根瘤菌拌種對兩種苜蓿生長及根際微生物多樣性的影響

趙陽安， 蘆光新*， 鄧 曄， 王英成， 馬 坤， 顏琿璘， 張海娟， 周學麗， 竇聲云

(1. 青海大學農牧學院， 青海 西寧 810016；2. 中國科學院生態環境研究中心, 北京 100080；3. 青海省草原改良試驗站， 青海 共和 813000)

紫花苜蓿(Medicagosativa)作為“牧草之王”，具有適應性廣、營養價值高、適口性好等優良特點[1],在我國種植面積逾400萬hm2[2]，是我國畜牧業發展不可缺少的飼料作物之一。在高寒地區栽培過程中，由于地區環境及春化作用，導致紫花苜蓿種植地大寒大旱，苜蓿越冬率低，品質與適應性表現良莠不齊[3]，嚴重影響著高寒地區苜蓿種植的品質與產量。

針對高寒地區種植苜蓿不抗寒、越冬率低的狀況，開展苜蓿在高寒地區的適應性研究，成為了高寒地區的研究熱點。近年來，相關學者從植株各個角度對苜蓿在高寒地區的適應性進行研究，其中固氮根瘤共生體研究最多，而對于生物肥料的研究相對較少，生物肥料作為一類含有大量微生物的特殊肥料，在施入土壤中時，大量微生物在適宜條件下能夠積極活動，有的可在作物根的周圍大量繁殖，發揮自生固氮或聯合固氮作用[4]，有的還可分解磷、鉀礦質元素供給作物吸收或分泌生長激素刺激作物生長[5]。根瘤菌肥料作為生物肥料中豆科植物專用肥，施入土壤可以誘導豆科植物形成根瘤，不僅能大量形成共生固氮類菌體，還能分泌植物生長激素，促進植物生長[6-7]。大量研究證實，施用根瘤菌菌劑可增加紫花苜蓿的結瘤數，固定游離氮，提高紫花苜蓿的結瘤固氮效率，培肥地力、改善土壤團粒結構以及牧草品質[8-9]。相關研究[10-11]發現，紫花苜蓿接種根瘤菌可有效促進結瘤，提高紫花苜蓿的產量和品質。Agnello等[12]的研究發現種植苜蓿能夠有效提高根際細菌活性。耿德洲等[13]采用高通量測序技術發現，與農田相比，貧營養型細菌類群酸桿菌門豐度在苜蓿土壤中有所增加，而富營養型細菌類群變形菌門則減少。土壤微生物是土壤生態系統的重要組成部分，其群落結構的多樣性可以反映出生態環境的功能演變及其環境影響[9，14]。由于根系的穿插，使根際的通氣條件和水分狀況優于根際外，從而形成利于微生物的生態環境。以上研究均表明施肥、接種會對苜蓿產量、品質以及土壤微生物造成一定影響。

因此，本研究于環青海湖地區的青海省草原改良試驗站進行實驗小區田間試驗，利用田間觀測和高通量測序技術方法對兩種苜蓿生長狀況和土壤根際微生物進行研究，分析在不同拌種根瘤菌條件下環青海湖地區兩種苜蓿生長及根際土壤微生物的變化規律，探討兩種苜蓿生長及根際微生物多樣性與拌種根瘤菌劑量間的相互關系，旨在明確微生物肥料對土壤生態環境的影響，為苜蓿改良土壤和草牧業的可持續發展提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 研究區概況

研究區位于青海湖西岸的青海省草原改良試驗站，即共和縣石乃亥鄉境內，屬三州三縣三鄉(鎮)地域交界之地，距青海湖約11 km，位于東徑99°35′，北緯37°05′，平均海拔3 270 m。該地區氣溫低、晝夜溫差大、降雨少而集中、日照長、太陽輻射強[15-16]，年平均氣溫-0.7℃，年降水量368.11 mm，年蒸發量1 495.3 mm，相對濕度58%。

1.2 試驗設計與樣品采集

1.2.1試驗設計 試驗采用隨機區組排列，在青海省草原改良試驗站布置3 m×5 m實驗小區，小區間距1 m。按0.067 ha 0 g，25 g，50 g，75 g根瘤菌菌肥劑量設計0，25%，50%，75% 4個拌種濃度梯度，3次重復，共設24個小區。

苜蓿品種選用北京林業大學的‘北林201’紫花苜蓿(Medicagosativa‘Beilin201’)和‘北林202’紫花苜蓿(Medicagosativa‘Beilin202’)。拌種所用根瘤菌劑選自四川省川草生態科技開發有限責任公司提供的25 kg·袋-1規模的固氮根瘤菌劑。于2020年6月15日按2 000 g·(0.067 ha)-1種子播種，播種前將根瘤菌劑與苜蓿種子按0 g·(0.067 ha)-1,25 g·(0.067 ha)-1,50 g·(0.067 ha)-1,75 g·(0.067 ha)-1的比例充分混合，使每個種子表面都均勻黏上菌液，在陰涼處晾干，12小時內播種，播種時每隔20 cm開溝5 cm深，將拌種均勻的撒入溝中，覆蓋并踩實。

