低磷與干旱脅迫下百脈根代謝組學分析

李亞嬌， 馬培杰， 龍忠富， 舒健虹， 陳 瑩， 王小利

(貴州省農業科學院草業研究所， 貴州 貴陽 550006)

低磷和干旱脅迫影響植物的形態、生理和生物化學過程，降低其光合作用[1]，同時其在植物細胞的伸長和分裂[2]，能量代謝、細胞膜的合成等方面起著抑制作用[3]。低磷和干旱脅迫還會抑制植物對養分的吸收，抑制相關功能基因和結構基因的表達[4-6]。代謝物在植物的生長發育中起著重要的作用，非生物脅迫下，代謝產物參與細胞信號傳導、能量儲存、膜的形成以及整個植物物質的分配[7]。各種逆境脅迫會造成植物各種代謝酶活性抑制、底物短缺、對某些化合物的過度需求，影響植物正常物質代謝活性[8]。面對各種脅迫，植物會重新分配代謝物質反應流程，包括初級或次級代謝物質，以便于調節植物細胞和組織的生長發育進程、氧化還原穩定性、離子轉運和酶活性，以維持植物生長發育過程中必要的物質代謝[9-10]。

隨著高通量檢測技術的快速發展，代謝組學已經滲透到多個領域。在植物研究中，代謝組學現在被認為是不同分子生物學研究中廣泛使用的重要生物技術工具[11-12]。許多研究利用代謝組學探究植物在應對不同環境脅迫(包括干旱、鹽、熱、冷和光脅迫等)時的代謝物變化[13-14]。代謝物分析方法已經被廣泛應用于植物對逆境脅迫的分子響應機制，并用來評估某一特定代謝物類或途徑中的代謝物水平[15-16]，包括用氣相色譜-質譜(GC-MS)、液相色譜-質譜(LC-MS)、核磁共振(NMR)、高效液相色譜(HPLC)和毛細管電泳-質譜(CE-MS)等多種方法鑒定植物、動物和微生物在各種逆境脅迫下的代謝物反應機制[17-18]。代謝組學可以通過測量參與各種生化過程的代謝物來揭示這些復雜的機制[19]。為了應對非生物脅迫，植物可以調節其代謝網絡，合成一系列代謝物，以幫助其修復損傷[20]。百脈根(Lotuscorniculatus)屬多年生草本植物，具有改良土壤的功能，也是優良的蜜源和藥用植物[21]。目前，關于百脈根在低磷和干旱脅迫下代謝物的變化的研究鮮有報道。本研究旨在利用液相色譜-質譜(LC-MS)技術，研究低磷和干旱脅迫下百脈根的代謝產物變化，以對進一步研究百脈根抵御低磷和干旱脅迫的機制提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料、處理和取樣

百脈根于貴州省草業研究所人工氣候室內種植(光照16 h，黑暗8 h，生長溫度25℃)，先于11 cm×15 cm的花盆內撒播種植，2～3葉時移栽入蒸餾水配置的霍格蘭營養液瓶中。空白對照(CK)：pH為8.1±0.5的1/8-霍格蘭營養液，添加10 mmol·L-1的NaHCO3，NH4H2PO4的濃度為0.25 mmol·L-1。低磷(LP)：pH為8.1±0.5的1/8-霍格蘭營養液，添加10 mmol·L-1的NaHCO3。20%干旱脅迫(PEG)：pH為8.1±0.5的霍格蘭營養液，添加10 mmol·L-1的NaHCO3，NH4H2PO4的濃度為0.25 mmol·L-1，添加200 g·L-1的聚乙二醇(Polyethyleneglycol，PEG-6000)。每瓶5株苗，每3天換1次營養液，培養1個月后收獲，進行相關指標測定和樣品采集。

