底棲螺酶活性對樂安河沉積物重金屬含量生理響應研究

張力薇，李學飛，劉振環，李欣蕊，趙軍利，顧 鎏*

(1.江西水利職業學院，330013，南昌；2.江西省鄱陽湖水利樞紐建設辦公室，330009，南昌；3.生態環境部海河流域北海海域生態環境監督管理局生態環境監測與科學研究中心，300170，天津)

0 引言

河流沉積物重金屬污染己經成為我國當今嚴重威脅河流水生態環境的突出問題[1-3]，重金屬分布與富集作用對動物和植物危害巨大[4]。我國是一個礦產資源大國，礦產開發對當前經濟持續增長提供了重要的保障。然而，由采場廢水、廢石場廢水、選礦廢水、礦物加工過程中產生的廢水、尾礦庫溢流水以及未達標排放選冶廢水所組成的酸性礦山廢水(Acid Mine Drainage，AMD)富含重金屬元素，往往使得礦山附近的地表水體遭受污染。亞洲最大的露天銅礦——德興銅礦位于樂安河上游，而樂安河是鄱陽湖的5條入湖河流——饒河的重要支流，因此樂安河重金屬污染分布特征間接地影響著鄱陽湖。

德興銅礦為國內最大的銅礦，開采過程中酸洗廢水通過大塢河注入樂安河，嚴重地污染了樂安河中下游流域，尤其以重金屬Cu、Zn、Pb、Cd的污染問題較為突出。重金屬元素在水體中以各種形態分布在水相、沉積相及生物相中，表現出不同的環境地球化學行為和環境效應。其中，作為水生態系統中重要的組成部分沉積物在水體底部長期積存，是環境污染物在廣泛空間和長期時間內的匯集處，能較好地反映流域內重金屬污染狀況[5-7]。因此，為了解掌握樂安河沉積物重金屬污染分布及其生物響應特征，本文以樂安河為研究對象，主要研究內容為：1)沿河布點，采集沉積物進行重金屬濃度分析及重金屬風險評價；2)開展底棲生物——中華田園螺原位暴露酶活性響應實驗研究。本研究成果將有助于樂安河重金屬污染風險管控，指導樂安河構建重金屬風險底棲生物風險評估體系，為河流水生態管理與評價提供重要理論支撐。

1 實驗與方法

1.1 研究區域

本文以樂安河為研究對象，全長279 km，為饒河的主干，上游水質較好，下游多有工業、采砂以及開礦等活動。本次實驗采樣點位置如圖1所示，將樂安河分為上中下3個河段，共布設采樣點位11個，點位信息見表1。

圖1 樂安河重金屬實驗采樣點位置示意圖

表1 樂安河重金屬實驗采樣點位信息表

1.2 實驗方法

重金屬濃度分布：2019年11月在11個樣點處采集水-土界面向下20 cm 的沉積物3～4個混合成一個樣品，裝入自封袋冷藏，供實驗分析。將樣品放于通風處自然風干后剔除雜物，研磨，稱取 0.1 g樣品置離心管中，加入少量超純水(Millipore)潤濕，在離心管中加入約2滴HNO3，輕微震蕩離心管，使樣品與HNO3均勻混合; 然后將離心管放于消解儀上1 000 °C時消解24 h，冷卻后，取上清液進行分析測定[8]。實驗室分析項目包括：Cu、Zn、Pb、Cd、Cr、As以及Ni等7種重金屬元素。

底棲螺生物響應：中華圓田螺在我國分布較廣，常以水生植物(低等藻類以及水體沉積物)為食。田螺作為水生底棲生物在水中的移動性很小，生活環境相對固定，因此本次生物響應試驗選取中華圓田螺為生物標志物通過環境毒理試驗來反映重金屬污染情況對其生物性質的影響[9]。本次試驗為原位實驗，將田螺放養于預制漁網中，放養密度為5～10只/個，沿樂安河中游及下游(8個監測點)分布，自然條件下暴露7 d、14 d，以田螺組織中的酶活性來判斷底泥或水中污染物的毒性。