1.2.2樣品采集 于2020年9月11日，對各小區植被生長狀況進行觀測并對長勢均勻區域進行隨機取樣，利用鐵鏟大范圍的鏟出完整苜蓿根，抖落根系大塊土壤板結，收集附于根上0～5 mm的土壤作為根際土[17]，立即裝入無菌密封袋，低溫運回實驗室，于-80℃冰箱保存，用于微生物分析。

1.3 測定指標及方法

1.3.1苜蓿生長速率測定 從7月19日開始，每10 d隨機選取10株測量株高并取均值(測5次)，相隔兩次的值來計算其相對生長速率。

其中P為測量的株高，而n是相隔10 d后的測量次數。通常株高指自然高度，最后換算為cm。

1.3.2生物量的測定 在苜蓿生長期每隔10 d在每個小區內密度、長勢均勻的地方，隨機選擇十株，采用刈割法，齊地面剪取植物地上部分，裝在信封袋中帶回實驗室，105℃殺青2 h，在65℃下于鼓風干燥箱烘至質量恒定，測定干重，作為地上生物量的指標。

1.3.3土壤微生物的測定 將保存于-80℃的土壤樣品，根據MOBIO土壤強力DNA提取試劑盒(MOBIO Laboratories,Carlsbad,CA,美國)說明書從0.25 g土壤中提取總DNA，16S rRNA用V3-V4區的通用引物515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWT-CTAAT-3′)擴增，基于Illumina Miseq測序平臺進行高通量測序。測序委托深圳美格基因公司進行測序。

1.4 數據處理與統計檢驗

利用Galaxy分析平臺(http://mem.rcees.ac.cn:8080/)整理微生物測序的原始數據[18-19]。使用UPARSE[20]將序列聚類為可操作的分類單元(OTU)，序列相似度閾值為97%，獲得OTU表進行后續的微生物多樣性分析。韋恩圖應用Draw Venn繪制平臺(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)進行制作，其他圖均利用Origin 2019制作。

2 結果與分析

2.1 兩種苜蓿株高和生長速率差異分析

對不同拌種濃度梯度下兩種苜蓿株高分析發現(圖1)，兩種苜蓿株高隨著拌種濃度的增加呈現先上升后下降趨勢，即在拌種濃度梯度達到50%后，兩種苜蓿株高發生降低趨勢；‘北林201’苜蓿株高達到了12.47 cm，‘北林202’苜蓿則為13.43 cm；拌種對‘北林202’苜蓿的作用高于‘北林201’苜蓿。

圖1 兩種苜蓿株高Fig.1 Two kinds of alfalfa plant heights注：A代表‘北林201’，B代表‘北林202’；1，2，3，4分別代表拌拌種梯度0，25%，50%和75%；不同小寫字母表示各處理間的顯著差異性(P<0.05)。下同Note:A stands for ‘Beilin 201’,and B stands for ‘Beilin 202’;1,2,3 and 4 represent the fertilizer gradient 0,25%,50% and 75%,respectively;Different lowercase letters indicate significant differences between treatments at the 0.05 level. The same as below

兩種苜蓿生長速率繪制的生長曲線如圖2所示，在四個拌種濃度梯度下‘北林201’苜蓿的生長速率分別是0.237，0.225，0.255，0.238；‘北林202’苜蓿的生長速率分別是0.258，0.268，0.273和0.243。在拌種梯度為50%的條件下，‘北林201’苜蓿和‘北林202’苜蓿生長率均為最高,并且‘北林202’苜蓿生長速率比‘北林201’苜蓿生長速率增加了1.8%。

圖2 兩種苜蓿梯度生長曲線分析Fig.2 Tow kinds of alfalfa gradient growth curve注：RGR代表生長速率，簡寫為RNote:RGR stands for growth rate,abbreviated as R

2.2 兩種苜蓿地上生物量分析

通過對兩種苜蓿地上生物量差異分析，發現對于‘北林201’，不拌種處理的苜蓿生物量顯著高于拌種處理(P<0.05)，并且隨著拌種劑量的增加，‘北林201’的生物量呈降低趨勢。而對于‘北林202’苜蓿，25%的拌種濃度增加了苜蓿的生物量，但是當拌種濃度為50%和75%時，苜蓿的生物量并沒有增加(圖3)，‘北林202’苜蓿生物量表現出先增加后降低的趨勢，但是差異性不顯著。

圖3 不同拌拌種劑量下的兩種苜蓿地上生物量圖Fig.3 Yield of two kinds of alfalfa under different dosages of bacterial fertilizer

