血漿與血清標本腺苷脫氨酶檢測結果的一致性評估及血清參考區間的適宜性評估

熊剛，曹丹 ，劉艷婷，趙思涵，肖光軍 （通信作者）

1 三臺縣婦幼保健院檢驗科 （四川綿陽 621100）；2 遂寧市中心醫院檢驗科（四川遂寧 629000）

腺苷脫氨酶（adenosine deaminase，ADA）是一種與機體嘌呤代謝和免疫功能密切相關的蛋白質[1]，其在淋巴細胞的發育及成熟過程中起重要作用，并在免疫細胞的增殖、分化、功能等方面發揮著重要的調節作用[1]。相關研究表明，多種感染、腫瘤、代謝性疾病及免疫相關性疾病患者的血清ADA 水平增高，且ADA 水平與患者病情嚴重程度及預后密切相關，故ADA 被大量應用于臨床診療及預后評估中[1-8]。目前，臨床實驗室常用紫外速率法和酶偶聯顯色法檢測機體外周血中的ADA水平，但因我國未發布基于多中心的中國人群ADA 參考區間，故臨床實驗室常使用試劑盒說明書提供的血清參考區間[9-11]。相關研究顯示，血漿與血清中的ADA 水平存在一定差異，且不同文獻報道的研究結果也存在一定差異[12-13]，但均推薦使用血清標本進行外周血ADA 水平的檢測，以便于使用血清參考區間來解釋檢測結果。然而，大部分國產試劑盒說明書均注明可使用血清或血漿標本進行外周血ADA 水平的檢測，故本研究對肝素鈉抗凝血漿標本與血清標本ADA 檢測結果的一致性進行了評估，并對ADA 檢測試劑盒的血清參考區間在肝素鈉抗凝血漿標本中的適宜性進行了評估，從而為臨床實驗室ADA 的檢測及參考區間的引用提供指導。

1 資料與方法

1.1 一般資料

以遂寧市中心醫院住院患者同時送檢的肝素鈉抗凝血漿標本和血清標本檢測后剩余樣本為研究對象，每天收集8份，連續5 d，共收集40份，用于血漿樣本與血清樣本ADA 檢測結果的一致性評估；同時，參照衛生行業標準WS/T 402-2012《臨床實驗室檢驗項目參考區間的制定》及相關文獻的要求[9-11]，通過問卷調查、體格檢查、B 超檢查、影像檢查及實驗室篩查排除等方法[9-11]，從2019年1—12月體檢科20～79歲健康體檢成人中篩選表觀健康成人組成參考人群，以驗證血清參考區間的適宜性。本研究共納入參考個體1 483名，剔除離群值后剩余1479名，其中男731例，年齡為42（31，53）歲；女748例，年齡為39（30，50）歲。本研究經醫院醫學倫理委員會批準，所有研究對象均簽署知情同意。

1.2 儀器與試劑

日立7600全自動生化分析儀；四川邁克生物股份有限公司提供的ADA 檢測試劑盒（過氧化物酶法）、配套校準品和質控品，嚴格按照試劑盒說明書的要求設置生化分析儀的檢測參數；血漿標本使用肝素鈉抗凝真空采血管采集，血清標本使用不含任何添加劑的紅色真空采血管采集，真空采血管及其配套采血針均由成都瑞琦醫療科技有限公司提供。需注意檢測前檢查儀器狀態良好并對其進行定期校準和常規維護保養，且室內質控正常水平和病理水平均在控。

1.3 方法

1.3.1 標本采集與處理

40例住院患者的空腹血漿和血清標本均由住院部護士使用相應真空采血管規范采集，每管各3 ml；所有參考個體的標本均由檢驗科工作人員在體檢科使用肝素鈉抗凝真空采血管規范采集，每管3 ml。標本采集后，充分混勻，然后垂直放置于泡沫板上，及時送檢，運輸中避免劇烈震蕩。實驗室收到樣本后，以4 000 r/min、5 min 的參數離心，然后使用1.5 ml 的離心管盛裝分離后的血漿和血清，并于采樣后2 h 內完成所有標本的檢測。

