過表達乙酰肝素酶對膽囊癌細胞增殖及PI3K/AKT信號通路的影響

聞 波, 劉子祥, 張子艷, 陳佳偉, 王鄭林, 周少波

(蚌埠醫學院第二附屬醫院 普外科, 安徽 蚌埠, 233000)

膽囊癌是一種侵襲性強、致死率高的惡性腫瘤，其早期缺乏典型的體征和癥狀，多數患者確診時已處于晚期[1-2]。目前，手術是有效的治療手段，對于不能通過手術切除的膽囊癌患者, 5年生存率僅為10%左右[3], 而化療或放療對晚期患者并未產生明顯的作用。膽囊癌的發生是在不同的進化階段由連續的基因改變引起的，探索膽囊癌發病的分子機制對于建立膽囊癌新的治療途徑至關重要。乙酰肝素酶(HPSE)是一種內糖苷酶，可特異性地降解細胞外基質(ECM)成分硫酸乙酰肝素(HS)，其與腫瘤的發生、生長、轉移和化療耐藥等有關[4]。臨床研究[5-7]發現, HPSE在乳腺惡性腫瘤、多發性骨髓瘤、肉瘤等多種腫瘤中表達升高。研究[8]表明, HPSE過表達促進了人膽囊癌細胞GBC-SD的增殖和遷移，但其具體作用機制尚不完全清楚。研究結果[9]顯示，磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白質絲氨酸蘇氨酸激酶(PI3K/AKT)信號通路在大部分腫瘤細胞中呈激活狀態，從而促進細胞的增殖。為了解HPSE過表達在膽囊癌發生發展中的作用及PI3K/AKT 通路對GBC-SD細胞生物學特性的影響，本研究利用脂質體法構建HPSE過表達的膽囊癌細胞系GBD-SD, 應用PI3K/AKT信號通路抑制劑LY294002作用于GBC-SD細胞，探究其對膽囊癌細胞增殖的影響及其可能的分子機制，現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

人GBC-SD細胞株購自中國科學院細胞庫(中國上海)。胎牛血清(FBS)、培養基RPMI-1640購自Gibco公司, 質粒pcDNA3.1購自北諾生物科技有限公司(中國上海), PCR引物、Prime Script one step RT-PCR試劑盒購自Fermentas公司, 胰酶、RIPA細胞裂解液購自Hyclone公司, BCA蛋白定量試劑盒、MTT試劑盒、SDS-PAGE凝膠以及ECL試劑盒均購自上海碧云天公司, Trizol 試劑、Lipo-fectamin 2000購自美國Invitrogen公司, 兔抗人HPSE、PI3K、AKT、p-PI3K、p-AKT多抗、內參β-actin抗體以及對應二抗購自美國Affinity公司, LY294002購自MCE公司。

1.2 方法

1.2.1 GBD-SD穩定轉染細胞株的構建與鑒定: 在美國生物技術信息中心(NCBI)中檢索到HPSE基因序列ID為ENSG00000225609.1, 經過變性、退火處理將合成的單鏈DNA變為雙鏈DNA, 將含有特定序列的pGPU6/GFP/Neo載體導入大腸埃希菌，在37 ℃的常溫下培養12 h, 提取大腸埃希菌中的質粒，并確定該質粒的DNA序列。成功構建人HPSE基因過表達載體后，檢測驗證，最后將pcDNA3.1-HPSE載體轉染到GBD-SD細胞中，并用抗生素篩選得到含有重組載體的穩定轉染細胞株。

1.2.2 細胞培養、分組和轉染: 將GBC-SD細胞在添加10%胎牛血清的培養基RPMI-1640中培養，培養箱CO2濃度為5%, 溫度為37 ℃。當單層貼壁的細胞鋪滿瓶底約80%時，加入胰酶于培養瓶中進行消化與傳代。將細胞分為GBC-SD組(HPSE正常表達)和GBD-SD組(HPSE過表達)。GBC-SD組不給予任何處理, GBD-SD組按照Lipofectamine 2000轉染試劑說明書將載體轉染到GBC-SD中獲得。

