基于代謝組學(xué)探討參麥注射液干預(yù)高血壓心衰大鼠的生物學(xué)機制?

鐘森杰， 李 靜， 胡思遠(yuǎn)， 黃淑敏， 楊 夢， 李 琳， 胡志希

(湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)診斷研究所， 長沙 410208)

Dahl鹽敏感大鼠是研究高血壓心衰的理想材料，在生長過程中只需給予高鹽飲食，即可很好地模擬高血壓病演變?yōu)樾乃サ牟±磉^程。本課題組前期多次成功制備高血壓心衰模型，比對分析不同中藥注射液的治療效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)參麥注射液能有效優(yōu)化該模型的多項心功能指標(biāo)，改善心肌結(jié)構(gòu)損傷，展現(xiàn)出多靶點、多效應(yīng)的干預(yù)機制[1]。在此基礎(chǔ)上以系統(tǒng)生物學(xué)為切入點，觀察參麥注射液對高血壓心衰大鼠內(nèi)源性代謝產(chǎn)物的影響，證實藥物干預(yù)機制涉及調(diào)節(jié)氨基酸代謝、糖代謝、能量代謝、氧化應(yīng)激等多個層面，從而促使代謝功能趨于正?；痆2，3]。鑒于單一的檢測分析技術(shù)及樣本類型并不能反映整體生物學(xué)信息，因此本研究進(jìn)一步運用高通量的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(liquid chromatography mass spectrometry, LC-MS)技術(shù)，觀察參麥注射液對高血壓心衰大鼠血清代謝產(chǎn)物及相關(guān)代謝路徑的調(diào)節(jié)趨勢，從生物學(xué)角度闡明疾病的治療靶點，以期為臨床治療提供實驗依據(jù)。該研究已通過湖南中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會審查，倫理號LL20190902402。

1 材料

1.1 動物

24只雄性Dahl鹽敏感大鼠，6周齡，體質(zhì)量(220±10)g，購自維通利華(北京)實驗動物技術(shù)有限公司，實驗動物許可證號SCXK(京)2016-0011。飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心SPF級實驗室，溫度20～25 ℃，濕度：40%～60%，光照/黑暗12 h周期循環(huán)。大鼠飼料購自北京科澳協(xié)力飼料有限公司，質(zhì)量合格證號1112621900016339。

1.2 藥物與試劑

甲醇(純度≥99.0%)、乙腈(純度≥99.9%)，貨號分別為A456-4、A955-4，美國Thermo科技公司；2-氯苯丙氨酸(純度98.5%)，貨號C105993，阿拉丁試劑(上海)有限公司；甲酸(純度：LC-MS級)，貨號F0654，梯希愛(上海)化成工業(yè)有限公司；參麥注射液，規(guī)格：50 mL/瓶，國藥準(zhǔn)字：Z33020019，批號1909288，正大青春寶藥業(yè)有限公司。

1.3 儀器

Vanquish型液相色譜儀、Q Exactive Focus型質(zhì)譜儀，美國Thermo科技公司；SonoScape-S2N型彩超儀，深圳開立科技公司；QL-866型混勻儀，美國Vortex Mixer公司；5305型真空濃縮儀，德國Eppendorf公司；CODA型無創(chuàng)血壓儀，美國Kent Scientific公司。

2 方法

2.1 模型制備

模型制備方法依據(jù)課題組前期文獻(xiàn)[1-3]。24只大鼠按隨機數(shù)字表法分為正常組8只與造模組16只。正常組給予常規(guī)鼠料(含0.3% Nacl)喂養(yǎng)，造模組給予高鹽鼠料(含8% Nacl)喂養(yǎng)，每只每天的飲食量控制為20 g，不限量飲水共20周。模型制備期間，每4周測量1次鼠尾血壓。模型制備結(jié)束后，對所有大鼠行心臟彩超，計算左室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction, LVEF)與左室短軸縮短率(fraction shortening, FS)，并眼眶取血以測定血清中氨基末端腦鈉肽前體(N terminal pro B type natriuretic peptide, NT-proBNP)濃度。以收縮壓>140 mmHg、LVEF與FS顯著下降、NT-proBNP顯著上升作為高血壓心衰的評價依據(jù)。

2.2 藥物干預(yù)

模型制備成功大鼠16只隨機分為模型組和參麥注射液組各8只。參麥注射液的干預(yù)方式依據(jù)課題組前期文獻(xiàn)[1，2]，單次劑量為6.0 mL/kg，每天1次腹腔注射，共干預(yù)15 d。模型組注射相同劑量的滅菌用水。給藥結(jié)束后再次行心臟彩超并測定血清NT-proBNP濃度。

