高能重離子束誘變選育高蛋白含量雜交構樹

劉巧麗，吳照祥*，李彥強，李輝虎，劉 杰，周利斌，余發新

(1.江西省科學院生物資源研究所，330096，南昌；2.江西省科學院，330096，南昌；3.中國科學院近代物理研究所，730000，蘭州)

0 引言

構樹(Broussonetiapapyrifera)是一種蕁麻目?？频亩嗄晟淙~闊葉喬木，對環境條件具有十分良好的適應性，自然分布于我國大部分地區和東南亞各國，是一種典型的鄉土樹種和先鋒植物[1]。人類對構樹的開發利用具有悠久的歷史，根據利用部位的不同逐漸發展出了包括綠化、飼用、造紙和入藥等一系列的利用方式，可以說構樹渾身是寶[2]。構樹具有速生、適應性強、分布廣、易繁殖、熱量高、輪伐期短等優良特性，在生態、社會和經濟等方面發揮重要的價值[1]。雜交構樹是中國科學院植物研究所沈世華研究員在廣泛收集野生構樹種質資源的基礎上結合了常規育種和現代育種方式獲得的具有較高飼用價值的創新優質樹種。通過進一步觀察和研究發現，雜交構樹不僅繼承了野生構樹的諸多優良特性，還表現出了超出野生構樹的一些性狀特征，如葉片粗蛋白、粗脂肪以及鈣等含量顯著提高[3]。《中國飼料成分及營養價值表》顯示雜交構樹葉片多項飼用指標都顯著超過1級苜蓿，營養價值更高，是一種優良的飼料資源[4]。作為一種廣譜性飼料原料資源，雜交構樹可以應用于如豬、牛、羊等大型牲畜[5]，也可以應用于雞、鴨、兔等小型畜禽，甚至可以應用于龜、鱉、魚等水產養殖[6]。另外，雜交構樹具有對多種生物脅迫和非生物學脅迫的耐受性，還常被應用于廢棄地的生態治理或生態修復，包括廢棄礦山、尾礦以及石漠化山地等[7]。

隨著養殖業的蓬勃發展，雜交構樹產業也呈現出井噴的態勢，據不完全統計全國80%以上的省份不同程度地參與到雜交構樹種植和養殖產業鏈當中。雜交構樹的種植已從原來的四旁種植、散生種植發展到現在的規?；⒓s化基地種植[8]。然而，全國各地的雜交構樹種質退化嚴重，產量和質量都很難維持，加上國外多種飼料原料的滲透帶來的市場競爭加劇，都使得國內的雜交構樹產業發展難以為繼。雖然現有雜交構樹具有適應性強、生長快速等優良特點，但是其蛋白含量下降難以適應當前雜交構樹產業發展的基地化、集約化和規?；拇筅厔?，因此，亟待通過新興、高效的科學技術選育適應性更強、生長更快和蛋白含量更高的優良栽培品種，而作為飼料原料的重要用途其蛋白含量的提升是首選。

當前林木新品種選育主要包括3種方式，一是廣泛收集野生資源并從中選育，二是通過人工雜交從雜交后代中選育，三是針對木本植物通過芽變等方式選育[9]。雜交構樹是一種特殊的種質材料，因其本身就是一個雜交種，不適合常規的育種方法進行品種改良。重離子束作為一種先進的輻射誘變源，在農作物、林木及微生物育種的研究中得到了廣泛的應用，開辟了新的交叉學科領域[10]。重離子束輻射誘變因具有變異率高、變異譜寬、穩定周期相對較短、簡便易行且不受物種限制等優點而倍受青睞，重離子束誘變育種涉及的植物種類逐年遞增[11-12]。近年來，林木輻照誘變育種成果顯著[13-14]，表明了利用輻照誘變技術進行構樹選育是實際可行的。因此，本研究借助加速重離子對雜交構樹組培瓶苗進行輻照誘變處理，并篩選出高蛋白雜交構樹良種候選材料。通過平行栽培試驗進一步驗證高蛋白雜交構樹對貧瘠的適應性和粗蛋白積累能力，為該良種的推廣應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

雜交構樹組培瓶苗原種由中國科學院華南植物園吳國江研究員課題組提供。2017年6—12月期間，利用增殖培養基對雜交構樹組培瓶苗進行擴繁。

1.2 方法

1.2.1 組培瓶苗輻照處理 輻照誘變處理是在中國科學院近代物理研究所重離子研究裝置(Heavy Ion Research Facility in Lanzhou, HIRFL)生物輻照終端平臺上進行。2018年3月上旬將經擴繁的組培瓶苗連帶組培瓶一起裝入樣品臺，并用80 MeV/u的高能碳離子束對其進行輻照誘變處理，參照前人有關經濟林木輻照誘變的研究，設定中等濃度的輻照為40 Gy[15]，共輻照處理20瓶組培瓶苗，每瓶5株。