1.2 代謝組樣品處理和數據分析

本項目選取未處理的對照組(CK)、低磷(LP)和干旱脅迫(PEG)3組樣本，每組6個樣品，共計18個樣品進行代謝物測定。代謝物提取流程：稱取50 mg樣本，加入1 000 μL含有內標(1 000∶2)的提取液(甲醇乙腈水體積比2∶2∶1，內標濃度 2 mg·L-1)，渦旋混勻30 s；加入瓷珠，45 Hz研磨儀處理10 min，超聲10 min(冰水浴)；-20℃靜置1 h；將樣本在4℃下，12 000 r·min-1離心15 min；小心地取出500 μL上清液于EP管中；在真空濃縮器中干燥提取物；向干燥后的代謝物加入160 μL提取液(乙腈和水體積比1∶1)復溶；渦旋混勻30 s，冰水浴超聲10 min；將樣本在4℃下，12 000 r·min-1離心15 min；小心地取出120 μL上清液于2 mL進樣瓶，每個樣本各取10 μL混合成QC樣本并上機檢測。用于代謝組學分析的液-質聯用系統由沃特世Acquity I-Class PLUS超高效液相串聯沃特世Xevo G2-XS QTof高分辨質譜儀組成，所使用色譜柱為購自沃特世的Acquity UPLC HSS T3色譜柱(1.8 μm,2.1×100 mm)。使用MassLynx V4.2采集的原始數據通過Progenesis QI軟件做峰提取、峰對齊等數據處理操作，基于Progenesis QI軟件在線METLIN數據庫及百邁客自建庫進行鑒定，同時進行理論碎片識別，質量數偏差均在100 ppm以內[22]。

2 結果與分析

2.1 百脈根低磷和干旱脅迫下外觀特征

百脈根經過低磷和干旱脅迫處理生長一個月與對照相比，百脈根地上部分長勢明顯變弱，莖變短、葉減少(圖1A，圖1B)。百脈根地下根系部分長勢變弱，主根均變短，側根大量減少(圖1C，圖1D)。

圖1 百脈根在低磷和干旱脅迫下的外觀特征Fig.1 Appearance characteristics of Lotus Corniculatus L. with low phosphorus and drought stress

2.2 質譜分析體系建立

樣品的重復相關性評估至關重要，相關性分析可以評估組內樣品之間的生物學重復。同時組內樣品相對組間樣品的相關系數越高，獲得的差異代謝物越可靠。將斯皮爾曼等級相關系數r(Spearman Rank Correlation)作為生物學重復相關性的評估指標。r2越接近1，說明2個重復樣品相關性越強。結果見圖2A，2個處理組6個重復間的相關系數均在較好的范圍內。聚類分析是對樣品指標進行分類的一種多元統計分析方法[23]，由圖2C中得知，不同的處理間代謝物有上調也有下調。從圖2B中可以看出，干旱和低磷脅迫處理組和對照組6個重復的數據點檢測結果都很好地被分成3組，并分別集中在一起，說明在整個試驗過程中系統誤差較小，數據可重復性很好，可用于后續分析。干旱脅迫、低磷脅迫和對照百脈根葉片在PC1上有明顯分離，PC1的貢獻率為56.42%，而PC2貢獻率則為22.31%，表明3組樣品間的代謝調控不同。其次，從圖2D可以看出3組樣品的數據點在空間上可以明顯區分，表明3組樣品的代謝產物在種類、數量和濃度等方面存在差異。因此，對代謝產物的進一步分析，可揭示貴州天然豆科牧草百脈根耐旱耐貧瘠的調控機制。

圖2 全部樣品質譜分析體系圖Fig.2 Quality spectrum analysis system diagram of all samples注：A：樣品間相關性圖；B：代謝物質聚類圖；C：所有樣本的主成分分析PCA圖；D：所有樣本的主成分分析PCA-3D圖Note:A:correlation diagram between samples；B:Cluster diagram of metabolites；C:PCA diagram of all samples；D:PCA-3D diagram of all samples