2.3 樣本采集與預(yù)處理

藥物干預(yù)后麻醉大鼠，打開腹腔腹主動脈取血。取血清200 μL用于測定NT-proBNP濃度，剩余血清于-80 ℃冰箱中保存。上機分析前將血清置于4 ℃環(huán)境中融化，每樣本提取100 μL，加入400 μL甲醇振蕩混勻，取上清液真空濃縮干燥，150 μL 2-氯苯丙氨酸(4ppm)經(jīng)80%甲醇溶液復(fù)溶，上清液經(jīng)0.22 μm膜過濾，得到待測樣本進(jìn)行上機分析。

2.4 LC-MS分析條件

色譜條件：色譜柱為 ACQUITY UPLC HSS T3 1.8 μm(2.1×150 mm)，柱溫設(shè)置為40 ℃，以0.25 mL/min流速進(jìn)樣，進(jìn)樣2 μL進(jìn)行梯度洗脫。流動相：正離子0.1%甲酸水(B2)- 0.1%甲酸乙腈(A2)；負(fù)離子甲酸銨水(B1)-乙腈(A1)。質(zhì)譜條件：采用電噴霧離子源(ESI)，正負(fù)離子電離模式，正離子電壓3.50 kv，負(fù)離子電壓2.50 kv；以分辨率70000進(jìn)行全掃描并進(jìn)行二級裂解。

2.5 數(shù)據(jù)預(yù)處理

運用Proteowizard軟件(v3.0.8789)將上機分析所得的原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成mzXML格式，通過R(v3.3.2)的XCMS程序包進(jìn)行峰處理。獲得數(shù)據(jù)矩陣，包括峰面積、質(zhì)核比、保留時間等內(nèi)容，以excel表形式導(dǎo)出進(jìn)行后續(xù)的統(tǒng)計學(xué)分析。為比較不同量級的數(shù)據(jù)，進(jìn)行峰面積的歸一化處理。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法

代謝輪廓分析與差異代謝產(chǎn)物鑒定采用SIMCA-P(v13.0)軟件包和R語言ropls包，對數(shù)據(jù)矩陣進(jìn)行主成分分析(principal component analysis, PCA)和正交-偏最小二乘判別分析(orthogonal partial least squares discriminant analysis, OPLS-DA)，繪制正、負(fù)離子模式下的得分圖。差異代謝產(chǎn)物鑒定基于OPLS-DA的變量重要性值投影(variable important in projection, VIP)，納入VIP>1.2的代謝產(chǎn)物，并進(jìn)行統(tǒng)計分析以驗證差異是否有統(tǒng)計學(xué)意義。比對策略：模型組vs正常組、模型組vs參麥注射液組，以模型組紊亂的代謝產(chǎn)物為潛在靶標(biāo)，觀察參麥注射液組的回調(diào)情況，最終納入2組比對策略的共有差異代謝產(chǎn)物。代謝路徑拓?fù)浞治霾捎肕etaboAnalyst 4.0在線分析平臺，以RawP<0.05且Impact>0為篩選條件，納入顯著代謝路徑。

3 結(jié)果

3.1 心功能指標(biāo)檢測結(jié)果

藥物干預(yù)后檢測各項心功能指標(biāo)以評價療效。與正常組比較，模型組的LVEF與FS值降低，NT-proBNP值上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，確定已成射血分?jǐn)?shù)保留的高血壓心衰模型；與模型組比較，參麥注射液組的LVEF與FS值上升，NT-proBNP值降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

表1 3組大鼠LVEF、FS和NT-proBNP比較

3.2 PCA分析

PCA模型反映代謝組數(shù)據(jù)的原始狀態(tài)，可直觀觀察樣本的離散與聚集程度。圖1示，各組間的正、負(fù)離子PCA得分圖，大部分樣本的代謝成分積分點均處于置信區(qū)間內(nèi)，各組在空間分布上明顯分開，呈左右或上下對稱趨勢，組間分離趨勢較好。

3.3 OPLS-DA分析

OPLS-DA為有監(jiān)督的分析方法，能有效降低模型復(fù)雜性與提升模型解釋強度，從而直觀地觀察各組間的代謝輪廓差異。圖2示， 各組間的正、負(fù)離子OPLS-DA得分圖，所有樣本的代謝成分積分點均處于置信區(qū)間內(nèi)，各組樣本點在空間分布上呈左右對稱分離趨勢，組間無交互重疊，分離程度良好，提示組間存在顯著的代謝輪廓差異。

