右旋檸檬烯對雙酚A影響下人源乳腺癌MDA-MB-231裸鼠移植瘤生長及腸道菌群的影響

陳雨然，伍慶華，羅 琪，羅黎明，彭雨蒙，曾艷清，徐 磊，李龍雪，洪 滔，劉志勇

(江西中醫藥大學，330004，南昌)

0 引言

乳腺癌2020年乳腺癌病例數達226萬人，首次超過肺癌，約占新發癌癥病例的11.7%，已成為威脅女性健康的重大公共衛生問題[1-2]，在乳腺癌的發病原因中，外源雌激素的作用不可小覷，Epstein[3]等證實了雌激素可以直接或間接地刺激人乳腺癌細胞的增殖，促進嚙齒類動物乳腺癌的發生。雙酚A(bisphenol A，BPA)是一種具有外源性擬雌激素樣作用的雙酚類化合物(bisphenols)[4]，與乳腺癌的發生有一定關系，研究發現雙酚A通過雌激素相關受體γ促進三陰性乳腺癌細胞的遷移和侵襲[5]，其中的三陰性乳腺癌由于早期和術后的主要治療方法單一[6]，患者的臨床結局較差[7-8]更值得研究，嘗試篩選來自芳香藥食兩用中藥材中的右旋檸檬烯來拮抗外源雌激素導致的腫瘤增長，選擇三陰性乳腺癌細胞MDA-MB-231，觀察環境雌激素雙酚A影響下，右旋檸檬烯作用于MDA-MB-231細胞的增殖及荷MDA-MB-231乳腺癌裸鼠的腸道微生物生物多樣性變化，為開發新型抗三陰性乳腺癌藥物奠定基礎，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器

CO2恒溫培養箱(MCO-18AC，Panasonic)，超凈工作臺(SW-CJ-1FD，蘇凈安泰)，XDS-18生物倒置顯微鏡(重慶水電儀器總公司)，DM0412離心機(DLAB)，滬02270113血球計數板(上海求精生化)，注射器(南昌進賢3L醫療)。

1.2 試劑

HL15(Hyclone, SH300048.01)，胎牛血清(Fetal Bovine Serum)(S601S-500，Sera&Pro)，胰酶Trypsin(0457，Amresco)，PBS(SH30256.01，Hyclone)，Matrigel(356234，BD)，β-Estradiol(E8875，Sigma)。

1.3 實驗動物

5周齡雌性Balb/c-nu/nu小鼠30只，湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，生產許可證號為SCXK(湘)：2019-0004。隨機分成右旋檸檬烯低劑量+雙酚A，右旋檸檬烯中劑量+雙酚A，右旋檸檬烯高劑量+雙酚A，雙酚A 組和腫瘤組。

1.4 受試藥品及配制方法

右旋檸檬烯,由本實驗室從興國九山生姜提取純化。準確吸取藥物100 μL(低劑量)、200 μL(中劑量)、400 μL(高劑量)，滴加PEG-400定容至2 mL。雙酚A配制，準確稱取2.7 mg，40 μL DMSO溶解后，滴加環糊精溶液(2-羥丙基-β-環糊精，0.3 g/mL)，稀釋定容至13.5 mL，0.2 mg/mL。

1.5 方法

1.5.1 人源乳腺癌 MDA-MB-231細胞培養 人源三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞于含10% 胎牛血清的RPMI 1640培養液中，收集指數生長期的細胞，無血清HL15重懸至適合密度(5×107/mL，1:1添加Matrigel)用于接種小鼠皮下腫瘤接種。

1.5.2 腫瘤細胞的接種 裸鼠每只按200 μL的量于右前肢側腋下接種1×107MDA-MB-231細胞，接種后定期觀察裸鼠生長情況和腫瘤生成情況，待皮下接種處腫瘤生長至平均體積100 mm3時，根據所荷腫瘤大小和小鼠體重按1.5.3方法隨機進行分組，并給予相應藥物。

1.5.3 隨機分組 由于腫瘤體積大小會影響藥物治療的有效性作出判定，所以采取Excel幫助的隨機分組設計的方法，即將鼠所荷腫瘤體積的值輸入Excel表中進行分組，以保證不同組別間的腫瘤體積的差異盡可能小。在給藥治療前，稱體重，并用游標卡尺測量荷瘤鼠的腫瘤體積。

1.5.4 雌激素干預 細胞接種前1天開始(接種當天不干預)，每天定時于小鼠瘤旁(右前肢腋下)皮下注射β-雌二醇溶液100 μL(β-雌二醇0.6 mg/mL)。

1.5.5 給藥 分組當天按照實驗設計方案開始給藥。

1.5.6 實驗觀察和數據收集 MDA-MB-231細胞接種腋下后，觀察裸鼠生長及藥物治療對實驗鼠日常行為的影響，包括荷瘤裸鼠的活動狀況、攝食和飲水情況、體重變化、眼睛、口鼻、裸鼠整體外觀及其它是否有異常情況，及時記錄觀察到的臨床表現。口服右旋檸檬烯后，每周2次用游標卡尺對乳腺癌腫瘤的的長徑(L)和短徑(D)進行測量，腫瘤體積(mm3)= 1/2 ×(腫瘤長徑 × 腫瘤短徑2)。