1.2.3 實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)測定細胞中HPSE的表達: 細胞中總RNA用Trizol試劑提取，接下來將總 RNA反向轉錄成cDNA。根據制造商說明書，采用SYBRGreen方法通過qRT-PCR擴增目標基因。HPSE引物: 正向引物為5′-CCT-CAT-CCT-CCT-GGG-TTC-TC-3′, 反向引物為5′-AGG-AGG-CAT-TGC-TGA-TGA-TC-3′, β-actin引物: 正向引物為5′-AGC-GAG-CAT-CCC-CCA-AAG-TT-3′, 反向引物為5′-GGG-CAC-GAA-GGC-TCA-TCA-TT-3′。PCR熱循環的條件: 95 ℃下5 min, 接下來經歷以下40個循環(95 ℃下45 s, 60 ℃下45 s, 72 ℃下60 s)。采用2-△△Ct法測定HPSE基因表達，所有PCR實驗重復3次。

1.2.4 Western blot測定蛋白水平: 使用RIPA裂解液分離細胞總蛋白后通過BCA法定量。按步驟進行電泳、轉膜和封閉(5%的脫脂牛奶)，然后將膜與兔抗人的HPSE(1∶1000)、PI3K(1∶1 000)、AKT(1∶1 000)、p-PI3K(1∶1 000)和p-AKT(1∶1 000)一抗在4 ℃下過夜。使用TBST清洗膜3次(每次清洗10 min), 而后在25 ℃下孵育二抗(山羊抗兔IgG, 稀釋度1∶5 000)60 min。最后對膜進行化學發光檢測，并使用Image J軟件定量條帶強度，每個實驗分別進行3次。

1.2.5 細胞增殖實驗: ① MTT法。將細胞以2×103個/孔的密度接種在96孔板上，每組設5個復孔。在37 ℃、5%CO2的培養箱中分別培養24、48、72 h, 并向每孔中添加MTT溶液5 mg/mL, 再孵育4 h。接下來倒出培養基，向每孔中添加150 μL的二甲基亞砜(DMSO), 10 min后晶體全部溶解，最后測量每孔的光密度(OD)值，每個實驗進行3次。② 集落形成實驗。將細胞以1×103個/孔的密度接種在6孔板上，每組設5個復孔，在RPMI-1640培養基(含10%FBS)中培養，以允許菌落形成。培養14 d后，采用PBS沖洗細胞集落3次，在室溫下用4%多聚甲醛固定25 min后用結晶紫染色15 min。最后，對染色的菌落進行成像和計數以反映每組細胞的增殖能力。

1.3 統計學處理

采用SPSS 20.0軟件和GraphPad Prism 8.0軟件分析數據，結果以均數±標準差表示，采用t檢驗、單因素方差分析比較2組和多組間的差異。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 HPSE在膽囊癌細胞系GBC-SD和GBD-SD中的表達

qRT-PCR和Western blot結果顯示，經轉基因過表達后的GBD-SD中HPSEmRNA和蛋白相對表達量較GBC-SD升高，差異有統計學意義(P<0.01), 見圖1。

A: qRT-PCR檢測結果; B: Western blot檢測結果; C: HPSE蛋白的相對表達量。與GBC-SD比較, ??P<0.01圖1 HPSE在膽囊癌細胞系GBC-SD和GBD-SD中的表達

2.2 HPSE過表達對膽囊癌細胞系GBC-SD細胞增殖的影響

MTT結果表明, GBC-SD組細胞在24、48、72 h的OD值依次為(0.32±0.03)、(0.45±0.03)、(0.63±0.02), 而GBD-SD組細胞在24、48、72 h的OD值依次為(0.49±0.04)、(0.64±0.03)、(0.87±0.04)。GBD-SD組細胞的OD值高于GBC-SD組，差異有統計學意義(P<0.05)。集落形成實驗顯示, GBC-SD組、GBD-SD組細胞經培養14 d后集落形成數分別為(69.33±2.52)、(152.33±5.13), 差異有統計學意義(P<0.01), 提示HPSE過表達后顯著促進了膽囊癌細胞的增殖。見圖2。