2.3 兩種苜蓿根際群落分析

2.3.1兩種苜蓿根際細菌群落多樣性分析 48個土壤樣本共獲得620多萬條高質量細菌16S rRNA基因序列，由于各樣本序列差異較大，將所有的樣本統一到相同的總Reads數量(34 541)對每個樣本進行隨機重抽，對樣本不同處理之間的OTU進行比較，利用韋恩圖說明兩種苜蓿在不同拌種處理下獨有和共有的OTU數，并將其可視化(圖4)。其中，對于‘北林201’苜蓿，四個拌種濃度梯度處理共有的OTU有18個，而不拌種處理的OTU數明顯高于拌種處理，高出242個OTU，四個拌種濃度梯度獨有的OTU分別有1 332，1 115，1 018，1 140個。對于‘北林202’苜蓿，四個拌種梯度共有的OTU數是8個，與‘北林201’不同的是，‘北林202’在75%濃度梯度下獨有的OTU數最多，為1 258個(圖4)。

圖4 兩種苜蓿根際土壤韋恩圖Fig.4 Venn diagram of two alfalfa rhizosphere soils

應用辛普森指數(Inv_Simpson)、豐富度指數(Observed_richness)來表征苜蓿土壤細菌的α多樣性。由圖5-A可知，拌種處理后有增加‘北林201’苜蓿的辛普森指數(Inv_Simpson)趨勢，但差異不顯著，且在拌種劑量為50%時出現最高；而豐富度指數(Observed_richness)則是隨著拌種梯度的增加逐漸下降。表明拌種處理增加了‘北林201’紫花苜蓿根際土壤的物種多樣性卻減少了物種豐富度。

圖5 兩種苜蓿樣品土壤α多樣性Fig.5 Two kinds of alfalfa Sample soil alpha diversity注：Inv_Simpson表示辛普森指數，Observed_richness表示豐富度指數Note:Inv_Simpson represents the Simpson index,and Observed_richness represents the richness index

對于‘北林202’苜蓿，其辛普森指數(Inv_Simpson)、豐富度指數(Observed_richness)均在拌種25%梯度時下降，在拌種50%上升，之后在75%梯度時再次下降，表現出先下降再上升后降低的趨勢；但是在拌種50%情況下，其辛普森指數(Inv_Simpson)明顯高于不拌種處理而豐富度指數(Observed_richness)低于不拌種處理(P<0.05)。同樣說明拌種處理增加了‘北林202’紫花苜蓿根際土壤的物種多樣性卻減少了物種豐富度。

2.3.2兩種苜蓿根際細菌群落組成分析 本研究兩種苜蓿所有的樣本共檢測到44門784屬，在門水平上，兩種苜蓿的優勢菌門均為變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、酸桿菌門(Acidobacteria)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)。對于‘北林201’，拌種處理增加了變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、綠彎菌門(Chloroflexi)的相對豐度，分別增加了6.82%，15.93%，31.55%，降低了放線菌門(Actinobacteria)和酸桿菌門(Acidobacteria)的相對豐度，分別降低了31.79%，18.67%。‘北林202’苜蓿拌種處理與不拌種處理相比，拌種增加了9.16%的放線菌門(Actinobacteria)和10.72%的厚壁菌門(Firmicutes)的相對豐度。

在屬水平上，兩種苜蓿的優勢菌屬均為節桿菌(Arthrobacter)、微小桿菌(Exiguobacterium)、假單胞菌(Pseudomonas)、黃桿菌(Flavobacterium)、腸桿菌(Enterobacter)、不動桿菌(Acinetobacter)、根瘤菌(Rhizobium)。對于‘北林201’，拌種處理增加了微小桿菌(Exiguobacterium)、不動桿菌(Acinetobacter)、根瘤菌(Rhizobium)的相對豐度，分別增加了2.05%，2.53%，0.80%，降低了節桿菌(Arthrobacter)、腸桿菌(Enterobacter)的相對豐度，分別降低了4.43%和2.54%。‘北林202’苜蓿拌種處理與不拌種處理相比，拌種增加了1.94%的節桿菌(Arthrobacter)、2.26%的微小桿菌(Exiguobacterium)和1.72%的假單胞菌(Pseudomonas)的相對豐度。

圖6 ‘北林201’苜蓿門、屬分類水平下的細菌群落相對豐度Fig.6 The relative abundance of bacterial communities in ‘Beilin 201’ Medicago phylum and genus classification level

圖7 ‘北林202’苜蓿門、屬分類水平下的細菌群落相對豐度Fig.7 The relative abundance of bacterial communities in ‘Beilin 202’ Medicago phylum and genus classification level