1.2.2 組培苗生根、煉苗及移栽 將重離子輻照處理的雜交構樹組培瓶苗和對照轉接至生根培養基，待生根后轉移至煉苗基質(蛭石:珍珠巖:草炭=1:1:1)，溫室中煉苗30 d后移出，讓幼苗在自然條件下生長，30 d后摘取葉片，經烘干、粉碎和消解等步驟測定其粗蛋白濃度。

1.2.3 高蛋白含量雜交構樹擴繁與栽培 為了快速獲得雜交構樹種苗材料，采用根繁的方式進行種苗培育。根據粗蛋白濃度測定結果，選擇粗蛋白濃度最高的組培誘變植株(Irradiation mutagenesis，IM)以及未輻照處理組培苗(CK)為母株，2018年12月將其側根(半徑>1 cm)剪為3～5 cm的根段，直立插入塑料拱棚內的沙床中，澆足水分并保溫，進行根繁育苗獲得無性系幼苗。2019年4月，選擇長勢一致的突變株無性系幼苗及對照，進行模擬盆栽試驗，栽培基質基本理化性狀見表1。模擬盆栽試驗在江西省科學院人工氣候室內進行，光照強度700 μmol photons·m-2·s-1，設置16 h光照(25 ℃)和8 h黑暗(20 ℃)，相對濕度控制在70%，植物生長45 d后收獲。收獲前1 d通過稱重法測定植物單日耗水量。收獲時，先測定株高和葉片數，然后將植株分解為葉片、莖干和根系3個部分，取同位葉進行葉綠素濃度測定，將根系最大長度計為根長，洗凈、干燥后測定其生物量。然后將葉片和莖干混合為地上部，再對植株地上部和根系粗蛋白濃度進行測定。

表1 雜交構樹栽培基質理化特性

1.2.4 葉綠素及粗蛋白含量的測定 葉綠素a、葉綠素b和總葉綠素含量采用二甲基亞砜提取法測定，并以每克鮮重含有葉綠素的毫克數(mg·g-1)表示。植株地上部和根系洗凈、烘干后粉碎備用，采用凱氏定氮法測定粗蛋白濃度。

1.3 數據分析

利用Microsoft Excel 2010軟件對數據進行處理和圖表繪制。統計分析采用SPSS18.0軟件進行，顯著性檢驗采用單因素方差分析方法(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 輻照誘變對雜交構樹粗蛋白濃度的影響

輻照處理的雜交構樹瓶苗經過生根、煉苗和移栽，最終獲得了60株組培苗。對這60株組培苗及對照樣品葉片粗蛋白濃度進行測定，結果發現其粗蛋白濃度為11.88%～37.94%(干重計)，平均為24.08%，高于未輻照的對照處理。分析還發現，輻照處理多數是促進雜交構樹葉片粗蛋白的積累，粗蛋白濃度在對照線以上的組培苗數量(51)遠多于對照線下的(9)。

2.2 高蛋白含量雜交構樹生長情況

2.2.1 形態特征和日耗水量 高蛋白含量雜交構樹的葉片數、株高及根長均顯著高于對照組(P<0.05)，且株高差異程度較大，提升幅度達50%。另外，通過稱重法測定發現，高蛋白含量雜交構樹突變株日耗水量達到36.37 g，顯著高于對照處理的34.37 g。

2.2.2 生物量積累 不論是高蛋白含量雜交構樹突變株還是對照材料，雜交構樹生物量(以干重計)分布都表現出葉片>根系>莖干，葉片干重約為莖干的2.49倍，占到莖葉總干重的70%以上。與對照處理相比較，高蛋白含量雜交構樹突變株的葉片、莖干和根系生物量都顯著增加，并且根系生物量差異達到極顯著水平(P<0.01)。

2.2.3 粗蛋白含量 測定結果表明，FT和CK均呈現出地上部分粗蛋白濃度(以干重計)顯著高于根系(P<0.05)。高蛋白含量雜交構樹突變株地上部和根系粗蛋白濃度都顯著高于對照(P<0.05)，分別提高25.54%和12.67%(圖3)。相對于植物地上部而言，高蛋白含量雜交構樹突變株根系粗蛋白增加的幅度更明顯。

圖3 高蛋白含量雜交構樹粗蛋白濃度

2.2.4 葉綠素含量 進一步對植物葉片葉綠素含量進行測定，結果發現高蛋白含量雜交構樹突變株葉片葉綠素a、葉綠素b和總葉綠素含量都顯著高于對照材料，其中葉綠素b含量差異達到極極顯著水平(P<0.001)，而總葉綠素含量差異達到極顯著水平(P<0.01)(圖4)。