圖2 樂安河采樣與室內實驗照片

2 結果與討論

2.1 沉積物重金屬分布特征

沉積物中7種重金屬的濃度統計結果如表2所示。7種重金屬的平均含量從大到小依次為：Cu>As>Pb>Zn>Ni>Cr>Cd，從空間分布情況來看，Cu的含量空間差異性最大，上游S1～S3點位濃度在27.69～37.64 μg/g之間，到達S4后含量有所上升，S5以下點位位于德興銅礦下游，沉積物中Gu含量明顯上升，最高值出現在S7，含量為788.69 μg/g，S6～S11含量范圍為341.66～788.69 μg/g之間；除Cd外，其余6種重金屬在11個點位中仍表現出一定的空間分異特征。Zn含量最大值出現在S7，為89.74 μg/g，Cv值為0.6；Pb含量最大值出現在S5，為86.13 μg/g，Cv值為0.52；Cr含量最大值出現在S4，為48.56 μg/g，Cv值為0.37；As含量最大值出現在S7，為116.79 μg/g，Cv值為0.51；Ni含量最大值出現在S6，為52.79 μg/g，Cv值為0.22。由此可知，銅礦對樂安河中下游底泥沉積物中重金屬含量有非常顯著的影響。

表2 樂安河重金屬實驗采樣點位信息表/μg·g-1

2.2 重金屬風險評價

本文采用地累積指數法對樂安河11個采樣點沉積物重金屬污染程度進行評價[10]，該方法廣泛應用于重金屬的污染評價，污染等級劃分參考[11]。其計算公式為：

其中：Igeo為地累積指數；Cn為沉積物中重金屬含量；k為常數，通常取1.5；Bn為地球化學背景值，本文參考南寧市土壤重金屬元素背景值[21]。

11個點位7種重金屬地累積指數如圖3。由于德興銅礦的影響，中下游S6～S11點位為重度以上污染，其余6種重金屬各點位未出現重度污染。其次為Cd有3個點位(S1、S6、S8)為偏重度污染，大部分點位均為輕度污染。其余5種重金屬在11個沉積物樣品中基本處于偏中度污染狀態；從空間分布情況看，各種重金屬地累積指數均表現出不同程度的自上游向下游污染程度逐漸加重的趨勢，Gu無疑是變化最明顯的，其次為Zn、As等。

圖3 7種重金屬地累積指數分布圖

2.3 生物酶活性響應機制

2020年4—5月，取樂安河上游段(S1～S3)田螺約300只，其中大部分田螺用于中下游放養實驗(實地調查結果發現中下游并無田螺，且有大量采砂船及工廠分布)，其中小部分帶回實驗室進行田螺的酶活性檢測。中下游放養時間為2020年4月17日，第1次采樣時間為2020年4月27日，第2次采樣時間為2020年5月8日；由于持續降雨影響，樂安河河水暴漲，使得監測點S3、S11點位實驗網被大水淹沒、沖走或是人為破壞而丟失。樣品帶回實驗室后去殼取出組織，按照實驗操作規程立即進行勻漿處理，并用高速離心機取其上清液致于-20 ℃冰箱中待測。檢測指標為TChE(總膽堿酯酶)、MDA(丙二醛)、GSH(谷胱甘肽過氧化物酶)、SOD(超氧化物歧化酶)、MT(金屬硫蛋白)等。

2.3.1 TChE活性的響應 TChE(總膽堿酯酶，Acetyl cholinesterase)是生物神經傳導中的一種關鍵性酶，在膽堿能突觸間，該酶能降解乙酰膽堿，終止神經遞質對突觸后膜的興奮作用，保證神經信號在生物體內的正常傳遞[12]。本研究野外暴露在整個試驗過程中，田螺組織中TChE活性的變化范圍連續暴露10 d TChE活性0.583～4.007 U/mgprot；連續暴露20 d TChE活性1.415～5.738 U/mgprot。總體上看，連續暴露10 d和20 d田螺組織中的TChE活性有所波動但幅度不大，但連續暴露10 d上游段、中游段以及下游段之間TChE活性都出現明顯差異，中游段活性最強，其次為下游段；而連續暴露20 d TChE活性檢測結果發現：中游段TChE活性有不同程度的下降，下游段TChE活性持續增強。這表明田螺組織中的TChE活性在樂安河污染物及環境因子脅迫作用下在暴露初期呈現誘導作用，隨著暴露時間的延長TChE活性表現為抑制作用。