注：A.模型組與正常組的正離子PCA得分圖；B.模型組與參麥注射液組的正離子PCA得分圖；C.模型組與正常組的負(fù)離子PCA得分圖；D.模型組與參麥注射液組的負(fù)離子PCA得分圖。“Control”為正常組，“H-HF”為模型組，“SMI”為參麥注射液組圖1 正負(fù)離子模式的PCA得分圖

注：A.模型組與正常組的正離子OPLS-DA得分圖；B.模型組與參麥注射液組的正離子OPLS-DA得分圖；C.模型組與正常組的負(fù)離子OPLS-DA得分圖；D.模型組與參麥注射液組的負(fù)離子OPLS-DA得分圖?！癈ontrol”為正常組，“H-HF”為模型組，“SMI”為參麥注射液組圖2 正負(fù)離子模式的OPLS-DA得分圖

3.4 差異代謝產(chǎn)物

表2示，以VIP>1.2且P<0.05為條件，篩選正常組與模型組間的差異代謝產(chǎn)物，并作為可能的藥物靶標(biāo)，觀察藥物治療后的變化趨勢。經(jīng)參麥注射液干預(yù)后，四氫嘧啶、谷氨酸、腺嘌呤、異檸檬酸、乙酰乙酸、尸胺、12,13-二氫乳清酸的表達(dá)水平向正常方向回調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；?；撬帷⒘姿崃u基丙酮酸、尿酸、纈氨酸、脯氨酸、甘氨鵝脫氧膽酸、脫氧胞苷、瓜氨酸、硬脂酸、棕櫚酸的表達(dá)水平呈回調(diào)趨勢。

表2 差異代謝產(chǎn)物信息比較

3.5 代謝通路分析

表2圖3示，代謝通路分析結(jié)果顯示，參麥注射液干預(yù)后顯著回調(diào)的7種代謝產(chǎn)物共涉及16條代謝路徑。以RawP<0.05且Impact>0為條件，納入4條代謝路徑，視為參麥注射液干預(yù)后的顯著代謝路徑。顯著代謝路徑為：丁酸代謝(Butanoate metabolism)，酮體的合成與降解(Synthesis and degradation of ketone bodies)，D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代謝(D-Glutamine and D-glutamate metabolism)，谷胱甘肽代謝(Glutathione metabolism)。

4 討論

心臟是高耗能器官，心肌細(xì)胞必須不斷產(chǎn)生能量方可維持泵血與舒縮功能。正常生理條件下，心臟可利用多種底物產(chǎn)能以供給能量，其中脂肪酸是主要的能量來源底物。在心衰的病理過程中，心臟產(chǎn)能底物由脂肪酸向葡萄糖、氨基酸等物質(zhì)轉(zhuǎn)移，氨基酸代謝增強以維持能量供給，因此可見模型大鼠的谷氨酸、脯氨酸、瓜氨酸等多種氨基酸物質(zhì)水平紊亂[4，5]。另有研究證據(jù)顯示，酮體、支鏈氨基酸是心衰中晚階段的替代產(chǎn)能底物，故纈氨酸、酮體代謝路徑亦呈異常表達(dá)[6]。產(chǎn)能底物轉(zhuǎn)移是衰竭心臟的典型代謝表征，但底物變化并不能滿足心衰時的能量需求，并將致使心臟能量代謝障礙，逐步惡化心功能和促進(jìn)心肌重構(gòu)進(jìn)展，故底物利用的正?；切乃ブ委煹闹匾繕?biāo)[7]。

圖3 代謝通路概要圖

表3 顯著代謝通路比較

谷氨酸、尸胺參與谷胱甘肽代謝通路，其中谷氨酸為谷胱甘肽的合成底物，谷氨酸的低水平表達(dá)將影響谷胱甘肽合成，而谷胱甘肽含量降低則是細(xì)胞凋亡的早期激活信號[8]。谷胱甘肽為細(xì)胞內(nèi)關(guān)鍵的調(diào)節(jié)性代謝物質(zhì)和抗氧化劑，一方面通過激活多種酶活性以調(diào)控糖類、蛋白質(zhì)代謝，并參與三羧酸(tricarboxylic acid，TCA)循環(huán)，維持能量代謝；另一方面，谷胱甘肽可清除心肌中的氧自由基，緩解自由基對心臟等靶器官的損傷[9]。谷氨酸參與D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代謝通路，谷氨酰胺是促進(jìn)蛋白質(zhì)合成利用的重要物質(zhì)，同時參與谷胱甘肽合成，通過補充機體的谷胱甘肽儲備以提高抗氧化能力。本次研究結(jié)果顯示，參麥注射液可顯著改善氨基酸類產(chǎn)物的水平紊亂，從而改善能量代謝，增強心肌抗氧化損傷能力，其干預(yù)機制主要體現(xiàn)為對谷氨酸及其關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)路徑的調(diào)控。