1.5.7 實驗終止和腫瘤標本收集 末次給藥后24 h終止喂養實驗，麻醉小鼠后對荷瘤狀況及離體瘤塊進行拍照，對腫瘤進行稱重，并計算腫瘤抑制率 =(模型組瘤重均值-實驗組瘤重均值)/模型組瘤重均值 ×100%)，腫瘤組織隨后保存于-80 ℃冰箱；糞便采集，小鼠處死后取結腸內糞便裝凍存管立即液氮保存，后轉移-80 ℃冰箱。

1.6 糞便基因組DNA的獲取和擴增

對糞便基因組DNA采用 SDS 方法進行提取，提純的DNA的純度和濃度用瓊脂糖凝膠電泳檢測，符合要求的樣本DNA以無菌水稀釋至1 ng/μL，并以此為模板，基于測序區域的選擇，用帶 Barcode 的引物，新英格蘭生物技術公司的PCR混合體系和高效高保真酶進行PCR，引物為16S V4區(515F和806R)。PCR產物用瓊脂糖凝膠(2%)進行電泳檢測，依據PCR產物濃度進行等量混樣，再次檢測PCR產物，目的條帶回收產物后使用TruSeq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫試劑盒構建文庫，獲得文庫經過Qubit和Q-PCR定量合格后，NovaSeq6000進行測序。

1.7 測序后下機數據的處理

測序后下機數據根據Barcode和PCR擴增引物序列拆分各樣本結果數據，截去引物序列后對每個樣本的reads進行FLASH(V1.2.7，http://ccb.jhu.edu/software/FLASH/)拼接，得到Tags數據(Raw Tags)，并經嚴格的過濾處理得到高質量的Clean Tags。參照Qiime(V1.9.1，http://qiime.org/scripts/split_libraries_fastq.html)的Tags質量控制流程，進一步篩掉小于Tags長度75%的Tags，通過與物種注釋數據庫(https://github.com/torognes/vsearch/)進行比對，最終去除嵌合體序列獲得有效數據(Effective Tags)。

1.8 樣本復雜度分析(Alpha Diversity)

物種多樣性通過使用Qiime軟件(Version 1.9.1)計算，Alpha多樣性指數組間差異分析應用R軟件進行分析，差異分析采用wilcox進行檢驗。

1.9 菌群物種的相對豐度展示

對OTU進行菌群物種分類，并分別在門、綱、目、科、屬、種幾個分類等級對各個樣品做物種豐度柱狀圖，就可以直觀看出不同物種在每個樣品中所占的比例，選取每個分組在門水平和屬水平上豐度排名前十的物種，生成菌群物種相對豐度柱形累加圖，比較各樣本在相應分類水平上，物種豐度較高的菌群和它們的比例。

1.10 物種豐度聚類熱圖

以顏色的深淺梯度來代表數據矩陣中數值的大小和物種、樣品中豐度相似性進行聚類的Heatmap，加上樣品的處理信息，可以直觀觀察到相同處理的聚類情況，并能直接反映樣品的群落組成的相似性和差異性。本分析根據豐度排名前35的屬，結合每個樣本中的豐度和注釋信息構建Heatmap，從物種和樣本2個層面進行聚類分析。

2 實驗結果

2.1 腫瘤的抑制情況

荷瘤鼠腫瘤體積逐漸增加，其中雙酚A 組的腫瘤體積增加始終高于對照組和右旋檸檬烯各組，右旋檸檬烯給藥后隨劑量的增加，腫瘤體積減小，高劑量組與對照組、雙酚A 組比較，具有顯著性差異(P<0.01)。

圖1 右旋檸檬烯對雙酚A環境下荷MDA-MB-231乳腺癌腫瘤裸小鼠腫瘤體積的影響

圖2 右旋檸檬烯對雙酚A環境下荷MDA-MB-231乳腺癌腫瘤裸小鼠瘤重的影響

2.2 樣本復雜度分析(Alpha Diversity)

Chao指數和Ace指數是生態統計學中用來估計群落中含OTU數目的2種指數。Chao指數和Ace指數越高，表明樣本中的菌類總數越多。由圖3可知，接種腫瘤后細菌種類下降，右旋檸檬烯治療后腸道菌群種類增加。

D組為右旋檸檬烯低劑量組，E組為右旋檸檬烯中劑量組，F組為右旋檸檬烯高劑量組，G組為雙酚A組，H組為對照組，下同。

Shannon、Simpson可以用來表示群落豐度的情況，Shannon指數越大，代表生物樣本的菌落多樣性越高；反之Simpson指數越大，代表群落多樣性越低(圖4)。結合2種指數可以看出，荷瘤裸鼠腸道群落豐度下降，雙酚A及同時給與右旋檸檬烯后群落豐度有所增加。