圖4 野外連續暴露10 d、20 d沉積物重金屬對中華圓田螺組織TChE活性的影響

2.3.2 MDA含量的響應 MDA含量變化情況如圖5所示。MDA(丙二醛)是細胞氧化脅迫及損傷的標志[13]，是反映生物膜脂質預氧化狀態，本次試驗中各監測點田螺體內MDA含量變化范圍：5.921～13.645 nmol/mgprot，上游段監測點0 d、10 d、20 d連續暴露過程中檢測結果差別并不明顯。從空間上來看，中游段的S4～S7 MDA含量處于較高水平，這與重金屬在沉積物中的含量分布規律保持一致；從時間上看，連續暴露10 d的田螺體內MDA含量最高，連續暴露20 d后MDA含量基本恢復到暴露前水平。由此可以看出田螺在此環境狀況脅迫下，組織內MDA變化在對重金屬含量情況做出響應，誘導作用明顯，變化規律為田螺組織內MDA含量對重金屬含量有正向響應機制，且響應迅速，隨著誘導時間的延續，MDA含量則表現為回落并趨于穩定狀態。

圖5 野外連續暴露10 d、20 d沉積物重金屬對中華圓田螺組織MDA含量的影響

2.3.3 GSH含量的響應 GSH(谷胱甘肽過氧化物酶)是機體分泌的一種特殊蛋白質[14]，是機體內廣泛存在的一種重要的過氧化物分解酶，使有毒的過氧化物還原成無毒的羥基化合物，從而保護細胞膜的結構及功能不受過氧化物的干擾及損害。本研究中不同暴露時間梯度下，各監測樣點中華圓田螺組織GSH含量如圖6所示。在上游段第一次采樣時田螺組織中GSH含量為1.348～1.566 mg/gprot，均值為1 428 mg/gprot。經過10 d、20 d的2個時間梯度的放樣發現上游段GSH含量均值分別為1.848 mg/gprot、0.885 mg/gprot。總體上看，上游監測點為河流源頭，3次實驗GSH含量波動不大，相對而言第2次采樣實驗GSH含量均值較高，分析其原因：GSH是一種參與多種外源性、內源性有毒物質結合生成減毒物質，生物體GSH變化的影響因素較多，可能由于期間持續降雨導致田螺生存環境改變使得機體敏感導致GSH變化。中游段10 d與20 d現場暴露實驗GSH含量均值分別為5.195 mg/gprot、1.504 mg/gprot，比較2個時間段，GSH含量先急劇上升后明顯下降，由于樂安河中游區域開始出現銅礦、采砂船等，水質開始渾濁，致使田螺出現應激反應，在此環境下GSH呈現顯著的誘導現象。隨著暴露過程的持續延長，田螺活性降低，甚至出現個別死亡現象，此時GSH敏感性降低。2次現場暴露實驗下游段GSH呈現出同樣的誘導規律，均值分別為3.368 mg/gprot、1.439 mg/gprot。從圖6中可明顯看出樂安河三段區域屬中游段GSH含量變化明顯，下游段相對而言變幅減小，由于上游未出現污染源且水質較好，在野外持續暴露實驗中GSH含量并未出現較大波動。