2.3 HPSE過表達對PI3K/AKT信號通路的影響

通過Western blot檢測發現，與GBC-SD組細胞相比，GBD-SD組細胞p-AKT、p-PI3K蛋白表達水平、p-AKT/AKT值和p-PI3K/PI3K值增加，差異有統計學意義(P<0.01), 而總AKT和總PI3K蛋白表達水平無明顯變化。上述結果提示上調GBC-SD細胞中HPSE基因的表達可以促進PI3K/AKT信號通路的活化。見圖3。

2.4 PI3K/AKT信號通路抑制劑LY294002對膽囊癌細胞系GBC-SD細胞增殖的影響

為進一步探索HPSE是否通過PI3K/AKT信號通路促進膽囊癌細胞系GBC-SD細胞的增殖，本研究將PI3K特異性抑制劑LY294002(10 μmol/L)處理GBC-SD細胞2 d后，通過MTT法和集落形成實驗分析GBC-SD組和LY294002組細胞的增殖情況。結果顯示, GBC-SD組和LY294002組中細胞的OD值分別為(0.53±0.05)、(0.32±0.01),差異有統計學意義(P<0.05)。集落形成實驗結果表明, GBC-SD組和LY294002組中細胞在培養14 d后集落形成率分別為(64.67±3.51)、(24.33±1.53)%, 差異有統計學意義(P<0.01)。Western blot檢測2組細胞p-AKT和AKT 蛋白表達情況，結果顯示GBC-SD組和LY294002組中細胞p-AKT/AKT分別為(0.96±0.02)、(0.57±0.06), 差異有統計學意義(P<0.05)。上述結果表明，抑制劑LY294002能夠抑制GBC-SD細胞的增殖，HPSE促進GBC-SD細胞的增殖可能與PI3K/AKT通路有關。見圖4。

A: MTT檢測結果; B: 細胞集落形成實驗結果; C: 菌落計數結果。與GBC-SD比較, ?P<0.05, ??P<0.01。圖2 HPSE過表達對GBC-SD細胞增殖的影響

A: Western blot檢測結果; B: p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT表達情況。與GBC-SD比較, ??P<0.01。圖3 HPSE過表達對PI3K/AKT信號通路的影響

3 討 論

目前，膽囊癌在膽道惡性腫瘤中所占比率約為90%, 其整體發病率約為1%[10]。積極尋找膽囊癌發生發展及侵襲轉移的分子機制，對于膽囊癌早期診斷、干預及治療意義重大。HPSE基因在正常人的組織內主要分布在胎盤、淋巴器官等免疫組織，而在腫瘤尤其是惡性腫瘤組織中卻有著廣泛的分布。HPSE是唯一的一種能夠水解蛋白多糖的HS鏈的酶，其特定的糖苷鍵是細胞外基質和細胞表面的關鍵組成部分[11]。腫瘤細胞突破由基底膜(BM)和ECM組成的天然屏障是其進展和轉移的關鍵過程。

