肝郁型動脈粥樣硬化小鼠模型建立及與易損斑塊的相關性研究?

黃曾艷， 彭春麗， 黃曼萍， 劉永源， 李春燕， 梁東輝△

(1.南方醫科大學珠江醫院， 廣州 510280； 2.廣州中醫藥大學第一附屬醫院， 廣州 510405；3.茂名市人民醫院，廣東 茂名 525000)

易損斑塊是指易于形成血栓或可發展為“罪犯病變”的動脈粥樣硬化(atherosclerosis, AS)斑塊，其進展和破裂導致的血小板聚集以及血栓形成是急性冠狀動脈綜合征(acute coronary syndromes, ACS)的主要病理學基礎[1，2]。隨著“生物-心理-社會醫學”模式的發展，焦慮、抑郁等不良心理應激與ACS的關系越來越受到重視。最新1項對國內531位ACS患者的前瞻性縱向研究結果表明，ACS合并焦慮或抑郁的患者12個月內發生非致死性心肌梗死的風險增加了約2倍，再住院風險增加了約5倍[3]。為此，當前冠心病防治領域需要從心理健康角度深化對AS易損斑塊的基礎性研究，進一步闡明AS斑塊易損性的影響因素。本研究通過高脂飲食聯合慢性不可預知溫和刺激(chronic unpredictable mild stress, CUMS)方法構建肝郁型動脈粥樣硬化小鼠模型，探討中醫肝郁病理狀態與AS斑塊易損性的相關性。本研究已通過南方醫科大學珠江醫院實驗動物倫理委員會審查，倫理號LAEC-2017-053。

1 材料

1.1 動物

30只雄性ApoE-/-小鼠，SPF級具有相同遺傳背景的野生型C57BL/6J小鼠10只，8周齡，體質量(22±1)g，購自常州卡文斯實驗動物有限公司，實驗動物許可證號SCXK(蘇)2011-0003。小鼠飼養環境為SPF級,室內溫度約23 ℃，自然光照，50%濕度，飲水自由。

1.2 主要試劑及儀器

小鼠去甲腎上腺素(norepinephrine,NE，武漢華美生物工程有限公司，貨號CSB-E07870 m)；小鼠超敏C反應蛋白(high sensitivity c-reactive protein,hs-CRP，美國Rapid Bio Lab公司，貨號06120401)；酶聯免疫試劑盒、總RNA提取試劑盒、熒光定量PCR試劑盒 (南京諾唯贊生物科技有限公司，貨號分別為RC101、R223-01、Q331-02)；蘇木素-伊紅染色液(上?；瘜W試劑廠，貨號M020)。

酶標儀(德國Thermo Scientific，型號MK3)；熒光倒置顯微鏡(日本Nikon，型號TS100-F)；熒光定量PCR儀(美國Thermofisher，型號Applied Biosystems 7500)；全自動生化分析儀(美國Abbott Laboratories，型號Aeroset)。

2 方法

2.1 分組

8周齡C57BL/6J小鼠10只作為空白對照組，同等周齡ApoE-/-小鼠30只，隨機分為正常對照組、高脂組、肝郁組共3組各10只。基礎飼料適應性喂養小鼠1周后開始實驗?？瞻讓φ战M、正常對照組給予普通飼料喂養，高脂組、肝郁組全程給予含脂肪21%、膽固醇0.15%的西方膳食飼料(北京科澳協力有限公司提供，Co60γ滅菌處理)喂養，不做其他干預；肝郁組加用CUMS方法干預12周，復制ApoE-/-小鼠中醫肝郁型動脈粥樣硬化小鼠模型。

2.2 肝郁型動脈粥樣硬化小鼠模型的建立

在高脂飲食喂養的基礎上，采用多重CUMS方法建立ApoE-/-小鼠中醫肝郁型動脈粥樣硬化模型[4]，CUMS方法中孤立后群居6 h、濕潤環境6 h、快速燈光交換加白噪音2 h、傾斜鼠籠6 h、整晚照明12 h、夾尾15 min、禁水24 h、禁食24 h 8種方法隨機安排，為避免小鼠因適應刺激而影響干預結果，不連續加入相同刺激[5]。