圖6 野外連續暴露10 d、20 d沉積物重金屬對中華圓田螺組織GSH含量的影響

2.3.4 SOD活性的響應 超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)是生物體系中抗氧化酶系的重要組成成員[15]。從圖7中可以看出，上游段0 d、10 d、20 d連續野外暴露實驗田螺組織中的SOD活性無明顯變化，而中游段及下游段各監測點田螺組織內SOD活性開始上升，由此可見，在無污染水質環境下田螺組織中SOD活性不受其他自然環境因素變化的影響。中游段受銅礦及采砂船的影響，SOD活性開始上升，而在下游段受銅礦、采砂船影響較小的范圍內SOD活性總體上升趨勢要高于中游段污染集中區，這可能由于輕度污染環境對SOD誘導作用較強，高濃度污染抑制了田螺組織中SOD的活性。從圖7中值得注意的是中游段2個時間梯度間SOD活性并未出現明顯差異，且在下游段連續暴露20 d的樣品中SOD活性持續增大。分析原因可能由于中游受污染相對較重，且為污染源頭，在一定濃度污染環境持續暴露中田螺組織中SOD活性達到某一閾值并維持穩態，而下游污染較輕的區域在低濃度污染因子誘導作用下SOD活性將持續上升。研究表明，田螺組織中的SOD活性在不同河段以及不同暴露時間段內均產生了一定的變化趨勢，但總體來說變化并不顯著，對污染因子反應不敏感。

圖7 野外連續暴露10 d、20 d沉積物重金屬對中華圓田螺組織SOD活性的影響

2.3.5 MT含量的響應 MT是一些低相對分子質量的、富含半胱氨酸和巰基、能夠結合金屬的蛋白或多肽[16]。MT具有很強的誘導性，當細胞內的Cu2+濃度增高時，機體組織內可誘導MT合成。本次研究中，樂安河野外暴露實驗環境因子對田螺機體MT誘導作用如圖8所示。此次研究中MT含量在1.461～10.215 μg/g變化，對MT的誘導作用非常顯著，主要表現在樂安河中游及下游區域。上游區域在3次監測實驗中MT含量較低，中游區域MT含量迅速上升，直至下游都呈現出誘導作用。由于在第4個監測點開始陸續出現排污口、采沙船等，且出現銅礦污染，中游監測點連續暴露10 d后螺體內MT含量最高，隨著暴露時間的延續，中游與下游螺體內MT含量呈現出持續高水平；較中游相比，下游誘導作用一定程度上低于中游監測點。在接下來的持續暴露中(連續暴露20 d)，污染物繼續進入螺螄體內，而中游監測點MT含量出現一個峰值后保持穩定；下游監測點螺螄體內MT含量呈持續誘導作用。本次試驗監測區域中游出現銅礦污染源且研究表明，MT具有調節微量元素(主要是Cu、Zn)儲存、運輸和代謝的作用，對重金屬具有解毒作用。因此，此次野外暴露實驗用螺螄組織內MT含量的變化情況能夠較好地反應出研究區域主要污染源的污染程度。

圖8 野外連續暴露10d、20d沉積物重金屬對中華圓田螺組織MT含量的影響

2.3.6 IBR指數分析 綜合生物標志物響應指數(the biological response indices，IBR)是一種綜合運用多種生物標志物定性評估生物對環境壓迫的響應指標，模型能夠綜合地反映環境狀況對生物的脅迫作用，同時又可直觀地體現各環境因子對總脅迫作用的貢獻率[17-18]。表示方法為：對生物標志物進行標準化處理，以各生物標志物標準化后數值繪制成星狀圖，通過將相鄰標志物的Ai值所圍成三角形的面積[(Ai+Ai+1)/2]依次相加即得到IBR值。由于IBR值與所選生物標志物指標數量(n)密切相關，將IBR值除以n以便于比較。

中下游8個點位田螺原位連續暴露10 d與20 d綜合生物標志物響應指數范圍分別為：6.092～15.922、6.226～8.19，其中較大的數值出現在連續暴露20 d后的S4～S7點位，且中游4個點位連續暴露20 d后IBR指數明顯大于連續暴露10 d后，這可能與重金屬分布有一定的關系，隨著暴露時間的延續，較高的重金屬含量對生物脅迫作用持續增強；而下游重金屬含量較低的區域環境因素對生物脅迫作用效果緩慢顯現。

