大狼毒對紫花苜蓿種子萌發及幼苗生長的化感效應研究

李彥飛， 初曉輝， 李嘉懿， 馬祖艷， 牛瓊梅， 單貴蓮*

(1.云南農業大學動物科學技術學院， 云南 昆明 650201；2.德州市慶云縣自然資源局， 山東 德州 253700)

植物化感作用(Allelopathy)是指植物通過向環境釋放特定的化學物質從而影響臨近或后續同種或異種植物萌發和生長的效應[1]。植物會通過化感作用增強植物競爭能力、改變群落物種分布格局[2]。植物化感作用在草地植物群落格局的構建及群落演替過程中占據著重要的地位和作用[2-5]。化感作用會通過影響群落內其他物種的種子萌發和幼苗生長，進而改變群落中物種的分布格局[6-11]。如Li等研究表明，冷蒿(Artemisiafrigida)會對典型草原常見物種萌發和生長產生影響[7]。孫庚等研究表明，瑞香狼毒(Stellerachamaejasme)花粉浸提液會顯著降低與它同花期的其它物種的花粉萌發和種子結實[8]。鮑根生等指出，甘肅馬先蒿(Pediculariskansuensis)浸提液對中華羊茅(Festucasinensis)、垂穗披堿草(Elymusnutans)等草原物種的種子萌發和幼苗生長具有顯著的抑制作用[9]。張玉娟研究表明，星毛委陵菜(Potentillaacaulis)浸提液對冷蒿幼苗的生長表現出“低促高抑”的化感效應[10]，該物種具有的化感作用對促進其占據過度放牧草原的群落優勢地位起到了關鍵的控制作用[11]。化感作用還被證明是群落演替的重要驅動力[4,12-13]。如Rice等指出，化感作用在俄克拉荷馬草原群落演替過程中起著重要的作用，在群落演替的先鋒階段，雜草分泌的化學物質不僅會抑制土壤中固氮微生物的生長活性，造成土壤退化，也會產生自毒效應，從而影響群落演替進程[12]。鄧文紅研究表明，鄂爾多斯沙地的黑沙蒿(Artemisiaordosica)通過釋放化感物質來影響共生植物的種子萌發和幼苗生長，從而影響和調節群落演替進程[13]。

大狼毒(Euphorbiajolkinii)屬大戟科多年生毒害草型草本植物，分布于云南、臺灣、四川等地[14]。該物種具有根系入土深，抗寒抗旱性強，對土壤養分，特別是對土壤磷競爭強等特性[15-16]，一般情況下，在適度放牧的草地，大狼毒在草地植物群落中以偶見種或伴生種存在，在放牧過度的退化草地，大狼毒常成片生長并逐漸取代優良牧草而成為群落中的優勢物種[17-19]。在大狼毒種群集中分布區域，草地中物種數量銳減，群落中僅有大狼毒、西南委陵菜(Potentillafulgens)、綬草(Spiranthessinensis)、西南野古草(Arundinellahookeri)、三穗苔草(Carextristachya)等少數幾個物種存在，且西南野古草、三穗苔草等優良牧草產量大幅度下降，大狼毒密度及生物量顯著增加，大狼毒成為了群落的優勢物種，草地基本失去其生產價值[19]。

大狼毒的擴散蔓延導致草地物種多樣性顯著下降的原因之一可能是化感作用。為探討狼毒是否會對其它物種產生化感作用這一科學問題，本研究居于作者前期開展的滇西北高寒地區優良牧草適應性評價的研究結果[20]，并兼顧考慮供、受體材料生態位的重疊，選取根系入土深，抗寒抗旱性強，適宜用于滇西北高寒地區補播治理退化草地及建植人工草地的‘牧歌401+Z’紫花苜蓿(Medicagosativa‘Amerigraze 401+Z’)為受體材料，開展大狼毒植株及其根部土壤對紫花苜蓿種子萌發、幼苗生長及生理的化感效應研究。通過本項研究，探討大狼毒化感作用是否存在，揭示大狼毒蔓延區草地物種多樣性銳減的原因，促進退化草地的恢復治理。

1 材料與方法

1.1 供試材料及獲取方法

1.1.1大狼毒根、莖葉及根部土壤的獲取 2019年8月中下旬大狼毒生長旺盛期，于云南省迪慶州香格里拉縣挖取大狼毒完整植株，將盛花期大狼毒植株上的灰土刷凈，分為根、莖葉2部分，帶回實驗室自然風干、粉碎、過篩(孔徑0.45 mm)備用。同步采集大狼毒根部土壤(根部周圍5 cm范圍)，采集深度為0～20 cm，帶回實驗室風干備用。

