甲狀腺癌組織中微小RNA-495-3p、Holliday交叉識(shí)別蛋白表達(dá)水平及臨床意義

劉培發(fā), 侯文宇, 菅雁兵, 李佶陽(yáng)

(中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心普通外科醫(yī)學(xué)部 甲狀腺疝外科, 北京, 100853)

甲狀腺癌是內(nèi)分泌系統(tǒng)常見(jiàn)惡性腫瘤，多發(fā)于甲狀腺濾泡上皮，是目前發(fā)病率增長(zhǎng)速度最快的惡性腫瘤之一。甲狀腺癌主要包括分化型、未分化型和其他類型，不同類型甲狀腺癌患者預(yù)后差異較大，且伴不同程度的術(shù)后并發(fā)癥，并累及不同器官[1]。因此，早期診斷對(duì)甲狀腺癌的防治具有重要意義。微小RNA(miRNA)是一類長(zhǎng)度約22個(gè)核苷酸的非編碼小RNA分子，通過(guò)與目的基因的3′非翻譯端結(jié)合來(lái)抑制mRNA翻譯或降解mRNA, 在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)節(jié)基因表達(dá)，參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡等過(guò)程[2]。研究[3-4]發(fā)現(xiàn)，微小RNA-495-3p(miR-495-3p)在多種腫瘤中表達(dá)下調(diào)，可能發(fā)揮抑癌作用，在甲狀腺癌中的表達(dá)關(guān)系尚未見(jiàn)報(bào)道。Holliday交叉識(shí)別蛋白(HJURP)是一種組蛋白H3伴侶，被認(rèn)為是DNA結(jié)合及磷酸化的關(guān)鍵因子，可促進(jìn)染色體分離和細(xì)胞有絲分裂[5]。HJURP在肝癌、腎細(xì)胞癌、胰腺癌等多腫瘤中表達(dá)異常升高，并與不良臨床結(jié)局相關(guān)，可能作為指示腫瘤發(fā)展的潛在生物標(biāo)記物[6-7]。本研究檢測(cè)甲狀腺癌組織miR-495-3p、HJURP表達(dá)水平及表達(dá)關(guān)系并探討其臨床意義，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選擇2016年1月—2018年1月行手術(shù)根治術(shù)并經(jīng)病理檢查確診為甲狀腺癌石蠟包埋標(biāo)本及正常甲狀腺組織石蠟包埋標(biāo)本為研究對(duì)象，共納入67例甲狀腺癌組織標(biāo)本和42例正常甲狀腺組織標(biāo)本。納入標(biāo)準(zhǔn): ① 臨床資料和病理資料完整者; ② 均為首次診斷并治療的患者，且術(shù)前未接受其他任何抗腫瘤治療; ③ 患者及家屬知情并同意本研究。排除標(biāo)準(zhǔn): ① 合并其他甲狀腺疾病者; ② 合并近期感染或傳染性疾病的患者; ③ 繼發(fā)性甲狀腺癌者; ④ 合并其他惡性腫瘤者。67例甲狀腺癌患者中，男26例，女41例，年齡43～67歲，平均(55.60±4.63)歲, ≥55歲39例, <55歲28例; 腫瘤直徑≥2 cm 37例, <2 cm 30例; 病理類型: 乳頭狀癌31例，濾泡狀癌16例，髓樣癌12例，未分化癌8例; TNM分期: Ⅰ～Ⅱ期32例，Ⅲ～Ⅳ期35例; 合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移42例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移25例。正常甲狀腺患者男18例，女24例，年齡42～62歲，平均(54.86±4.82)歲。2組研究的年齡、性別比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究獲得倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要儀器及試劑