第1次連續暴露10 d與第2次連續暴露20 d各標志物對IBR值貢獻率有明顯的不同，連續暴露10 d后各點位5個標志物對IBR值貢獻率無明顯差異，而連續暴露20 d后貢獻率有明顯差異。S4～S6點位中環境因素主要通過刺激螺體內MT含量與SOD活性反映其生物脅迫作用，MDA含量對IBR值貢獻較低；S8～S11點位中環境因素主要通過刺激螺體內MT含量與tCHE活性反映其對生物的脅迫作用，MDA含量與GSH活性對IBR值貢獻較低。IBR能整合系列標志物的響應值，反映監測區域的污染程度，并能作出早期預警。研究表明，IBR越大生物所受影響越大，在野外研究調查中可以直觀地反映不同地點、不同采樣時間的污染程度；在實驗室研究中可用于定量評價某種污染物不同劑量對生物體的毒理效應。因此本次以中華圓田螺為指示生物進行野外暴露試驗，其研究結果能夠較好地反映樂安河中下游區域生物污染變化情況。

黑線為暴露10 d；紅色為暴露20 d，其中S7點位暴露20 d樣品已丟失

2.4 酶活性脅迫因子

7種重金屬中除了Cd以外，均對底棲螺生物特性產生一定影響。從分析結果看，并非Gu對標志物脅迫作用最強，在連續暴露10 d和20 d后，沉積物中Cr和As對5種標志物的脅迫作用最明顯。TChE前期受Pb和Cr的影響活性上升，隨著暴露時間的延續，Ni元素對TChE活性產生抑制作用；MDA含量前期對Cr的響應明顯，后期Ni元素對其含量有促進作用。相對而言，影響螺組織內GSH含量、SOD活性以及MT含量的重金屬種類較多，GSH含量前期主要受Cr和As含量的影響，暴露后期受Gu、Zn和As的共同作用；SOD活性對Pb、Cr和As含量響應明顯，且暴露前期和后期脅迫因子一致；MT含量暴露前期與后期均受Gu、Zn和As的影響(表3)。由此可見，底棲螺生物標志物對沉積物重金屬含量的脅迫響應有較大差別，并非含量高就對標志物的脅迫作用強，每種生物標志物對生境的響應過程均是不同污染因子共同作用的結果。

表3 底棲螺生物標志物與重金屬含量相關性分析

3 結論

本文以樂安河沉積物重金屬為研究對象，通過野外采樣、原位實驗、實驗室分析等系統闡述了樂安河沉積物重金屬含量分布特征及其對底棲螺生物標志物的影響，主要結論如下。

1)自上游至下游采集11個沉積物樣品，重金屬的平均含量從大到小依次為：Cu>As>Pb>Zn>Ni>Cr>Cd，其中，Cu的含量空間差異性最大，其余6種重金屬中在11個點位中仍表現出一定的空間分異特征。

2)各種重金屬地累積指數均表現出不同程度的自上游向下游污染程度逐漸加重的趨勢。由于德興銅礦的影響，Gu污染下游S6～S11點位地累積指數為重度以上污染；Cd有3個點位(S1、S6、S8)為偏重度污染，其余5種重金屬在11個沉積物樣品中基本處于偏中度污染狀態。

3)原位暴露實驗中TChE、MDA、GSH、SOD以及MT等指標對沉積物重金屬的響應機制整體上為：中游>下游>上游；MT和TChE其活性(含量)隨著暴露時間的延長持續上升，MDA和 GSH活性(含量)響應過程表現為連續暴露10 d大于連續暴露20 d，SOD活性連續10 d和20 d暴露后無明顯差異。

4)7種重金屬中除了Cd以外，均對底棲螺生物特性產生一定影響。沉積物中Cr和As對5種標志物的脅迫作用最明顯。TChE主要受Pb、Cr以及Ni元素的影響；MDA含量前期對Cr的響應明顯，后期Ni元素對其含量有促進作用。相對而言，影響螺組織內GSH含量、SOD活性以及MT含量的重金屬種類較多。