1.1.2受體材料來源及品種特性 受體材料為北京正道種業有限公司提供的‘牧歌401+Z’紫花苜蓿。該品種原產地美國，具有產量高品質好、抗寒抗旱性強等特性，引種試驗表明其在滇西北高寒地區適應性好，生產性能高，是當地建植人工草地及改良天然草地的優選品種[20]。

1.2 測定指標與方法

1.2.1種子萌發試驗及測定指標 參照劉雅婧等[21]的方法，采用培養皿法開展種子萌發試驗研究。具體為：分別稱取大狼毒根、莖葉、根部土壤100 g，放入1 000 mL蒸餾水中，恒溫震蕩12 h后靜置12 h，用定量濾紙和孔徑為0.45 μm的濾膜二重過濾，得到100 g·L-1的浸提液母液，將該母液用蒸餾水稀釋，分別獲得濃度為25，50，75，100 g·L-1的浸提液[21]。浸提液放入4℃的冰箱中冷藏備用。

挑選飽滿、無蟲害的苜蓿種子置于濃度為2 %的次氯酸鈉(NaClO)溶液中浸泡20 min，用自來水沖洗3次，純凈水沖洗2次。以培養皿為載體，每皿100粒苜蓿種子，在(25±1)℃下，14 h光照/10 h黑暗，光強 6 000 lx進行培養，研究添加蒸餾水(CK，設為對照)，25 g·L-1(C25)，50 g·L-1(C50)，75 g·L-1(C75)，100 g·L-1(C100)大狼毒根、莖葉、根部土壤對苜蓿種子發芽率和發芽勢的影響。每濃度梯度設3次重復。一旦胚根出現則認為種子已經萌發。逐日觀察記錄發芽種子并補充蒸發的水分，使各處理液濃度維持不變。記數持續進行到經過3 d再無種子發芽，種子發芽結束后計算發芽率和發芽勢[21]。

發芽率=發芽種子數/供試種子數×100%

發芽勢=(第4天發芽種子數/供試種子數)×100%

1.2.2幼苗生長試驗及測定指標 模擬植物在自然條件下產生化感作用的狀況，參考王慧等的方法[22]，采用穴盤法開展幼苗生長試驗。在穴盤中添加不同用量的大狼毒粉碎物，通過大狼毒在土壤中緩慢腐解釋放化感物質的方法，開展大狼毒對受體植物幼苗生長及生理化感效應的研究。具體為：分別稱取0，1，2，3 g大狼毒根、莖葉、根部土壤放到體積為400 mL的穴盤中(編號為Y0，Y1，Y2，Y3，每用量設5次重復)與珍珠巖混合均勻，于2020年5月中旬播種(每重復播種50粒)，每隔一天澆一次水，每周澆一次Hoagland營養液，出苗后生長35 d左右待紫花苜蓿長到分枝期，測定單株鮮重、株高(垂直高度)、根長[23]。參考王學奎(2006)[24]的方法，測定幼苗的根系活力、丙二醛(Malondialdehyde，MDA)含量及可溶性糖含量。

1.3 數據處理

采用SPSS 17.0對數據進行單因素方差分析、差異性檢驗及多重比較(Duncan法)，數據用平均值±標準誤表示。用Muhammad等(2021)[25]的方法計算化感效應指數(Inhibitory rate，RI)，公式為RI= 1-C/T(T為處理組，C為對照組)，其中RI>0表現促進效應，RI<0表示抑制效應，絕對值大小代表化感效應強度。綜合化感效應(Synthetical effect，SE)反應化感效應的強弱，用各處理的RI的均值來表示，公式為SE=(RI1+RI2+……+RIn)/n，SE<0表示抑制效應，SE>0表現促進效應，且SE絕對值大小表示化感效應作用強度，n是化感效應指數的個數[21]。

2 結果與分析

2.1 大狼毒對紫花苜蓿種子萌發的影響

發芽率高表示有生命的種子多。由圖1(A)可知，與CK相比，低、中濃度(C25，C50)大狼毒根部土壤、根水浸提液對紫花苜蓿發芽率無顯著影響；高濃度(C75，C100)大狼毒根部土壤、根水浸提液顯著抑制了紫花苜蓿的發芽率(P<0.05)。低濃度(C25)大狼毒莖葉水浸提液對紫花苜蓿發芽率無顯著影響，中、高濃度(C50，C75，C100)大狼毒莖葉水浸提液顯著抑制了紫花苜蓿的發芽率(P<0.05)，發芽率分別比CK降低了8.1%，13.7%和25.6%。