酮體的合成與降解、丁酸代謝通路中均有乙酰乙酸參與。酮體是肝臟脂肪酸氧化分解生成的中間產(chǎn)物，亦是氧化不完全的丁酸產(chǎn)物，包含乙酰乙酸、β-羥丁酸、丙酮等3種物質(zhì)。肝臟中含有多種合成酮體的酶系，即酮體合成主要源自肝臟功能，但肝臟并不能利用酮體[10]。乙酰乙酸可被轉(zhuǎn)運出肝細(xì)胞質(zhì)膜，經(jīng)血液循環(huán)進(jìn)入心臟等肝外組織，氧化后經(jīng)TCA循環(huán)生成能量并被組織所利用[11]。心衰時心臟的脂肪酸、葡萄糖供能不足，此時乙酰乙酸成為重要的能量來源，故可見模型大鼠的酮體相關(guān)路徑紊亂，以及乙酰乙酸呈高水平表達(dá)。在參麥注射液的干預(yù)作用下，心臟能量供應(yīng)逐步恢復(fù)，乙酰乙酸水平回調(diào)。

異檸檬酸是檸檬酸通過烏頭酸酶催化的可逆反應(yīng)所生成的異構(gòu)體，參與TCA循環(huán)，可經(jīng)異檸檬酸脫氫酶產(chǎn)生a-酮戊二酸。TCA循環(huán)是生物體產(chǎn)能的主要途徑，參與循環(huán)的中間物質(zhì)顯著下降，此路徑的正常功能必然受抑制[12]。腺嘌呤為核酸和輔酶的重要組分，其與核糖、3個磷酸基團(tuán)相連接而形成三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)，ATP則是生物體的直接能量來源[13]。上述2種物質(zhì)紊亂是能量代謝障礙的標(biāo)志，提示心肌組織的能量供應(yīng)不足，而參麥注射液能有效優(yōu)化能量代謝。

本次研究還納入具有回調(diào)趨勢的10種代謝產(chǎn)物，其中牛磺酸、纈氨酸、脯氨酸、瓜氨酸均屬氨基酸類物質(zhì)，硬脂酸、棕櫚酸屬脂肪酸類物質(zhì)，均為油脂中的重要組分，2種物質(zhì)的高表達(dá)水平提示模型大鼠體內(nèi)出現(xiàn)脂質(zhì)堆積[14]；尿酸作為嘌呤代謝的終產(chǎn)物，是多種心血管疾病進(jìn)展為心衰的獨立預(yù)報因子，亦是心衰預(yù)后評價的標(biāo)志物[15]；磷酸羥基丙酮酸、甘氨鵝脫氧膽酸、脫氧胞苷3種物質(zhì)的相關(guān)研究較少，其生物學(xué)功能尚未完全明確。經(jīng)參麥注射液干預(yù)后，上述代謝產(chǎn)物表達(dá)水平均呈現(xiàn)不同程度的回調(diào)趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，考慮可能與藥物干預(yù)時間相關(guān)。這部分物質(zhì)可被視為參麥注射液治療高血壓心衰的潛在靶點，值得更為深入的研究。

綜上所述，在高血壓誘導(dǎo)的慢性心衰病理過程中，心功能持續(xù)惡化，并伴隨一系列生物學(xué)功能的改變，提示衰竭心臟的能量需求增加，能量合成利用能力受損傷，與前期研究結(jié)果存在共性[16-18]。本次研究在前期基礎(chǔ)上進(jìn)一步揭示參麥注射液治療高血壓心衰的作用機制，即改善氨基酸、酮體等產(chǎn)能底物紊亂，調(diào)控能量代謝相關(guān)路徑，從而為衰竭心臟供給更多的能量，恢復(fù)心臟功能并延緩心衰進(jìn)展，這也為心衰治療提供了新靶點與新思路。