1.3.2 血漿標本與血清標本ADA 檢測結果的一致性評估

參照美國臨床實驗室標準化協會EP9-A2文件的要求，以同一患者的血清標本為參考標本（X），肝素鈉抗凝血漿標本為待評價標本（Y）進行檢測結果的對比[14-15]，并繪制兩標本間檢測結果的偏倚圖，采用配對t檢驗對兩標本檢測結果的均值進行分析。線性回歸分析顯示相關系數r≥0.975時，表示X取值范圍合適，可通過線性回歸方程來評估兩標本間檢測結果的斜率（b）和截距（a），然后計算4 、10、22 U/L（其中4、22 U/L 分別為血清參考區間的下限和上限）水平處血漿標本的預期偏倚（SE%）[15]，并以2021年國家衛生健康委臨床檢驗中心室間質量評價標準中ADA 總允許誤差（TEa）的1/2為臨床可接受標準，評估兩標本間ADA 檢測結果的一致性。SE%={(b-1)×X+a}×100/X，不同水平處的SE%均≤1/2TEa則表示兩標本間檢測結果具有一致性。ADA 的TEa為靶值±25%。

1.3.3 參考區間的驗證與建立

采用Dixon法對參考人群血漿ADA 的檢測結果進行離群值檢驗[9-11]，然后通過1.3.2的一致性評估結果來判斷是否需要自建參考區間。當肝素鈉抗凝血漿標本與血清標本ADA 檢測結果具有一致性時，則使用參考人群血漿ADA 檢測結果來驗證血清參考區間的適宜性，驗證通過則表示可直接引用試劑盒說明書提供的血清參考區間，驗證未通過則根據參考人群血漿ADA 水平采用非參數法自建參考區間（P2.5～P97.5）[9-11]；而兩標本間檢測結果不具有一致性時，則根據參考人群血漿ADA 水平采用非參數法自建參考區間（P2.5～P97.5）[12-13，15]。各組血漿檢測結果落在血清參考區間內的比例≥90%，則參考區間驗證通過；反之，則驗證未通過[9-11]。

1.4 統計學處理

采用SPSS 19.0統計軟件及Excel 2007軟件進行數據分析，計量資料正態性檢驗采用Kolmogorov-Smirnov檢驗，P＜0.05表示呈非正態分布，呈正態分布的數據以±s表示，而呈非正態分布的數據則使用中位數（M）[四分位數（P25，P75）]表示，組間比較采用配對t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 血漿標本與血清標本ADA 檢測結果的一致性

經離群值檢驗，組內和組間均未見離群值；同一患者肝素鈉抗凝血漿標本與血清標本ADA 的檢測結果分別為（12.01±5.78）U/L 和（12.35±5.95）U/L，差異有統計學意義（t=3.602，P＜0.05）；但經線性回歸分析，回歸方程為Y=0.9663X+0.0752，相關系數r為0.9952，說明可使用線性回歸方程來計算血漿標本的SE%，從表1可見不同水平處兩標本間的SE%均滿足臨床可接受標準，檢測結果具有一致性。血漿標本與血清標本ADA 檢測結果的散點圖和偏倚圖見圖1、圖2，不同水平處肝素鈉抗凝血漿標本的SE%見表1。

圖1 血清與血漿標本ADA 檢測結果的散點圖

圖 2 血漿與血清標本ADA 檢測結果的偏倚圖

表1 不同水平處肝素鈉抗凝血漿標本的SE%

2.2 血清參考區間的適宜性驗證

經Dixon檢驗剔除離群值后剩余1 479名參考個體，其性別和年齡分布見表2。根據年齡和性別將參考人群分為12個亞組，各組血漿檢測結果落在血清參考區間內的符合率均≥90%，故各組參考區間驗證均通過，見表2。