發芽勢高表示種子的生活力強，發芽出苗整齊一致[14]。如圖1(B)所示，與CK相比，低濃度(C25)大狼毒根部土壤、莖葉、根水浸提液對紫花苜蓿的發芽勢有一定的促進效果，但促進效果均不顯著；中、高濃度(C50，C75，C100)大狼毒根部土壤、莖葉、根水浸提液會導致紫花苜蓿發芽勢的顯著下降(P<0.05)。

圖1 大狼毒浸提液對紫花苜蓿種子萌發的影響Fig.1 Effects of extracts from E. jolkinii on alfalfa seed germination注：不同小寫字母表示大狼毒同一部位不同濃度對紫花苜蓿種子萌發的影響有顯著差異(P<0.05)Note:Different lowercase letters indicate that different concentrations of the same treatment have significant difference at the 0.05 level

由圖2可知，低濃度(C25)大狼毒浸提液對紫花苜蓿種子萌發的綜合化感效應為正值，即低濃度大狼毒浸提液對紫花苜蓿種子萌發有一定的促進作用；中、高濃度(C50，C75，C100)大狼毒浸提液對紫花苜蓿種子萌發的綜合化感效應均為負值，即高濃度大狼毒浸提液對紫花苜蓿種子萌發有抑制作用，且隨浸提液用量的增加抑制作用增強。不同部位大狼毒浸提液的綜合化感效應強弱順序為：根>莖葉>根部土壤。

圖2 大狼毒浸提液對紫花苜蓿種子萌發的綜合化感效應Fig.2 Allelopathic effects of E. jolkinii extracts on alfalfa seed germination

2.2 大狼毒對紫花苜蓿幼苗生長的影響

由圖3(A)可知，添加大狼毒根、莖葉粉碎物后，紫花苜蓿株高總體呈下降趨勢，與CK相比差異顯著(P<0.05)；低用量(Y1)大狼毒根部土壤促進紫花苜蓿的生長，與CK相比株高顯著增加，中、高用量(Y2，Y3)大狼毒根部土壤對紫花苜蓿株高無顯著影響，與CK相比株高無顯著變化。由圖3(B)可知，與CK相比，添加大狼毒根部土壤對紫花苜蓿根的生長有一定的促進作用，但促進效果不顯著；添加大狼毒莖葉、根粉碎物對紫花苜蓿根的生長有顯著的抑制作用(P<0.05)，且抑制作用隨大狼毒用量的增加而加強。由圖3(C)可以看出，添加大狼毒根部土壤對紫花苜蓿單株鮮重無顯著影響；添加大狼毒莖葉、根粉碎物會顯著抑制紫花苜蓿地上部的生長，顯著降低其地上部單株鮮重(P<0.05)，且其抑制作用隨大狼毒添加量的增加而加強。與CK相比，高用量(Y3)大狼毒莖葉、根粉碎物處理下，紫花苜蓿地上部單株鮮重分別下降了59.4%和65.7%。

圖3 大狼毒對紫花苜蓿幼苗生長的影響Fig.3 Effects of E. jolkinii on alfalfa seedling growth注：不同小寫字母表示大狼毒同一部位不同用量對紫花苜蓿幼苗生長的影響有顯著差異(P<0.05)，下圖同Note:Different lowercase letters indicate that different concentrations of the same treatment have significant difference at the 0.05 level,the same as below

由圖4所示，大狼毒根部土壤、根、莖葉對紫花苜蓿幼苗生長的綜合化感效應強弱順序為：根>莖葉>根部土壤。具體體現為：低用量(Y1)大狼毒根部土壤對紫花苜蓿幼苗生長有一定的促進作用，原因可能是大狼毒根部土壤含有較高的C，N，P等營養物質[15]，因此促進了紫花苜蓿的生長。中、高用量(Y2，Y3)大狼毒根部土壤對紫花苜蓿幼苗生長無顯著影響，原因可能是隨著添加量的增加，土壤中化感物質含量增加，化感作用增強，化感產生的抑制作用和養分增加帶來的促進作用相抵消，因此對紫花苜蓿幼苗生長表現為無顯著影響。大狼毒莖葉、根粉碎物在腐解過程中均對紫花苜蓿幼苗生長有抑制作用，且抑制效果隨大狼毒用量的增加而增強，分析原因為大狼毒植株體內含有二萜、三萜類、苯丙素類等化學物質[26]，這些化學物質會抑制受體植物的生長，且隨著粉碎物用量的增加，抑制作用增強。

圖4 大狼毒對紫花苜蓿幼苗生長的綜合化感效應Fig.4 Allelopathic effects of E. jolkinii on alfalfa seedling growth