在腫瘤發生發展過程中, HPSE對HS的降解與細胞表面和細胞外基質重塑以及HS結合信號分子的釋放有關，可促使癌細胞生長、遷移、侵襲和血管生成[12]。研究[13]表明, HPSE基因表達與胃癌、乳腺癌、多發性骨髓瘤等惡性腫瘤的生長有關，例如HPSE在人膀胱的尿道上皮癌中過表達，并且HPSE的表達水平與膀胱癌的復發相關[14]。BARASH U等[15]研究發現HPSE的過度表達促進了膠質瘤細胞的侵襲和生長，表明HPSE不僅具有促進膠質瘤細胞局部侵襲的酶活性，而且還促進了膠質瘤病灶的生長。研究[16-17]報道抑制HPSE的表達可抑制乳腺癌、肝癌、膀胱癌等腫瘤細胞的侵襲、遷移和黏附能力。PI-88[18]、SST0001[19]、M402[20]等HPSE抑制劑為腫瘤的治療提供了多種選擇。研究[8, 21]顯示, HPSE在膽囊癌組織中表達異常，與膽囊癌的進展有關，作者前期研究中發現上調HPSE基因可以顯著促進膽囊癌細胞的增殖。但目前關于HPSE在膽囊癌增殖方面的調控機制并不明確，揭示其潛在的分子機制對膽囊癌的診斷及針對基因方面的治療具有重要意義。

A: MTT檢測結果; B: 細胞集落形成實驗結果; C: 菌落計數結果; D: Western blot檢測結果; E: p-AKT/AKT值。與GBC-SD比較, ?P<0.05, ??P<0.01。圖4 PI3K/AKT信號通路抑制劑對GBC-SD細胞增殖的影響

近年來，研究[22-24]顯示PI3K/AKT通路是一種參與人體細胞周期調控的關鍵信號通路，細胞靜止、增殖和癌細胞活力之間存在直接關系，該信號通路的過度激活已被證明有助于各種人類惡性腫瘤的增殖和進展。當PI3K/AKT信號通路被各種細胞因子和生長因子激活后作用于PI3K促進二磷酸腺苷轉化為三磷酸肌醇，進而導致PI3K/AKT信號通路的下游作用因子AKT的激活，使得p-AKT比率升高，調控其下游分子，從而參與胰腺癌、乳腺癌、胃腸道腫瘤和黑色素瘤等多種腫瘤細胞的增殖和凋亡過程[25-28]。成纖維細胞生長因子2(FGF2)是上皮間質轉換(EMT)的關鍵觸發因子。作者前期研究[8]已經證實HPSE通過其酶活性切割硫酸乙酰肝素蛋白多糖的HS側鏈，刺激FGF2等生長因子和細胞因子的釋放，進而誘導膽囊癌細胞發生EMT, 增強其增殖及遷移能力。有研究[29-30]分析表明HPSE的上調可顯著促進FGF2的表達, 相反，觀察到HPSE沉默介導FGF2的減少, HPSE能夠通過上調FGF2的表達而激活PI3K/AKT信號通路，誘導腫瘤細胞增殖、侵襲和遷移。由此可見, FGF2是聯系HPSE和PI3K/AKT信號通路最重要的細胞生長因子，過表達HPSE可能通過PI3K/AKT信號通路促進腫瘤細胞的增殖。

鑒于PI3K/AKT信號通路對癌細胞的生長、侵襲和轉移至關重要，作者分析了過表達HPSE對PI3K/AKT信號通路的作用。本研究結果表明，與正常表達HPSE的GBC-SD細胞相比，過表達HPSE可顯著提高p-PI3K、p-AKT的蛋白水平并促進了膽囊癌細胞的增殖，但PI3K、AKT總量無顯著變化，提示HPSE可以激活GBC-SD細胞的PI3K/AKT通路。為了證實上述結果，作者使用LY294002處理GBC-SD細胞，觀察到LY294002處理后對p-PI3K、p-AKT蛋白水平有明顯的抑制作用。但與未經抑制劑處理的GBC-SD細胞相比，總PI3K、AKT的蛋白水平仍無顯著變化。由此可見，HPSE能夠促進膽囊癌細胞的增殖，而LY294002可抑制HPSE的促增殖作用。

綜上所述，本研究證實了PI3K/AKT信號通路在過表達HPSE促進人膽囊癌細胞系GBC-SD細胞增殖過程中起著關鍵的調控作用，為HPSE在人膽囊癌的治療提供了新的分子靶點和用藥新思路。