堿異構化花生油制備共軛亞油酸工藝優化

申秋云 彭清凈

(吉首大學食藥兩用資源研究與高值化利用湖南省重點實驗室，湖南 吉首 416000)

共軛亞油酸(Conjugated linoleic acid，CLA)是含有順式或反式共軛雙鍵的十八碳二烯酸，與亞油酸是位置和構象上的異構體，其中c9,t11-CLA和t10,c12-CLA具有多種生物學功能，如降脂、抗氧化、抗癌、促進骨骼健康、提高免疫力、防治糖尿病、抗動脈粥樣硬化等[1]。但是，天然CLA只少量的存在于反芻動物或植物油脂中，遠不能滿足需求。

CLA的合成方法主要有生物法和化學法[2-3]。生物法是利用微生物或亞油酸異構酶將非共軛多烯酸轉化為共軛多烯酸，如趙微等[4]用植物乳桿菌P-8將亞油酸轉化為CLA，Lian等[5]利用固定化的突變脂肪酶 MAS1-H108A 高效合成CLA，但是生物法存在微生物及酶的活性受底物抑制而致轉化率較低的缺點，目前尚無法工業化生產。從天然不飽和脂肪酸改性合成CLA的化學法是目前的主流方法，包括Ⅷ族金屬催化共軛法、亞油酸堿催化異構化法等。Ⅷ族金屬催化共軛法存在反應過程復雜、反應時間較長、反應條件苛刻、產物中反式結構所占比例較大、過渡金屬催化劑價格昂貴且有較大毒性等問題[6]。盡管亞油酸堿催化異構化法還存在產物提純困難、提取成本較高等不足，但該法過程簡單、催化劑易得且無需特別處理、CLA轉化率較高，是目前最有希望工業化的方法，科研人員對其開展了大量研究[7-10]。但是，目前亞油酸堿催化異構化法主要是以純亞油酸為底物，底物成本較高，需尋找能夠大量廉價制取CLA的原料資源。山茶油、芝麻油、菜籽油、花生油、葵花籽油等食用油中廣泛存在亞油酸[11]。已有以葵花油[12]、辣椒籽油[13]等植物油為原料經堿異構化方法制備CLA的研究。相比其他食用油，花生油具有亞油酸含量較高、產量大、價格相對低廉的優點，且目前尚未有以花生油為原料開展堿異構化制備CLA的報道。研究擬采用花生油制備CLA，分析堿異構法制備花生油共軛亞油酸的主要影響因素，探討各試驗因素對轉化率的影響，并通過響應面法優化花生油CLA轉化條件，以期為CLA的工業化開發提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花生油：實驗室自制；

亞油酸、CLA標準品：美國Sigma公司；

KOH、1, 2-丙二醇、BF3、CH3OH、HCl、Na2SO4、NaCl、正庚烷、正己烷等：分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

高壓反應釜：NSC100-P5-T3-SS1-SV型，安徽科冪機械科技有限公司；

旋轉蒸發儀：RE-52CS型，上海醫科大學儀器廠；

循環水式多用真空泵：SHK-ⅢS型，鄭州科泰實驗設備有限公司；

電子分析天平：ALB-124型，北京賽多利斯科學儀器有限公司；

氣相色譜—質譜聯用儀：GC-MS TQ8050型，日本島津公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 CLA制備方法 將1.0 g亞油酸標準品置于高壓反應釜中，加入20 mL 1,2-丙二醇(含質量分數6%的KOH)，充入氮氣排空釜中空氣，然后密閉系統，加熱到180 ℃反應3 h，反應結束后，冷卻至室溫，移入燒杯，加HCl調pH至2～3，用正己烷萃取2次，水洗至中性，加Na2SO4，用玻璃棒攪拌至溶液澄清，靜置2 min，過濾，旋轉蒸發去除多余溶劑，得到產品用于CLA含量分析。