2.3 大狼毒對紫花苜蓿幼苗生理的影響

MDA是膜脂過氧化最重要的產物之一，它的產生會加劇細胞膜的損傷。如圖5(A)所示，添加大狼毒根部土壤后，紫花苜蓿幼苗體內MDA含量顯著降低，與CK相比差異顯著(P<0.05)。添加大狼毒莖葉和根粉碎物處理后，紫花苜蓿MDA含量均顯著增加，與CK相比差異顯著(P<0.05)(Y1根處理除外)，且增加幅度隨大狼毒莖葉和根粉碎物添加量的增加而增加。

可溶性糖可通過調節滲透壓來抵抗脅迫損傷，進而對細胞起到保護作用。如圖5(B)所示，添加大狼毒根部土壤后，紫花苜蓿可溶性糖含量顯著升高(P<0.05)，Y1，Y2，Y3根部土壤處理下，紫花苜蓿可溶性糖含量分別是CK的2.3，2.4和2.2倍。添加大狼毒莖葉和根粉碎物處理后，紫花苜蓿可溶性糖含量顯著下降(P<0.05)(Y1根處理除外)，且下降幅度隨大狼毒莖葉和根粉碎物添加量的增加而增加。具體為：與CK相比，Y1，Y2，Y3莖葉處理下，紫花苜蓿可溶性糖分別降低21.2%，51.4%和66.6%；Y1，Y2，Y3根處理下，紫花苜蓿可溶性糖含量分別降低38.2%，70.8%和77.7%。

根系活力對植物體的生長至關重要，其水平直接影響植物體的生長情況。如圖5(C)所示，添加大狼毒根部土壤后，紫花苜蓿根系活力顯著增強，與CK相比差異顯著(P<0.05)。添加大狼毒莖葉和根粉碎物處理后，紫花苜蓿根系活力下降，與CK相比差異顯著(P<0.05)(Y1莖葉處理除外)，且下降幅度隨大狼毒粉碎物用量的增加而增加。與CK相比，Y1，Y2，Y3莖葉處理下，紫花苜蓿根系活力分別下降0.9%，14.7%和21.2%。Y1，Y2，Y3根處理下，紫花苜蓿根系活力分別下降35.7%，41.0%和44.3%。

由圖6可知，大狼毒根部土壤對紫花苜蓿幼苗生理的綜合化感效應為正值，即根部土壤對紫花苜蓿的生長有促進作用；大狼毒莖葉和根粉碎物在腐解過程中對紫花苜蓿的綜合化感效應為負值，即大狼毒莖葉和根粉碎物在腐解過程中對紫花苜蓿的生長產生抑制作用，抑制作用強度隨粉碎物用量的增加而增強。大狼毒根部土壤、根、莖葉對紫花苜蓿幼苗生理的綜合化感效應強弱順序為：根>莖葉>根部土壤。

3 討論

植物間的化感作用主要體現在對受試植物種子萌發和幼苗生長的影響。針對毒害草對植物種子萌發的影響，前人研究表明，毒害草對植物種子的萌發基本表現為“低促高抑”，且抑制強度隨化感物質濃度的增加而加強[9,21-22,27-29]。毒害草所含有的萜類物質會干擾線粒體發揮正常功能，妨礙代謝過程并可抑制細胞分裂伸長，使細胞分化減少，礦質離子吸收受阻，組織出現紊亂，從而抑制種子的發芽和生長[29-30]。本研究結果表明，大狼毒浸提液對紫花苜蓿種子萌發的影響表現為“低濃度促進高濃度抑制”，但促進效果不顯著。不同部位大狼毒水浸提液對紫花苜蓿種子萌發的作用強度有差異，體現為根>莖葉>根部土壤。高濃度大狼毒浸提液推遲了紫花苜蓿種子的萌發時間，降低其最終發芽率，推測可能是大狼毒水浸提液中化學物質使紫花苜蓿種子的細胞活動受到了影響，種子正常的生理代謝活動發生異常，種子萌發的生理過程延期并影響了發芽率，但化感物質的種類還有待進一步研究。