TRIzol試劑(批號(hào): 20170322, 購(gòu)自美國(guó)Sigma公司)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)擴(kuò)增試劑盒(批號(hào): 20161209、20170501, 均購(gòu)自Thermo Scientific公司)、UV-1800PC紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(購(gòu)自上海美譜達(dá))、HJURP兔抗人多克隆抗體(批號(hào): 20170118, 購(gòu)自上海群己生物科技有限公司)、DAB酶底物顯色劑、中杉金橋SPN-9002免疫組化染色試劑盒(批號(hào): 20170714、20160425，均購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)miR-495-3p水平: 利用TRIzol試劑提取組織總RNA, 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA濃度及純度，以O(shè)D260/OD280值在1.8～2.2范圍內(nèi)為純度較好。以RNA為模板，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA, 并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，操作步驟及注意事項(xiàng)均嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)執(zhí)行。miR-495-3p以U6為內(nèi)參，引物序列由上海生工生物工程公司合成。miR-495-3p上游引物5′-GGGGAAACAAACATGGTGCAC-3′, 下游引物5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′; U6上游引物3′-CTCGCTTCGGCAGCACA-5′, 下游引物3′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-5′。反應(yīng)條件: 95 ℃預(yù)變性10 min, 95 ℃變性10 s, 62 ℃延伸30 s, 40個(gè)循環(huán)。用2-??Ct法計(jì)算miR-495-3p水平。

1.3.2 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)HJURP: 將石蠟包埋組織以4 μm連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟、水化后，用3%過(guò)氧化氫孵育5～10 min, 以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性; 蒸餾水沖洗后，用磷酸鹽緩沖溶液(PBS)浸泡5 min; 抗原熱修復(fù)、封閉、滴加一抗、孵育、洗滌、再次封閉后滴加二抗，再次洗滌，滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記鏈霉親和素, PBS沖洗3次, DBA顯色，自來(lái)水充分沖洗，復(fù)染，封片。所有操作步驟均按照試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行。利用PBS緩沖液代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.3.3 結(jié)果判定: HJURP以細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜出現(xiàn)黃色或黃棕色顆粒為表達(dá)陽(yáng)性，采用雙盲法對(duì)所有切片進(jìn)行觀察評(píng)分。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡視野，根據(jù)染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比進(jìn)行評(píng)分: ① 按染色強(qiáng)度評(píng)分。細(xì)胞不著色記0分，淡黃色記1分，黃色或黃棕色記2分，棕色或棕褐色記3分; ② 按陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分。無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞記0分，陽(yáng)性細(xì)胞比例<25%記1分, 26%～50%記2分, >50%記3分。2種方法評(píng)分的乘積>3分即為陽(yáng)性, ≤3分即為陰性。

1.3.4 隨訪: 從手術(shù)之日開(kāi)始對(duì)患者進(jìn)行門(mén)診或打電話隨訪，以患者死亡或2021年1月31日結(jié)束隨訪，統(tǒng)計(jì)患者累積生存情況，以分析甲狀腺癌組織中miR-495-3p、HJURP水平與患者預(yù)后的關(guān)系。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)錄入與分析，計(jì)量資料均符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，2組比較采用t檢驗(yàn); 計(jì)數(shù)資料、分類資料用率表示，行卡方檢驗(yàn)。Kaplan-Meier生存曲線分析甲狀腺癌組織中miR-495-3p、HJURP水平與患者預(yù)后的關(guān)系, COX回歸分析影響甲狀腺癌患者預(yù)后不良的因素。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 免疫組化結(jié)果

HJURP在癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為62.69%(42/67), 在正常甲狀腺組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為26.19%(11/42), 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=13.765,P<0.01), 見(jiàn)圖1。

A: HJURP在癌組織中呈高表達(dá); B: HJURP在癌組織中呈中等表達(dá); C: HJURP在癌組織中呈低表達(dá); D: HJURP在正常組織中幾乎不表達(dá)。圖1 免疫組化結(jié)果(放大倍數(shù)為100倍)

2.2 甲狀腺癌組織和正常甲狀腺組織中miR-495-3p水平比較

miR-495-3p在甲狀腺癌組織和正常甲狀腺組織中的相對(duì)表達(dá)量分別為(0.76±0.21)、(1.26±0.40), 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.539,P<0.001)。