1.3.2 花生油轉化單因素試驗 將1.0 g花生油置于高壓反應釜中，按1.3.1中方法進行轉化。設定單因素試驗中的常規量為：反應時間3 h，反應溫度180 ℃，醇油比(m1,2-丙二醇∶m亞油酸)20∶1，KOH用量6%。依次考察醇油比(m1,2-丙二醇∶m亞油酸分別為10∶1，15∶1，20∶1，25∶1，30∶1)、KOH用量(4%，5%，6%，7%，8%)、反應時間(1，2，3，4，5 h)、反應溫度(120，150，180，210，240 ℃)對CLA轉化率的影響。

CLA轉化率按式(1)計算：

(1)

式中：

R——CLA轉化率，%；

YCLA——異構化后花生油中CLA的相對含量，%；

Z——異構前花生油中亞油酸的相對含量，%。

1.3.3 響應面優化試驗 根據單因素試驗分析結果，利用Design-Expert 8.0.6軟件，以CLA轉化率為響應值，通過四因素三水平Box-Behnken試驗來優化反應條件。

1.3.4 脂肪酸組成及相對含量測定 按GB 5009.168—2016《食品安全國家標準 食品中脂肪酸的測定》中的歸一化法執行。

1.3.5 數據處理方法 所有試驗重復3次，用Design-Expert 8.0.6軟件分析Box-Behnken試驗結果，SPSS 23.0軟件進行ANOVA多重比較分析(Turkey法，顯著性水平為0.05)，Origin 2019b軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 花生油主要脂肪酸含量

試驗所用花生油主要脂肪酸相對含量組成：棕櫚酸(11.87±0.47)%，亞油酸(27.85±0.53)%，油酸(59.64±0.57)%。因產地、榨油工藝等不同，花生的亞油酸含量會有所差異，有研究[14]發現，花生油中的亞油酸含量最高可達41.66%，說明花生油中亞油酸含量較高，具有作為原料開發CLA的前景。

2.2 亞油酸異構化前后CLA含量變化

對亞油酸進行堿異構化處理后，生成的CLA百分含量達到了65.87%。說明試驗所用的堿催化異構化方法能將亞油酸轉化成CLA。

2.3 花生油轉化單因素試驗

2.3.1 醇油比對CLA轉化率的影響 圖1顯示，隨醇油比不斷增大，CLA轉化率增大，當醇油比(m1,2-丙二醇∶m亞油酸)為20∶1時，轉化率達到最大值。繼續增大醇油比，CLA轉化率開始減小。這是因為溶劑量過少，反應體系的黏度過大，產生的泡沫過多，反應在不均一體系中進行，體系傳質阻力過大，導致共軛化不完全，共軛化速度相對較低；而溶劑過多，催化劑濃度降低，分子間的有效碰撞機會減少，間隔雙鍵生成共軛雙鍵的機率降低，共軛化效率也相應降低[15]，同時增大了后期溶劑回收處理的難度與能耗。因此，醇油比(m1,2-丙二醇∶m亞油酸)控制在20∶1左右為宜。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.3.2 KOH用量對CLA轉化率的影響 圖2顯示，隨KOH用量不斷增加，CLA轉化率增大。當KOH用量達到6%時，CLA轉化率達到最大值，此后繼續增加KOH，對CLA轉化率影響不大。這是由于在強堿的作用下，僅碳原子上的氫容易失去，生成碳負離子中間體，該碳負離子的負電荷在2個C═C雙鍵間離域，增大了體系分子的有效碰撞，有利于共軛化進行[16]。但催化劑用量到達一定量后，與反應分子有效碰撞的機會基本不再發生變化，同時會使反應體系中泡沫過多，造成分離困難及隨之而來的CLA損失，產物的顏色也明顯加深。因此，KOH用量控制在6%左右為宜。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.3.3 反應時間對CLA轉化率的影響 圖3顯示，隨反應時間延長，CLA轉化率呈上升趨勢，在3 h時，轉化率進入平臺期，繼續延長反應時間，轉化率增加不大，到達5 h 時，轉化率下降。這是因為延長反應時間，各物質充分接觸，有利于亞油酸共軛化，但CLA不穩定，長時間的高溫反應容易發生降解或其他副反應，使得轉化率降低，與之前相關研究[8-9]結果一致。雖然適當延長反應時間會提高CLA轉化率，但會極大地增大設備的運行成本和設備損耗，因此以2.0，2.5，3.0 h的反應時間進行響應面試驗。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.3.4 反應溫度對CLA轉化率的影響 圖4顯示，隨反應溫度升高，CLA轉化率呈現上升趨勢，在210 ℃達到最大值，之后轉化率小幅度減少。主要是因為升溫過高，亞油酸容易發生聚合、分解以及環化反應，不利于CLA的生成，同時導致副產物增多[17]。并且丙二醇的沸程為186～188 ℃，溫度過高易引起溶劑的揮發或達到沸程不利于操作，故反應溫度選180 ℃左右較適宜。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.4 響應面試驗