2.3 主成分分析

由圖3A(干旱處理)和圖3B(低磷處理)可知，干旱和低磷處理百脈根葉片相對于對照組CK在PC1上有明顯分離，PC1的貢獻率分別為66.67%和78.11%，而PC2貢獻率則為13.38%和10.44%，其中百脈根代謝葉片響應干旱的第一主成分大于其響應低磷第一主成分的方差貢獻率，說明低磷脅迫條件下百脈根的代謝表型較干旱變化更為劇烈。總體來看，對照組與百脈根兩個脅迫處理組間的代謝表型差異明顯，代謝調控不同。

圖3 百脈根脅迫處理主成成分分析Fig.3 PCA analysis of Lotus Corniculatus under stress

2.4 差異代謝物篩選

用t檢驗和正交偏最小二乘法判別方法的VIP值相結合的方法來篩選差異代謝物，篩選的標準為P<0.05和VIP值>1。各種差異代謝物數目統計如表1所列，從表中可看出，干旱脅迫的差異代謝物最多，為390種，而低磷脅迫理的差異代謝物則只有332種，說明代謝物質變化在干旱脅迫中更為復雜。兩種脅迫處理中，差異代謝物主要以上調為主，其中干旱和低磷脅迫上調代謝物分別占80.51%和62.95%。韋恩圖(圖4)中顯示，兩組脅迫處理共同差異代謝物達151種，火山圖(Volcano plot)是綜合差異倍數分析和t檢驗的一種單變量分析方法。圖中矩形所圈的點為變化倍數(Fold change)，其大于2.0且P<0.05的代謝物，即單變量統計分析篩選的差異代謝物。從火山圖中也可以清楚的對比出上調的差異代謝物和下調的差異代謝物(圖5A，圖5B)。

圖4 差異代謝物數量韋恩圖Fig.4 Wenn plot of differential metabolites

圖5 差異代謝物火山圖Fig.5 Volcanic map of differential metabolites注：火山圖中每個點代表一個代謝物，橫坐標代表該組對比各物質的倍數變化(取以2為底的對數)，縱坐標表示t檢驗的P值(取以10為底的對數)，散點大小代表OPLS-DA模型的VIP值，散點越大，VIP值越大，篩選得到的差異表達代謝物越可靠。圖中灰色的點代表下調差異表達代謝物，黑色的點代表上調差異表達代謝物，比較淺色的點代表檢測到但差異不顯著的代謝物Note:Each dot of volcano represents a metabolite in the figure,the abscissa represents the group contrast ratio of each material change (with 2 logs base),the vertical represents the P-t test value (in the logarithm of 10 at the bottom),the size of scatter represents the VIP value of OPLS-DA model,the larger the scatter,the greater the VIP value,the differential expressed metabolites obtained by screening are more reliable. Grey dots in the figure represent downregulated and differentially expressed metabolites,black dots represent up-regulated and differentially expressed metabolites,and light dots represent detected but not significantly different metabolites

表1 差異代謝物統計Table 1 Differential metabolite statistics

2.5 差異代謝物定量分析

對所檢測到的代謝物進行定性和定量分析后，可先比較在各分組中代謝物定量信息發生的差異倍數變化。根據VIP值選擇差異代謝物上調顯著前20個和下調顯著前20個進行熱圖繪制(圖6)，低磷和干旱脅迫處理與對照相比代謝物上調顯著共同有meta_225、meta_344和meta_574三個代謝物。低磷和干旱脅迫處理與對照相比，代謝物下調顯著的有meta_493，meta_588，meta_627，meta_728，meta_819，meta_821，meta_900，meta_913和meta_960等9個代謝物。

圖6 低磷和干旱脅迫下差異代謝物定量熱圖Fig. 6 Quantitative heat map of differential metabolites under low phosphorus and drought stress注：第一列為上調顯著的前20個代謝物，第二列為下調顯著的前20個代謝物Note：The first column showed the first 20 metabolites significantly up-regulated,and the second column showed the first 20 metabolites significantly down regulated