表2 血清參考區間在遂寧地區表觀健康成人肝素鈉抗凝血漿標本中的適宜性驗證

3 討論

由于我國ADA 檢測試劑盒的生產廠家較多，檢測原理及性能指標均存在一定差異，與不同廠家或不同型號的生化分析儀組成不同的檢測系統后，導致各實驗室間的檢測結果存在較大差異；同時，由于ADA 檢測缺少統一的質量標準，導致在試劑盒性能驗證、實驗室內儀器間對比、實驗室間對比等活動中，各臨床實驗室所使用的可接受標準也存在一定的差異，從而導致相關文獻的研究結論也存在一定差異[12-13]。本研究在進行肝素鈉抗凝血漿標本與血清標本ADA 檢測結果一致性評估時也受此因素的影響，因缺少統一的質量標準而選擇募集本地區20～79歲表觀健康成人來自建參考區間，但因國家衛生健康委臨床檢驗中心在2020年新增了ADA 檢測的室間質量評價活動，并發布了質量評價標準，故對血漿標本與血清標本ADA 檢測結果一致性評估的數據重新進行了分析，并根據分析結果評估了血清參考區間在血漿標本中的適宜性。

本研究結果顯示，肝素鈉抗凝血漿標本與血清標本ADA 檢測結果的差異有統計學意義（P＜0.05），但線性回歸分析結果顯示兩標本的檢測結果具有良好的相關性（r=0.9952），其回歸方程為Y=0.9663X+0.0752。在研究初期，因ADA 檢測無質量評價標準，故采用譚延國等[13]的檢驗結果一致性評估方案來評估其一致性，其初步研究結果顯示血漿標本與血清標本ADA 檢測結果缺乏一致性，故推薦使用血清標本檢測血液中ADA 的水平，若使用血漿標本則需自建血漿參考區間或進行血清參考區間的轉換驗證[13]。隨著2020 年國家衛生健康委員會臨床檢驗中心ADA 檢測質量評價標準的發布，我們通過線性回歸方程計算血漿標本在不同水平處的SE%，從表1可見其SE%均＜1/2TEa，說明血漿標本與血清標本的ADA 檢測結果具有一致性，可使用血漿標本代替血清標本來檢測機體外周血的ADA 水平，并可使用血清參考區間來解釋血漿標本的檢測結果。但因參考區間受檢測系統、服務人群、飲食結構、地理環境等多種因素的影響，相關文件均要求各臨床實驗室開展新項目或引用新的參考區間時需對其適宜性進行評估，故本研究通過前期準備自建血漿參考區間而收集的遂寧地區1 479名20～79歲表觀健康成人血漿ADA的檢測結果，來驗證血清參考區間在血漿標本中的適宜性，從表2可見，男性和女性各年齡段的符合率均≥90%，說明參考區間驗證通過，該血清參考區間可用于該地區20～79歲成人血漿ADA 檢測結果的解釋。同時，從表2可發現，該地區男性和女性外周血ADA 的水平均隨年齡的增長緩慢上升，且同年齡段女性的ADA 水平高于男性，其原因需進一步研究，但臨床結果解釋時需考慮性別、年齡等因素對檢測結果的影響。相關研究表明，部分檢測項目在老年人、孕婦、兒童血液中的水平及其變化情況與成年人存在一定差異，臨床實驗室應重視其參考區間的調查與制定，但本研究納入的研究對象為20～79歲的健康成人，未能對ADA 血清參考區間在孕婦、兒童等特殊人群中的適宜性進行評估，仍需進一步研究，必要時可采用直接法或間接法自建參考區間[16-20]。

綜上所述，我國衛生行業標準或試劑盒說明書常規生化檢測項目的參考區間均為血清參考區間，故大部分臨床實驗室使用血清標本進行常規生化項目的檢測，若擬使用血漿標本代替血清標本進行檢測時，即使試劑盒說明書注明兩種標本均可使用，臨床實驗室也應對兩標本檢測結果的一致性及血清參考區間的適宜性進行評估；同時，隨著科學技術的不斷發展，檢測技術、試劑盒質量及臨床實驗室質量水平均不斷提高，為進一步滿足臨床診療需求，檢驗質量評價標準也可能會不斷提高，當發生改變時，臨床實驗室應重新進行評估。