎回收率可以達到GB/T 27404—2008《實驗室質量控制規(guī)范 食品理化檢測》的要求，但酮咯酸、美洛昔康、秋水仙堿、非布司他、別嘌醇、苯溴馬隆、丙磺舒、吲哚美辛8種物質回收率卻未達到標準要求，選擇極性更大的甲醇作為提取試劑，提取后加入無水MgSO4和NaCl，無明顯分層且導致部分提取溶劑有損失。由于研究樣品為茶葉干制品或者膠囊制品，含水量較小，無需鹽析分層，故試驗選擇甲醇作為提取溶劑并取消加入無水MgSO4和NaCl的鹽析分層過程。QuEChERS前處理技術常用的吸附劑有C18、GCB和PSA等，吸附劑種類及含量影響QuEChERS凈化效率及回收率。試驗發(fā)現(xiàn)PSA、GCB對于去除植物樣品的色素具有較好的效果，經過兩種吸附劑劑量優(yōu)化選擇含150 mg PSA、50 mg GCB的2 mL QuEChERS凈化管對樣品進行凈化。

圖1 ACQUITY UPLC BEH C18柱和Shim-pack ODS-Ⅱ柱分離地塞米松與倍他米松的效果圖

稱取1 g粉碎試樣于50 mL塑料離心管中，準確加入甲醇10 mL進行提取，提取后離心直接移取上清液加入2 mL QuEChERS凈化管(含150 mg PSA、50 mg GCB)中進行凈化，提高了57種非法添加物質回收率的同時降低了基質干擾(圖2)。綜上所述，研究選擇改良的QuEChERS提取技術對宣稱降尿酸、緩解痛風類藥食同源食品進行目標物質提取，提高目標物質的回收率，解決了傳統(tǒng)固相萃取法溶劑消耗量大且針對此類藥食同源食品易堵塞的問題。

圖2 提取溶劑對加標食藥同源食品中8種非法添加物質提取效率的影響

2.4 檢出限、定量限、標準曲線、線性范圍

以57種非法添加藥物峰面積為縱坐標(Y)，質量濃度為橫坐標(X)，繪制線性回歸方程，得到57種化合物的線性回歸方程。57種非法添加藥物在5～200 μg/L的質量濃度范圍內線性關系良好，相關系數(shù)(R2)均在0.99以上。在空白樣品中添加57種非法添加藥物的標準物質溶液，以3倍信噪比、10倍信噪比分別計算該方法的檢出限、定量限以及相對標準偏差(relative standard deviations，RSDs)，結果見表3。57種非法添加藥物的檢出限為0.03～0.10 μg/kg，平均回收率為79.4%～92.6%，RSDs為0.86%～5.61%。在最優(yōu)條件下57種非法添加藥物的色譜峰形和響應強度最好，保留時間穩(wěn)定(見圖3)。

2.5 加標回收率及精密度

在空白樣品中分別添加57種非法添加藥物混合標準溶液制成0.10，0.20，1.00 μg/kg三水平加標樣品，稱取加標樣品1 g于50 mL塑料離心管中，準確加入甲醇10 mL進行提取，提取后離心直接移取上清液加入2 mLQuEChERS凈化管(含150 mg PSA、50 mg GCB)中進行凈化，提取2 min，離心5 min，每個水平做6組平行，計算平均回收率，其平均回收率為79.4%～92.6%，相對標準偏差均小于10.0%，表明該方法測定準確，回收率好。具體結果見表3。

表3 57種非法添加藥物的線性范圍、回歸方程、工作曲線、方法檢出限及相對標準偏差

續(xù)表3

2.6 實際樣品的檢測結果

在網絡及實體店采購藥食同源食品50批次，采用研究所建方法對50批次樣品進行處理，檢測57種非法添加藥物，2批次網絡采購樣品檢出別嘌醇，含量分別為36，11 μg/kg，檢出率為4.0%，說明藥食同源食品添加降尿酸或痛風類藥物的風險依然存在，具有此類宣稱的藥食同源食品監(jiān)管仍需繼續(xù)加強。

自下往上各峰依次對應酮咯酸、丙磺舒、對乙酰氨基酚、雙氯芬酸鈉、甲基潑尼松龍、倍氯米松、氫化可的松醋酸酯、潑尼松醋酸酯、布地奈德、氟米龍醋酸酯、倍他米松戊酸酯、氯替潑諾、環(huán)索奈德、甲基潑尼松龍醋酸酯、曲安西龍雙醋酸酯、美洛昔康、非布司他、曲安西龍、潑尼松、可的松、倍他米松、地塞米松、氟尼縮松、氟米龍、地夫可特、倍他米松醋酸酯、地塞米松醋酸酯、氫化可的松戊酸酯、潑尼卡酯、安西奈德、氟替卡松丙酸酯、倍他米松雙丙酸酯、雙氟可龍戊酸酯、苯溴馬隆、別嘌醇、秋水仙堿、潑尼松龍、氟米松、地索奈德、潑尼松龍醋酸酯、可的松醋酸酯、氫化可的松丁酸酯、氟輕松醋酸酯、哈西奈德、氯倍他索丙酸酯、氯倍他松丁酸酯、氫化可的松、異氟潑尼松龍、氟氫可的松醋酸酯、曲安奈德、氟氫縮松、鹵美他松、氟輕松、曲安奈德醋酸酯、鹵倍他索丙酸酯、吲哚美辛、二氟拉松雙醋酸酯

3 結論

研究改進QuEChERS凈化方法，建立了超高效液相色譜—串聯(lián)三重四極桿質譜方法對藥食同源食品中57種非法添加藥物的檢測。57種非法添加藥物檢出限為0.03～0.10 μg/kg，平均回收率為79.4%～92.6%，RSDs為0.86%～5.61%。該方法前處理相對簡單方便、回收率較常規(guī)固相萃取高，且易于操作、靈敏度高、檢出限低，能夠滿足對藥食同源食品中57種非法添加藥物的快速檢測和確證的要求。