2.3 肝郁型動脈粥樣硬化模型小鼠行為學評價

實驗共包括4組小鼠，其中肝郁組小鼠給予CUMS刺激，非肝郁組指空白對照組、正常對照組、高脂組3組小鼠未給予CUMS刺激。實驗第14周采用高架十字迷宮(elevated plus maze, EPM)實驗比較小鼠開臂滯留時間占總時間百分比(open arm time, OAT)、開臂進入次數占總進臂次數百分比(open arm entries, OAE)來評價小鼠的焦慮水平[6]。采用曠場實驗(open field test，OFT)檢測小鼠自發活動和探索行為，記錄小鼠單位時間內某一肢體越過的格子數(crossings, Crs)即水平得分，后肢站立次數(Rearings, Res)即垂直得分[7]。采用6 min強迫游泳實驗(forced Swimming Test, FST)記錄后4 min內小鼠的漂浮不動時間，作為絕望行為指標[8]。

2.4 取材

行為學實驗結束后稱取小鼠體質量，使用1%戊巴比妥鈉50 mg/kg麻醉各組小鼠，采用眼球取血法，無菌條件下用眼科彎鑷迅速夾去小鼠眼球，抗凝管收集小鼠血液分離血漿備用。取血后冰上操作，解剖小鼠迅速打開胸腔和腹腔，取出新鮮肝臟洗凈血液，裝入EP管后立即入液氮中冷凍備用。精細眼科鑷從主動脈弓處輕柔分離主動脈，4%多聚甲醛固定液固定備用。

2.5 主動脈病理損傷觀察

取各組小鼠主動脈行病理學檢查：固定、修剪、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、烤片、脫蠟、染色，組織學切片中石蠟切片采用HE染色，冷凍切片采用油紅“O”染色觀察主動脈病理損傷程度，病理形態學分析選擇AS斑塊面積最大的切片。

2.6 血漿生化指標檢測

采用自動生化分析儀檢測各組小鼠血漿脂代謝指標包括總膽固醇(total cholesterol, TC )、甘油三酯(triglyceride，TG)、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol, HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol, LDL-C)含量，以及中性粒細胞總數(neutrophils，NEUT)。

2.7 血漿NE、hs-CRP檢測

依照ELISA試劑盒說明書，進行標準品的稀釋、加樣、溫育、配液、洗滌、加酶、溫育、洗滌、顯色、終止。取450 nm波長，測量各孔的吸光度值，創建相應的標準曲線檢測樣品濃度，測算小鼠血漿NE、hs-CRP表達水平。

2.8 熒光定量PCR檢測肝臟CRP mRNA表達

Trizol試劑抽提小鼠肝臟總RNA，紫外分光光度計進行總RNA純度和完整性檢測，合成cDNA進行PCR循環，反應條件為：94 ℃ 5 min預變性，94 ℃ 50 s變性，58 ℃ 30 s退火，72 ℃ 30 s延伸，34個循環，72 ℃ 10 min繼續延伸。小鼠肝臟CRP引物序列為F: AAGGATCAGGACCGGGGTAG,R: GGCGT TCAGTGGCTTCTTTG。內參采用鼠GADPH，引物序列為F: TGCACCACCAACTGCTTAG,R: GGATGCA GGGATGATGTTC。2-△△Ct法計算基因的相對表達量。

2.9 統計學方法

3 結果

3.1 行為學實驗結果

EPM開臂活動：肝郁組小鼠OAT(10.55±1.43)顯著低于(P<0.001)非肝郁組小鼠(18.14±3.57)(見圖1A)；肝郁組小鼠OAE(16.79±3.52)顯著低于(P<0.001)非肝郁組小鼠(33.83±4.79)(見圖1A)。OFT實驗：肝郁組小鼠水平得分(31.58±4.6)和垂直得分(13.61±2.45)顯著低于(P<0.001)非肝郁組小鼠水平得分(67.99±13.01)和垂直得分(25.52±4.31)，(見圖1B)。FST實驗：肝郁組小鼠的不動時間(145.66±21.89)明顯高于(P<0.001)非肝郁組小鼠(64.55±12.29)(見圖1C)。

注：OAT.開臂滯留時間占總時間百分比；OAE.開臂進入次數占總進臂次數百分比；Crs代表水平得分；Res代表垂直得分。肝郁組，n=10；非肝郁組：空白對照組、正常對照組、高脂組，n=30；與非肝郁組比較：*** P<0.001圖1 各組小鼠高架十字迷宮(EPM)、曠場實驗(OFT)、強迫游泳實驗(FST)結果比較