幼苗生長對于植物整個生活至關重要，植物在幼苗階段向外界充分吸收營養物質供植物體生存和繁衍。劉雅婧等研究表明，狼毒浸提液處理下紫花苜蓿、垂穗披堿草(Elymusnutans)、冰草(Agropyroncristatum)幼苗生長均受到抑制，且抑制作用隨狼毒浸提液濃度的增加而增強[21]。劉利紅研究表明，不同質量濃度狼毒根、莖葉水浸液處理對5種受體植物各項形態指標具有促進和抑制的雙重作用，其化感效應指數體現為隨濃度升高而降低[30]。本研究模擬自然界中殘株腐解的化感作用方式開展大狼毒對紫花苜蓿幼苗生長的影響研究，結果表明大狼毒根部土壤對紫花苜蓿幼苗形態指標綜合化感效應為正值，即為促進作用，但促進效果不顯著。原因可能是由于大狼毒的“肥島效益”使根部土壤中富集了更多的C，N，P[15,18]，大狼毒根部土壤的添加使苜蓿生長環境中土壤養分含量增加，因此體現為根部土壤的添加促進了紫花苜蓿幼苗的生長，但此結論還需進一步的深入研究。大狼毒根、莖葉水浸液對幼苗形態指標的影響為負值，即抑制作用，且隨粉碎物用量的升高抑制作用增強，原因是大狼毒水浸提液中化學物質使紫花苜蓿幼苗生理活動受到了影響，進而影響其生長。

關于毒害草對植物生理指標的影響，馬銀山等研究表明，不同濃度的天仙子(Hyoscyamusniger)種子浸提液處理下，多年生黑麥草(Loliumperenne)幼苗MDA含量隨浸提液濃度的增加而增加[29]。李翔研究表明黃花棘豆(Oxytropisochrocephala)水提液處理降低了燕麥(Avenasativa)幼苗的可溶性糖及根系活力，提高了MDA含量，且對受體根的化感作用強于對莖葉[31]；富瑤研究表明瑞香狼毒提取液使藎草(Arthraxonhispidus)幼苗可溶性糖含量降低，MDA含量升高[32]。本研究表明，大狼毒莖葉、根粉碎物在腐解過程中使受體植物紫花苜蓿可溶性糖含量和根系活力降低，MDA含量增加。大狼毒體內所含化學物質首先作用于紫花苜蓿的根并對其膜透性產生影響，對根系活力的抑制作用導致紫花苜蓿對生長所需的水分、養分吸收運轉過程受阻，導致紫花苜蓿正常的生理代謝異常，幼苗組織內淀粉酶活力下降，淀粉難于水解為可溶性糖，致使幼苗生長能源缺乏，不能進一步轉化為氨基酸形成蛋白質，從而抑制紫花苜蓿生長。大狼毒根部土壤處理對紫花苜蓿生理指標的影響與對形態指標的影響表現出相似的結果，即大狼毒根部土壤的添加使苜蓿生長環境中土壤養分含量增加[15,18]，肥力的增加一定程度上提高了紫花苜蓿幼苗可溶性糖含量及根系活力，降低其MDA含量，促進了紫花苜蓿幼苗的生長。

綜上所述，大狼毒的化感作用真實存在，化感作用是導致大狼毒種群蔓延區草地物種多樣性銳減的主要原因之一。針對大狼毒型退化草地的補播治理，不僅要考慮補播材料對當地的氣候適應性，還應該考慮補播材料對大狼毒的化感適應性。今后，應深入開展目前廣泛用于滇西北退化高寒草地補播治理的白三葉(Trifoliumrepens)、紅三葉(Trifoliumpratense)、多年生黑麥草、鴨茅(Dactylisglomerata)、紫花苜蓿等優良牧草對大狼毒化感適應性的比較研究，篩選出對大狼毒化感作用不敏感的優良牧草，促進滇西北大狼毒蔓延區退化草地的恢復治理及草地畜牧業的健康發展。另外，本研究主要針對大狼毒對紫花苜蓿種子萌發和幼苗生長展開試驗，得到不同濃度及不同部位大狼毒浸提液對紫花苜蓿種子萌發的化感作用強度，以及不同用量及不同部位大狼毒粉碎物對紫花苜蓿幼苗生長的化感作用強度，但對于大狼毒化感物質的成分，以及大狼毒根部土壤促進牧草幼苗生長的結論，還需要進一步以其他牧草為受體材料，開展深入研究。

4 結論

大狼毒水浸提液對紫花苜蓿種子萌發率和萌發進程體現為“化感抑制”作用，且抑制作用隨浸提液濃度的增加而增強。大狼毒植株粉碎物在腐解過程中會導致紫花苜蓿根系活力和可溶性糖含量降低，MDA含量升高，進而顯著抑制紫花苜蓿幼苗的生長(P<0.05)，大狼毒根部土壤對紫花苜蓿幼苗生長有一定的促進作用，但促進效果不顯著。大狼毒根、莖葉、根部土壤對紫花苜蓿萌發生長的綜合化感效應強弱順序為：根>莖葉>根部土壤。