2.6 差異代謝物KEGG功能注釋及富集分析

利用KEGG數據庫對差異代謝物進行注釋，將篩選出的差異代謝物映射到KEGG通路上，并將其在KEGG通路圖上進行標記。分析結果顯示，干旱脅迫差異物質共映射到70條代謝通路，主要聚類為脂肪酰基、羧酸及其衍生物、有機氧化合物、類黃酮、甘油磷脂、異黃酮、多聚異戊二烯醇脂質。富集程度最顯著的途徑為類固醇生物合成、二苯乙烯、二芳庚烷和姜酚的生物合成、脂肪酸生物合成、花生四烯酸代謝、泛素及其他萜類醌類生物合成、嘌呤代謝、二萜生物合成、氨基糖和核苷酸糖的代謝、生物素代謝、次生代謝物的生物合成(圖7A，圖7B)。低磷脅迫差異物質共映射到58條代謝通路。主要聚類為脂肪酰基、羧酸及其衍生物、有氧化合物、類黃酮、甘油磷脂、嘌呤核苷、肉桂酸及其衍生物。富集程度最顯著的途徑為苯乙烯、二芳庚烷和姜酚的生物合成、甘油磷脂新陳代謝、二萜生物合成、類苯基丙烷生物合成、嘧啶代謝(圖7C，圖7D)。