2.3 miR-495-3p、HJURP水平與甲狀腺癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

以甲狀腺癌患者miR-495-3p水平中位數(shù)(0.75)為分界點(diǎn)，將患者分為miR-495-3p高表達(dá)組(35例)和miR-495-3p低表達(dá)組(32例)，根據(jù)HJURP的表達(dá)結(jié)果及將患者分為HJURP陽(yáng)性組(n=42)和HJURP陰性組(n=25)。結(jié)果顯示, miR-495-3p、HJURP水平與甲狀腺患者年齡、性別、病理類型、分化程度無(wú)顯著相關(guān)性(P>0.05), 與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.05)。臨床分期Ⅲ～Ⅳ、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的甲狀腺癌患者miR-495-3p水平更低，HJURP蛋白陽(yáng)性表達(dá)越高，見(jiàn)表1。

表1 miR-495-3p、HJURP水平與甲狀腺癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.4 甲狀腺癌組織中miR-495-3p、HJURP水平與患者預(yù)后的關(guān)系

隨訪3年，甲狀腺癌患者累積生存率為70.15%(47/67)。miR-495-3p高表達(dá)組患者3年累積生存率為85.71%(30/35), 高于miR-495-3p低表達(dá)組的53.13%(17/32), 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=8.478,P=0.004); HJURP陽(yáng)性組患者3年累積生存率57.14%(24/42), 低于HJURP陰性組92.00%(23/25), 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=9.093,P=0.003)。見(jiàn)圖2。

A: miR-495-3p高表達(dá)和低表達(dá)患者生存曲線; B: HJURP陽(yáng)性組和陰性組患者生存曲線。圖2 甲狀腺癌組織中miR-495-3p、HJURP水平與患者預(yù)后的關(guān)系

2.5 甲狀腺癌患者預(yù)后不良的因素分析

根據(jù)甲狀腺癌患者術(shù)后3年復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移情況，將患者發(fā)生復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移定義為預(yù)后不良，未發(fā)生復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移定義為預(yù)后良好。單因素分析結(jié)果顯示，病理類型、分化程度、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、miR-495-3p、HJURP是影響甲狀腺癌患者預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素(P<0.05); 多因素分析結(jié)果顯示，臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、miR-495-3p、HJURP是影響甲狀腺癌患者預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05), 見(jiàn)表2。