圖4 高蛋白含量雜交構樹葉綠素含量

3 討論

以雜交構樹組培瓶苗為試驗材料，本研究采用40 Gy的高能碳離子束進行誘變處理，通過篩選得到一批高蛋白雜交構樹候選材料，其中葉片粗蛋白濃度最大提升幅度達到77.24%。選擇葉片粗蛋白濃度最高的候選植株進行擴繁和平行栽培試驗驗證了其貧瘠適應性和粗蛋白積累能力。

輻射生物學發展至今已有近百年的歷史，與常規的x、γ和中子等中性粒子相比，重離子束屬于高傳能線密度(Linear energy transfer，LET)輻射，可在單位路徑上沉積更高的能量，從而引發復雜的且難以修復的遺傳損傷，因此其相對生物學效應較高。因其獨特的物理學和生物學特性，重離子束在生物誘變育種實踐中表現出變異率高、變異譜寬、變異快、穩定周期短等優點[16]。因此近年來，重離子束誘變育種在國內蓬勃發展，多家科研機構育種成果顯著[17-18]。前人關于重離子誘變育種方面的研究主要集中于輻照當代生物學效應，包括存活率、幼苗長勢、植株高度、結實率等，也有引發種子育性方面的研究[19]。隨著育種進程的推進，重離子誘導經濟作物質量方面的研究必將得到極大程度的關注，頡紅梅[20]等對豆科和禾本科的牧草種子進行了20Ne10+離子束貫穿處理，篩選出了葉片變厚、葉色深綠、生長勢增強的禾本科牧草新株系。以雜交構樹組培瓶苗為試驗材料，本研究初步探討了中低劑量加速重離子對作物質量的影響，進一步驗證了利用重離子誘變提升經濟作物質量的可能，并且重離子誘導的質量改善誘變顯著高于惡化誘變(圖1)。

圖1 輻照處理雜交構樹組培苗粗蛋白濃度

通過高蛋白含量雜交構樹候選材料的平行栽培試驗，發現該材料不僅地上部粗蛋白含量顯著高于對照材料，其生長指標(圖2)和形態學指標(表2)均顯著高于對照，表明重離子誘變導致了雜交構樹的生物學產量和綜合產量的雙提高。前人研究發現重離子誘變引發的作物產量和質量的提升與光合作用的增加關系密切[20-21]，本研究也發現了相似的結果，高蛋白含量雜交構樹葉片葉綠素濃度顯著高于對照材料(圖4)。本研究還發現高蛋白含量雜交構樹的根系更加發達(表2)，猜測根系吸收更多的營養物質供給植物生長以及代謝作用，因為根系是植物吸收養分的主要結構[22]。從汲取營養來說，根越深越龐大，獲取的營養物質和水分越多，這樣需要更多葉光合作用合成有機物。相反，葉多需要更多的營養物質和水。因此，植物地上部分和地下部分的生長與發育存在著相互依賴，相互促進和相互制約的關系，這也很好地印證了生態學上的庫源學說理論。高蛋白含量雜交構樹平行栽培試驗中粗蛋白濃度顯著低于初篩(圖1和圖3)，可能是以下3個方面的原因造成，一是2次測定所采用的部位不完全一致，一般來說植物莖干中粗蛋白濃度顯著低于葉片，雜交構樹也是如此[23]；二是植物生長時間的不一致，植物粗蛋白的合成與積累是一個不連續的過程[24]；三是2次試驗所采用的栽培基質養分含量差異明顯，非豆科植物氮素主要是通過根系從基質中獲取?；谝陨先c，土壤養分的供給以及收獲頻次都顯著影響該高蛋白含量雜交構樹材料的品質，所以需要加強這個方面的研究工作。

表2 高蛋白含量雜交構樹形態特征及日耗水量

圖2 高蛋白含量雜交構樹生物量積累

誘變育種的根本是提高自然變異頻率，積累遺傳變異，從而創造新種質，它是解決常規育種中某些特殊問題和培育新品種的重要方法之一。本研究僅對高蛋白含量雜交構樹突變株的生長和部分生理進行了初探，尚未將研究內容深入到DNA水平，有待進一步開展研究。在植物育種領域，重離子束可以誘發不同類型的DNA突變類型，但是中低濃度輻照劑量主要引發點突變和小片段的插入缺失[25-26]，本研究中高蛋白雜交構樹突變株突變類型的確定有助于更加精確地解讀蛋白質合成與積累分子機理，也將助推重離子輻照誘變育種的快速發展，這是下一步工作的重點。