2.3.3兩種苜蓿根際細菌群落結構分析 基于Bray-Curtis距離(表1)進行的非度量多維尺度法NMDS群落結構分析表明，‘北林201’苜蓿根際微生物在細菌水平上群落分布比較集中(圖8左)。‘北林202’苜蓿的NMDS分析如圖8右所示，拌種處理的群落相似性逐漸降低；相對于不拌種處理，拌種處理的群落分布越來越集中，表明拌種處理影響了土壤微生物群落結構。

圖8 兩種苜蓿根際細菌NMDS分析Fig.8 NMDS analysis of two alfalfa rhizosphere bacteria

表1 兩種苜蓿根際細菌不相似性檢驗Table 1 Two kinds of alfalfa rhizosphere bacteria dissimilarity test

3 討論

3.1 拌種對兩種苜蓿株高和生物量的影響

生物菌肥作為一種新型的環境友好型肥料，其所包含的有益微生物不僅能給植物提供營養物質，促進植物生長，起到使植物增產的作用，同時也能很好的改善土壤質量[21]。本研究結果表明，生物拌種處理的兩種苜蓿株高和生長速率都明顯增加，且在拌種濃度為50%時增長最明顯，該結果與前人研究[10，22-23]的結果一致，添加生物菌肥能明顯增加植被的株高。盧秉林等[24]通過田間試驗，結果發現添加生物菌肥能增加春小麥生物產量和穗長。陳龍等[25]研究微生物肥替代化肥時發現，微生物肥能顯著增加玉米的株高、地上生物量、穗重。李敏等[26]研究發現生物菌肥可促進黃瓜株高、莖粗和葉片數。本研究結果表明拌種處理后‘北林202’生物量先增加后降低，但是‘北林201’生物量減少，這可能與牧草種植時間太晚導致牧草錯過最佳生長期有關。除此之外，影響苜蓿生長狀況的因素還有苜蓿品種、施肥量、種植株距和行距、刈割高度、氣候、日光照等，亦有可能是生物肥料的時空局限性，對兩種苜蓿的響應不同，牧草尚未適應當地環境和肥料條件，進而導致生物量增加不明顯，具體原因還需進一步研究。

3.2 拌種處理對兩種苜蓿土壤微生物的影響

土壤細菌群落多樣性受種植作物的影響[27]，不同的微生物通過分泌不同胞外酶從而在土壤養分循環中發揮著不同的功能[28]，進而使作物生長，即土壤微生物群落多樣性影響種植作物的生物量，有研究表明：某些微生物會與植被形成共生體系，如固氮菌與豆科植物形成根瘤菌，促進豆科植物的生長和產量提高[29-31]。本研究結果表明拌種處理后兩種苜蓿多樣性增加，豐富度降低，這與拌種處理后‘北林202’生物量先增加后降低，‘北林201’生物量減少對應，說明拌種對‘北林201’和202產量的差異性與土壤微生物差異性是有關系的。對于兩種苜蓿細菌群落組成分析表明，兩種苜蓿的主要優勢菌門均為變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、酸桿菌門(Acidobacteria)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)，且拌種處理增加了變形菌門(Proteobacteria)和放線菌門(Actinobacteria)的相對豐度，這兩個門水平下的許多微生物能很好的適應并生存于各類環境，甚至是極端環境[32-33]；變形菌門(Proteobacteria)包括植物共生的細菌(如根瘤菌屬)，因此說明拌種處理增強了兩種苜蓿固氮的可能性。本研究結果表明，拌種處理后土壤細菌群落結構存在差異，說明拌種處理對于微生物群落結構有一定的影響。相關研究[34-35]發現，增施生物菌肥能增加土壤細菌數量，改善土壤理化性質，調節土壤微生物生態,有效解除作物連作障礙；孫家駿和陳龍等[25，36]發現，施用生物有機肥可提高土壤酶活性以及微生物物種多樣性，增加土壤細菌和放線菌數量，這一結果與本研究結果一致，拌種處理后‘北林202’苜蓿的根際微生物細菌數量增加，且放線菌門和變形菌門的相對豐度增加。

4 結論

本研究利用田間觀測和高通量技術對兩種苜蓿拌種處理后生長狀況及土壤細菌群落多樣性的分析結果表明：拌種處理之后，兩種苜蓿的株高、生長率皆有明顯增加，且在拌種濃度為50%時效果最佳；拌種處理影響了兩種苜蓿土壤細菌多樣性和群落組成，其中，拌種處理增加了‘北林202’土壤細菌多樣性，但降低了‘北林201’的細菌多樣性，并且拌種處理增加了變形菌門(Proteobacteria)和放線菌門(Actinobacteria)的相對豐度。該研究探討了豆科牧草在拌種處理后對兩種苜蓿生長及根際微生物的影響，為微生物/植被生態修復技術中豆科共生體優勢產生的機理提供科學依據。同時，本研究為退化草地土壤微生物修復提供依據。