2.4.1 試驗結果與分析 響應面試驗因素水平設計見表1，試驗結果見表2。

對試驗結果(表2)進行二次多項式回歸擬合，得到關于CLA轉化率(Y)影響因素的多元二次回歸方程：

Y=83.92+8.19A+6.13B+3.65C+6.06D-1.3AB+0.034AC+0.15AD+5.91BC-2.58BD-1.12CD-8.58A2-12.28B2-4.88C2+1.89D2。

(2)

由回歸方程可知，因素重要性為反應溫度>反應時間>KOH用量>醇油比，對回歸方程進行方差分析，結果見表3。根據P值判斷，CLA轉化率的回歸模型方程達到極顯著水平(P<0.01)，失擬項P值不顯著(P>0.05)，擬合度R2=0.945 4，CV%=7.31%，信噪比S/N=12.724(S/N>4)，表明該模型響應效果良好，模型預測值與實測值能夠很好地擬合，試驗結果可靠。同時，由表4 可知，方程一次項中A、B、D和二次項中A2、B2均極顯著(P<0.01)，而一次項C和交互項BC均顯著(P<0.05)，表明反應溫度、反應時間、KOH用量對轉化率的影響達到極顯著水平(P<0.01)，而醇油比的影響達到顯著水平(P<0.05)。

表1 響應面試驗因素水平設計

表2 響應面試驗結果

表3 響應面試驗結果方差分析?

2.4.2 因素間交互作用 將兩個因素固定在0水平，其余兩因素間的交互作用對CLA轉化率的影響見圖5。圖5(d)的響應面坡度較陡，說明反應時間與醇油比之間交互作用明顯，與之前相關研究[18]結果一致。而其他圖的響應面坡度較小，即反應溫度與其他因素之間、KOH用量與其他因素之間的交互作用不明顯。

2.4.3 工藝優化及驗證 由Design-Expert 8.0.6軟件優化得出最優反應條件為：反應溫度200.00 ℃，反應時間2.59 h，醇油比(m1,2-丙二醇∶m亞油酸)21.87∶1，KOH用量7.00%。在此條件下，轉化率預測值為92.3%。為方便操作，將最優條件調整確定為：反應溫度200 ℃，反應時間2.6 h，醇油比(m1,2-丙二醇∶m亞油酸)22∶1，KOH用量7%，在此條件下開展3組驗證實驗，轉化率實測值為(89.81±1.64)%，與預測值接近，說明采用響應面法優化該工藝條件可行。

圖5 因素交互作用對CLA轉化率的影響

3 結論

研究發現，花生油中亞油酸相對含量為27.85%，具有利用其開發共軛亞油酸的前景。堿異構化花生油制備共軛亞油酸的最優工藝條件為：反應溫度200 ℃，反應時間2.6 h，醇油比(m1,2-丙二醇∶m亞油酸)22∶1，KOH用量7%。在該條件下，共軛亞油酸轉化率為89.81%。由于堿異構化方法還會有約5%～10%的其他異構體生成，因此堿異構化后具有生理活性共軛亞油酸的提純工藝及其他非生理活性成分的安全性還有待研究。