表2 影響甲狀腺癌患者預(yù)后不良的因素分析

3 討 論

甲狀腺癌約占所有癌癥的1%, 在地方性結(jié)節(jié)性甲狀腺腫流行地區(qū)，甲狀腺癌的發(fā)病率尤其高[8]。目前，甲狀腺癌的發(fā)病原因尚未明確，但從流行病學(xué)、實(shí)驗(yàn)室研究及臨床觀察發(fā)現(xiàn)，可能與放射性損傷、甲狀腺病變、碘攝取異常、遺傳因素等有關(guān)。近年來(lái)研究[9]發(fā)現(xiàn)，原癌基因的激活突變或抑癌基因的異常失活在侵襲性甲狀腺腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用, miRNAs可能成為包括甲狀腺癌在內(nèi)的多種癌癥類型特定臨床病理特征相關(guān)的生物標(biāo)志物。研究[10]發(fā)現(xiàn), hsa-miR-139-5p的外源表達(dá)顯著降低了間變性甲狀腺癌細(xì)胞的遷移和增殖，在持續(xù)復(fù)發(fā)及局部轉(zhuǎn)移相關(guān)的原發(fā)腫瘤中表達(dá)下調(diào)，通過(guò)HNRNPF介導(dǎo)的選擇性剪接作用參與甲狀腺癌信號(hào)通路和腫瘤毒力調(diào)節(jié)機(jī)制。miRDB網(wǎng)站(http: //www.mirdb.org/)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，miR-495-3p與HJURP存在結(jié)合位點(diǎn)，提示可能在甲狀腺癌發(fā)生及病情進(jìn)展過(guò)程中共同發(fā)揮作用。本研究通過(guò)檢測(cè)miR-495-3p在甲狀腺癌組織中表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，miR-495-3p在癌組織中的表達(dá)水平低于正常甲狀腺組織，推測(cè)miR-495-3p在甲狀腺癌中可能發(fā)揮抑癌基因作用，進(jìn)一步分析miR-495-3p水平與甲狀腺癌患者臨床病理資料的關(guān)系發(fā)現(xiàn), miR-495-3p水平高低與患者年齡、性別、病理類型、分化程度無(wú)關(guān)，而臨床分期Ⅲ～Ⅳ、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的甲狀腺癌患者miR-495-3p水平較臨床分期Ⅰ～Ⅱ期、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者更低，表明miR-495-3p水平異常表達(dá)與甲狀腺癌患者腫瘤細(xì)胞增殖分化、遷移侵襲等有關(guān)，但具體作用機(jī)制尚不清楚。研究[11-12]發(fā)現(xiàn), miR-495-3p在結(jié)腸癌、前列腺癌中亦表達(dá)下調(diào)，可通過(guò)與其下游靶基因結(jié)合抑制腫瘤細(xì)胞增殖、遷移及侵襲作用，并受各自信號(hào)通路調(diào)節(jié)，由此推測(cè)miR-495-3p在甲狀腺癌中發(fā)揮相似的抑癌作用，并通過(guò)激活信號(hào)通路參與甲狀腺癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程。

HJURP是G1早期階段著絲粒CENP-A沉積的唯一伴侶，已被證明是DNA結(jié)合和磷酸化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，參與染色體分離、細(xì)胞分裂等調(diào)控作用[13]。研究[14]發(fā)現(xiàn), DNA損傷誘導(dǎo)后, HJURP表達(dá)顯著上調(diào)，與DNA修復(fù)因子發(fā)揮協(xié)同作用。HJURP在腫瘤細(xì)胞中的作用越來(lái)越受到關(guān)注。本研究結(jié)果顯示，甲狀腺癌組織中HJURP陽(yáng)性表達(dá)率高于正常甲狀腺組織，表達(dá)水平與腫瘤臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，與HJURP在其他腫瘤中的表達(dá)趨勢(shì)一致[15-16]。研究[17]認(rèn)為, HJURP通過(guò)上調(diào)鞘氨醇基酶1(SPHK1)參與肝癌細(xì)胞遷移和侵襲過(guò)程，且高表達(dá)HJURP預(yù)示肝細(xì)胞癌患者較低無(wú)病生存期和較高微血管浸潤(rùn)風(fēng)險(xiǎn)。生存分析發(fā)現(xiàn), miR-495-3p高表達(dá)和HJURP陰性的甲狀腺癌患者具有更高的3年累積生存率，提示檢測(cè)miR-495-3p、HJURP可能對(duì)評(píng)估甲狀腺癌患者預(yù)后有幫助。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、miR-495-3p、HJURP是影響甲狀腺癌患者預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，臨床分期Ⅲ～Ⅳ期、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、miR-495-3p低表達(dá)、HJURP高表達(dá)使甲狀腺癌患者術(shù)后發(fā)生復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)增加，表明miR-495-3p、HJURP可能作為甲狀腺癌患者預(yù)后的潛在生物指標(biāo)。

綜上所述，在甲狀腺癌組織中miR-495-3p表達(dá)下調(diào), HJURP表達(dá)上調(diào)，表達(dá)水平與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，可能作為甲狀腺癌患者預(yù)后不良的潛在標(biāo)志物，具體作用方式有待進(jìn)一步研究。miR-495-3p、HJURP表達(dá)水平與甲狀腺癌發(fā)生及患者預(yù)后的關(guān)系尚不能定論，下一步需增加細(xì)胞功能或動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)，繼續(xù)探討兩者是否有治療甲狀腺癌的潛在價(jià)值。