圖7 各組差異代謝物HMDB分類圖和氣泡圖Fig.7 HMDB classification diagram and bubble diagram of different metabolites in each group注：圖7A中，1=脂肪酰基；2=羧酸及其衍生物；3=有機氧化合物；4=黃酮類化合物；5=甘油磷脂；6=異黃酮；7=異戊二烯脂類；8=嘌呤核苷酸；9=類固醇和類固醇衍生物；10=肉桂酸及其衍生物；11=苯丙酸；12=嘌呤核苷；13=嘧啶核苷；14=四吡咯及其衍生物；15=生物素及其衍生物；16=碳水化合物和碳水化合物結合物；17=香豆素及其衍生物；18=二嗪類；19=二氫呋喃；20=吲哚及其衍生物。圖7B中，1=淀粉和蔗糖代謝；2=萜類骨架生物合成；3=異喹啉生物堿生物合成；4=嘌呤代謝；5=單萜生物合成；6=鞘脂代謝；7=嘧啶代謝；8=花生四烯酸代謝；9=泛醌和其他萜類-醌生物合成；10=生物素代謝；11=氨基糖和核苷酸糖代謝；12=二萜生物合成；13=脂肪酸生物合成；14=芪類、二芳基庚烷類和姜辣素生物合成；15=抗壞血酸和醛糖酸鹽代謝；16=糖基磷脂酰肌醇(GPI)-錨定生物合成；17=內吞作用；18=自噬-動物；19=RNA轉運；20=類固醇生物合成。圖7C中，1=脂肪酰基；2=羧酸及其衍生物；3=有機氧化合物；4=黃酮類化合物；5=甘油磷脂；6=嘌呤核苷；7=肉桂酸及其衍生物；8=有機氮化合物；9=異戊二烯脂類；10=嘧啶核苷；11=四吡咯及其衍生物；12=5'-脫氧核糖核苷；13=苯和取代衍生物；14=香豆素及其衍生物；15=二氫呋喃；16=雜芳族化合物；17=吲哚及其衍生物；18=有機碳酸及其衍生物；19=酚類；20=苯丙酸。圖7D中，1=嘌呤代謝；2=卟啉和葉綠素代謝；3=氰基氨基酸代謝；4=苯丙氨酸代謝；5=單萜生物合成；6=異喹啉生物堿生物合成；7=不飽和脂肪酸的生物合成；8=β-丙氨酸代謝；9=淀粉和蔗糖代謝；10=檸檬酸循環(TCA循環)；11=嘧啶代謝；12=苯丙烷生物合成；13=甘油磷脂代謝；14=二萜生物合成；15=芪類、二芳基庚烷類和姜辣素生物合成；16=抗壞血酸和醛糖酸鹽代謝；17=RNA轉運；18=內吞作用；19=糖基磷脂酰肌醇(GPI)-錨定生物合成；20=自噬-動物Note:In figure 7A,1=fatty acyl group;2=carboxylic acid and its derivatives;3=organic oxygen compound;4=flavonoids;5=glycerophospholipids;6=isoflavones;7=isoprene lipids;8=purine nucleotides;9=steroids and steroid derivatives;10=cinnamic acid and its derivatives;11=phenyl propionic acid;12=purine nucleoside;13=pyrimidine nucleoside;14=tetrapyrrole and its derivatives；15=Biotin and its derivatives;16=Carbohydrate and carbohydrate conjugates;17=Coumarin and its derivatives;18=Diazines;19=Dihydrofuran;20=Indole and its derivatives. In Figure 7B,1=fatty acyl;2=carboxylic acid and its derivatives;3=organic oxygen compounds;4=flavonoids;5=glycerophospholipids;6=purine nucleosides;7=cinnamic acid and its derivatives;8=organic nitrogen compounds;9=isoprene lipids;10=pyrimidine nucleosides;11=tetrapyrroles and their derivatives;12=5'-deoxyribonucleosides;13=benzene and substituted derivatives;14=Coumarin and its derivatives;15=dihydrofuran;16=heteroaromatic compounds;17=indole and its derivatives;18=organic carbonic acid and its derivatives;19=phenols;20=phenyl propionic acid. In figure 7C,1=starch and sucrose metabolism;2=terpenoid skeleton biosynthesis;3=isoquinoline alkaloid biosynthesis;4=purine metabolism;5=monoterpene biosynthesis;6=sphingolipid metabolism;7=pyrimidine Metabolism;8=arachidonic acid metabolism;9=ubiquinone and other terpenoid-quinone biosynthesis;10=biotin metabolism;11=amino sugar and nucleotide sugar metabolism;12=diterpene biosynthesis;13=fatty acid Biosynthesis;14=Stilbene,diarylheptanes and gingerol biosynthesis;15=Ascorbic acid and aldonate metabolism;16=Glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchored biosynthesis;17=Endocytosis;18=autophagy-animal;19=RNA transfer;20=steroid biosynthesis. In figure 7D,1=purine metabolism;2=porphyrin and chlorophyll metabolism;3=cyanoamino acid metabolism;4=phenylalanine metabolism;5=monoterpene biosynthesis;6=isoquinoline alkaloid biosynthesis 7=Biosynthesis of unsaturated fatty acids;8=β-alanine metabolism;9=starch and sucrose metabolism;10=citric acid cycle (TCA cycle);11=pyrimidine metabolism;12=phenylpropane biosynthesis;13=Glycerol phospholipid metabolism;14=diterpene biosynthesis;15=stilbene,diarylheptanes and gingerol biosynthesis;16=ascorbic acid and aldonic acid metabolism;17=RNA transport;18=endocytosis;19=Glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchored biosynthesis;20=autophagy-animal

從表2中可知，干旱脅迫處理百脈根葉片的前19種差異顯著的代謝產物中，14種代謝產物上調，其中7,12-二甲基苯[a]蒽5,6-氧化物(Dimethylbenz[a]anthracene 5，6-oxide)、1-水楊酸葡萄糖醛酸苷(1-Salicylate glucuronide)、2,3,23-三乙酰絲膠酸(2,3,23-Triacetylsericic acid)顯著上調，小柱孢酮(Scytalone)、(E)-3-(2-羥基苯基)-2-丙烯醛顯著下調。從表3中可知，低磷脅迫處理百脈根葉片的前19種差異顯著的代謝產物中，12種代謝產物上調，其中丙二酸氫乙酯(Ethyl hydrogen malonate)、5′-O-(吡喃葡萄糖基)吡哆辛(5′-O-β-D-Glucosylpyridoxine)、D-α-葡萄庚糖(D-α-Glucoheptose)顯著上調。塞蘭寧(Salannin)、6-十五烷基水楊酸(6-pentadecyl Salicylic Acid)顯著下調。