圖4 荷瘤小鼠及右旋檸檬烯治療后Shannon指數和Simpson指數

2.3 基于OTU的Venn圖

根據不同樣本(組)之間共有、特有的OTUs聚類，得到OTUs韋恩結果圖，可見其中5個組共同擁有的OTU為269個(圖5)，5個相關處理組各自特有的OUT情況為D組(右旋檸檬烯低劑量組)為38個，E組(右旋檸檬烯中劑量組)占37個，F組(右旋檸檬烯高劑量組)占342個，G組(雙酚A組)占205個，H組(對照組)為37個。

每個橢圓形代表一個樣本處理組，橢圓形和橢圓形重合部位的數字代表各實驗組之間共有的OTUs個數，無重合部位的值代表各組的特有的OTUs個數。

2.4 物種相對豐度展示

以門水平物種相對豐度柱形圖為例展示如圖6，對食用右旋檸檬烯后的小鼠腸道細菌進小鼠腸道糞便中共檢測到10個菌門，包括擬桿菌門Bacteroidet、疣微菌門Verrucomicrobiota、芽孢桿菌Bacilli、厚壁菌門Firmicutes、γ變形菌門Gammaproteobacteria、彎曲桿菌門Campylobacteria、放線菌門Actinobacteriota、α變形菌門Alphaproteobacteria、放線菌門Coriobacteria。5組糞便樣品中所含的細菌門中擬桿菌門Bacteroidet、疣微菌門Verrucomicrobiota、芽孢桿菌Bacilli、厚壁菌門Firmicutes占到了總細菌的75%以上，右旋檸檬烯中高劑量組疣微菌門菌verrucomicrobiota豐度較雙酚A 組和對照組的明顯增多，而擬桿菌門Bacteroidet豐度較雙酚A 組和對照組的明顯減少。

圖6 荷瘤小鼠及右旋檸檬烯治療后門水平腸道菌群物種相對豐度柱形圖

以屬分類水平進一步分析裸鼠糞便樣品中腸道細菌群落的結構，發現采集的樣品(直腸糞便)中共涉及來源于10個屬的細菌群落，見圖7。其中擬桿菌屬Bacteroides、異戊酸桿菌Alloprevotella、阿克曼氏菌Akkermansia、乳桿菌Lactobacillus、螺桿菌屬Helicobacter、毛螺旋菌屬Parasutterella、Erysipelatoclos屬、脲原體菌Ureaplasma、毛螺菌科NK4A136組Lachnospiraceae_NK4A136和未注釋菌屬Others。與對照組相比，雙酚A及右旋檸檬烯處理組擬桿菌屬Bacteroides、異戊酸桿菌Alloprevotella、阿克曼氏菌Akkermansia、乳桿菌Lactobacillus、螺桿菌屬Helicobacter、毛螺旋菌屬Parasutterella差異較大，但未達到顯著性意義。

圖7 荷瘤小鼠及右旋檸檬烯治療后屬水平腸道菌群物種相對豐度柱形圖

2.5 菌類物種的豐度聚類Heatmap圖

根據各組的屬分類水平的物種豐度和相關注釋信息，選取菌類豐度排名前30的屬，繪制成Heatmap熱圖8。

圖8 荷瘤小鼠及右旋檸檬烯治療后腸道菌群物種豐度聚類熱圖

3 討論

一些藥食兩用類藥材可能具有新穎的抗腫瘤作用機制且副作用小。例如生姜在之前的研究中發現具有很好的消炎抗腫瘤作用，為三陰性乳腺癌治療藥食兩用類藥物的開發提供了可能性[9-11]。

腸道菌群通過與宿主形成微生態系統密切影響著宿主的生理病理過程，近年來腸道菌群與腫瘤關系的研究得到了關注，Goedert[12]等提取48例絕經后乳腺癌患者與健康絕經后婦女糞便中腸道菌群DNA，經illumina 測序和16S rRNA基因分類發現，絕經后乳腺癌患者糞便中腸道菌群的多樣性和組成差異少，腸道菌群中Clostridiaceae(梭菌)，Faecalibacterium(糞桿菌屬)，Ruminococcaceae(瘤胃菌科)的豐度明顯增高，Dorea(多爾氏菌科)和Lachnospiraceae(毛螺菌科)的豐度則降低。其中α-多樣性和β-多樣性發生了大幅度下降。實驗發現經右旋檸檬烯治療的毛螺菌科NK4A136組Lachnospiraceae_NK4A136與對照和雙酚A 組比較有所增加，由于腸道菌群的不同組成導致個體間的抗腫瘤免疫的差異可能是主要環境因素，這種腸道菌群的不同可能影響全身免疫，進而通過調控宿主免疫影響腫瘤免疫治療的效果及毒副反應，干預腸道菌群(如益生菌、糞菌移植等方法)，有望成為輔助腫瘤免疫治療的重要手段。