注：A. 空白對照組；B. 正常對照組；C.高脂組；D. 肝郁組圖2 各組小鼠主動脈HE染色比較(×200, n=10)

3.2 主動脈病理形態結果

3.2.1 HE染色結果 空白對照組小鼠主動脈壁厚薄均勻，內皮完整清晰，內膜光滑，中膜及外膜未見異常，無AS病灶(圖2A)；正常對照組主動脈AS病灶可見內膜下少數呈圓形或橢圓形，胞質內含有大量小空泡的泡沫細胞聚集(圖2B)，高脂組和肝郁組均表現為不同程度的內膜增厚，斑塊內膜表面遭到破壞，脂質池被增生的纖維帽覆蓋，主動脈壁厚度不均一為AS最具特征性的病變，其中高脂組纖維粥樣斑塊處于穩定期，AS病灶纖維帽厚，而脂質池較小，屬于穩定型AS斑塊(圖2C)，肝郁組AS病灶彈力纖維破壞，纖維帽較薄，大量呈針狀空隙的膽固醇結晶形成，脂質池較大易于破裂，屬于ApoE-/-小鼠AS易損斑塊(圖2D)[5,9]。

3.2.2 油紅“O”染色結果 主動脈瓣硬化是AS的標志，冷凍切片油紅“O”染色可通過檢測含脂泡沫細胞及其組成的粥樣斑塊來判斷主動脈瓣的粥樣硬化程度。本研究對照組中小鼠主動脈瓣形態良好，每層結構較為清晰，且排列整齊(圖3A)。其余3組小鼠均存在不同程度的AS病變，動脈粥樣硬化區域脂質呈鮮紅色，細胞核呈藍色，間質無色。正常對照組、高脂組、肝郁組以粥樣斑塊為主要表現，脂質成分豐富，大量泡沫細胞崩解，纖維及基質成分增加，斑塊深部為大量壞死物質(圖3B、圖3C、圖3D)，其中肝郁組小鼠AS斑塊所占動脈管腔面積最大，大脂質池內包含較多的針狀空隙膽固醇結晶，大壞死核，薄纖維帽，極易破裂等易損斑塊特征最為明顯(圖3D)[9]。

注：A. 空白對照組；B. 正常對照組；C. 高脂組；D. 肝郁組圖3 各組小鼠主動脈瓣油紅“O”染色病理學改變比較(×200, n=10)

3.3 小鼠體質量及血脂代謝結果

圖4示，與空白對照組比較，正常對照組、高脂組、肝郁組體質量、TC、TG和LDL-C含量升高，HDL-C含量下降，差異有統計學意義(P<0.05)；與正常對照組比較，高脂組、肝郁組體質量、TC、TG和LDL-C含量升高，HDL-C含量下降，差異有統計學意義(P<0.05)；與高脂組比較，肝郁組體質量、TC、TG和LDL-C含量升高，HDL-C含量下降，差異有統計學意義(P<0.05)。

注：TC.總膽固醇；TG.甘油三酯；LDL-C.低密度脂蛋白膽固醇；HDL-C.高密度脂蛋白膽固醇；與空白對照組比較：*P<0.05；與正常對照組比較：#P<0.05；與高脂組比較：&P<0.05圖4 各組小鼠體質量與血脂代謝指標比較

3.4 小鼠血漿NE、炎癥標志物表達結果

圖5示，與空白對照組比較，正常對照組、高脂組、肝郁組小鼠血漿NE、hsCRP、NEUT、肝臟CRP mRNA表達水平升高，差異有統計學意義(P<0.05)；與正常對照組比較，高脂組、肝郁組血漿NE、hsCRP、NEUT、肝臟CRP mRNA表達水平升高，差異有統計學意義(P<0.05)；與高脂組比較，肝郁組血漿NE、hsCRP、NEUT，肝臟CRP mRNA表達水平含量升高，差異有統計學意義(P<0.05)。

注：NE.去甲腎上腺素；hsCRP.超敏C反應蛋白；NEUT.中性粒細胞總數；CRP.C反應蛋白；與空白對照組比較：*P<0.05；與正常對照組比較：#P<0.05；與高脂組比較：&P<0.05圖5 各組小鼠血漿NE(A)、hsCRP (B)、NEUT (C)、肝臟CRP mRNA(D)表達比較