表2 干旱脅迫條件下百脈根葉片中主要差異代謝物Table 2 Main differential metabolites in the leaves of Lotus corniculatus under drought stress

表3 低磷脅迫條件下百脈根葉片中主要差異代謝物Table 3 Major difference metabolites in leaves of Lotus corniculatus under low phosphorus stress

3 討論

植物對逆境脅迫最重要的響應是代謝的改變，即植物通過調節代謝網絡以誘導產生一系列特殊代謝物，從而達到對生物、非生物脅迫的防御作用。代謝組學可以通過監測植物體系受到脅迫或刺激后代謝產物的變化來揭示脅迫環境下植物的應答機制，是植物抗逆研究的很好的途徑[24]。本研究通過PCA和OPLS-DA分析、差異倍數柱圖和差異代謝物火山圖分析表明，貴州天然豆科牧草百脈根在干旱和低磷環境中均具有非常明顯的代謝特征，推測基礎代謝物組成作為植物生化反應的物質基礎在應答兩種脅迫方面具有重要意義。干旱脅迫下百脈根390條差異代謝物比低磷脅迫高出58條，表明百脈根在應答干旱脅迫中積累了更多的代謝物。Bailin[25]等的研究表明，正向和負向電離模式下分別有448個上調基因和918個下調基因以及325種和219種化合物分別響應短期和長期熱脅迫而上調或下調。植物生長和防御的主要調節因子信號轉導是植物應答非生物脅迫的重要過程[26]。甘油磷脂作為植物細胞對蛋白質的識別和信號傳導的重要代謝物，是植物應對逆境脅迫應答機制之一，本試驗干旱和低磷脅迫差異物質映射的代謝通路中，都注釋到了甘油磷脂通路。酮體、萜類化合物有助于增強植物的抗旱性[27-28]，兩種脅迫處理百脈根注釋到的通路中，酮體的合成和降解、萜類化合物代謝等揮發性物質都表現為上調。植物產生的揮發性物質，如烷烴類、烯烴類、醛類、酮類、萜烯類化合物影響植物的抗旱調節[29]。本實驗干旱脅迫處理百脈根葉片中前19種差異顯著的代謝產物中絕大多數都是此類物質。李小冬[30]等研究在干旱脅迫下高羊茅(Festucaarundinacea)葉片代謝組中鑒定出282種物質存在差異，其中脂代謝產物和芳香族化合物含量差別較大，與本實驗干旱脅迫主要聚類為脂肪酰基、多聚異戊二烯醇脂質研究結果一致。植物需要使用專門的新陳代謝機制以免受環境壓力這一觀點需要通過解決以下問題來證明：專門的新陳代謝機制所能承受的壓力是否直接歸因于代謝產物，如類黃酮。前人在茶樹研究中發現，酮類化合物具有清除活性氧的作用，增強植物對環境變化的適應性[31]。在擬南芥的研究中發現，類黃酮具有自由基清除活性，增強了擬南芥對非生物脅迫的耐受性[3,32]，這與本研究的結果一致。

4 結論

在研究中，我們對低磷和干旱脅迫下的百脈根進行了代謝物分析。通過分析對照組、低磷脅迫組和干旱脅迫組之間的差異代謝物、差異代謝定量差異倍數、差異代謝物KEGG代謝通路和主要差異代謝物類型，發現百脈根在低磷和干旱脅迫下多種代謝物發生了變化，這些產物可能參與調控百脈根抵御低磷和干旱脅迫，為進一步研究百脈根抵御低磷和干旱脅迫的機制提供了基礎。