4 討論

冠心病患者由于疾病帶來的心理壓力和機體不適，常引發焦慮、抑郁等不良情緒，這與中醫肝郁氣滯證型互相契合。中醫學認為，冠心病病位在心，但因五臟相關，與肝關系密切。肝與心經脈相連，在調暢人體情志方面相互為用，心主血脈，肝主疏泄，肝的疏泄功能正常則氣機暢調，血脈通利；若肝失條達則氣滯血瘀，血脈閉阻，形成“胸痹”“心痛”。長期的臨床實踐表明，不良情志刺激是ACS發生發展的重要原因，肝氣郁結是斑塊易損、破裂及病情發展和惡化的關鍵因素[5,10]。在臨床上疏肝理氣中藥的運用和精神心理治療對緩解ACS患者的癥狀、穩定病情、減少復發率和死亡率具有確切的療效[10，11]。

目前肝郁證的造模方法有多種，如四氯化碳注射導致急慢性肝損傷法、慢性束縛法、飲食偏嗜即高脂飼料喂養法、醋酸喂食、夾尾激怒等方法單獨或聯合應用，但以上幾種方法存在對肝細胞損害較大、刺激因子單一等缺點，與肝郁證的臨床實際尚存在較大差異[12]。本研究在高脂飲食喂養的基礎上，聯合采用CUMS方法[13]，應激因子強度低,可持續時間長，與臨床ACS患者長期遭受心理應激的過程相似[14]，與肝郁證形成的病因學一致[4]。研究結果表明，通過多重CUMS刺激方法，從心理干擾、環境改變等多方面造成小鼠抑郁、焦慮等不良情緒，CUMS刺激小鼠在新異環境中的自主、探究行為減少,小鼠表現出喜歡瞇眼、貼邊、嗜睡、皮膚毛發枯槁稀疏無光澤、行動遲緩等肝郁征象，從而成功復制了最符合中醫“肝郁”證的病理機制及證候特征的AS小鼠模型[15]。

脂質代謝紊亂和炎癥反應激活是AS穩定斑塊向易損斑塊轉變的重要病理機制?，F代中醫將AS并發高脂血癥的病理改變歸咎于中醫“痰濁”[16]，已基本達成共識。肝主疏泄可助脾運化，若肝失疏泄、氣機不利則會導致“木橫侮土”，脾胃損傷，運化功用失常則水谷不能化生精微，導致膏脂代謝紊亂，脂質囤積于體內引發高脂血癥[5,17]。本研究中肝郁小鼠體質量、脂代謝指標TC、TG、LDL-C含量升高，HDL-C含量降低，與主動脈病理HE染色、油紅“O”染色AS嚴重程度相一致，表明肝郁型動脈粥樣硬化小鼠存在嚴重的脂質代謝紊亂，這可能是引發AS斑塊不穩定和破裂的重要原因。

心理應激可誘導炎癥、增強血流動力學反應，從而成為觸發AS易損斑塊破裂的重要原因。研究表明，當人體處于高度緊張等心理應激狀態時，血液內的炎癥白細胞尤其是中性粒細胞、單核細胞會明顯升高[18]。本研究發現，肝郁小鼠血漿NE、NEUT、hsCRP水平升高，肝臟CRP mRNA表達量升高,提示肝郁ApoE-/-小鼠腎上腺素興奮性增高,炎癥反應加重,與現代醫學研究中焦慮、抑郁等不良心理應激誘導的下丘腦-垂體-腎上腺軸紊亂的觀點一致[19]。

綜上所述，本研究通過高脂喂養聯合CUMS刺激方法構建了肝郁型動脈粥樣硬化小鼠模型，證明肝郁型動脈粥樣硬化ApoE-/-小鼠存在更為嚴重的炎癥和脂質代謝紊亂，炎癥和脂質代謝的嚴重失衡加重了AS病變，進一步加速了易損斑塊的形成。本研究通過探討肝郁型動脈粥樣硬化模型小鼠與易損斑塊的相關性，為冠心病二級預防方案中“心理預防”的觀點提供了實驗依據，提示臨床醫生在實踐工作中要重視冠心病患者合并精神心理問題的篩查，要針對肝郁病理狀態進行綜合治療。但本研究僅對肝郁與AS易損斑塊相關性做了初步研究，下一步將在此基礎上繼續探討肝郁與AS易損斑塊形成的分子機制，尋找AS易損斑塊的潛在干預靶點，為中醫藥防治ACS提供新思路與干預方法。