微小RNA-508-3p靶向調控配對盒基因2影響肺癌細胞生物學特性的分子機制研究

張吉炯, 張 健

(湖北省黃石市中心醫院普愛院區, 湖北 黃石, 435000)

肺癌是臨床最常見的惡性腫瘤之一，主要治療途徑為外科手術、放療、化療及生物靶向治療，但治療后易復發或轉移，患者5年生存率低、病死率高(主要原因為腫瘤的持續增殖及轉移)[1-2]。因此，研究肺癌的分子機制并尋找新的治療靶點具有重要意義。微小RNA(miRNA)是高度保守的小型非編碼RNA，長度為20～25個核苷酸，其可通過與mRNA的3′非翻譯區(3′UTR)互補結合而沉默靶基因的表達，導致mRNA被降解或翻譯被抑制，與癌癥的發生發展有關[3]。微小RNA-508-3p(miR-508-3p)在胃癌[4]、卵巢癌[5]中表達下調并發揮腫瘤抑制功能，但其在肺癌中的作用尚不明確。配對盒基因2(PAX2)是PAX轉錄因子家族成員之一，在食管癌、前列腺癌等多種腫瘤中表達升高，可促進腫瘤細胞生長，參與腫瘤的發生發展[6]。研究[7]報道,PAX2在肺癌中表達升高，且淋巴結轉移組PAX2表達高于非淋巴結轉移組，提示PAX2可能影響肺癌細胞生長。小干擾RNA(siRNA)是近年來研究基因沉默的重要工具，可特異性抑制相應靶基因mRNA表達，進而降解靶基因，也稱為轉錄后調控，目前已被廣泛應用于腫瘤治療、基因功能研究等多方面[8-9]。本研究檢測肺癌組織miR-508-3p、PAX2表達水平，探討miR-508-3p對肺癌細胞增殖活力、侵襲能力、凋亡的影響及對PAX2的調控作用與機制，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 標本及細胞

收集2018年6月—2019年3月本院胸外科手術切除的肺癌組織標本，同時收集相應的癌旁組織(距離腫瘤邊緣1～3 cm)為對照，標本共來自43例患者，其中男20例、女23例，年齡36～70歲，平均58.4歲。所有患者經病理學檢查確認病理類型為腺癌，且均為首次治療，術前未接受放療、化療及其他抗癌治療。所有組織標本經手術切除后置于液氮罐中保存備用。本研究已獲得患者知情同意，并經醫院倫理委員會審核批準。人肺腺癌A549細胞購自美國模式培養物集存庫(ATCC)。

1.2 主要試劑和儀器

胎牛血清(FBS)及RPMI1640培養基均購自美國Gibco公司; PAX2、基質金屬蛋白酶-2(MMP-2)、B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)和Bcl-2相關X蛋白(Bax)抗體均購自美國Abcam公司; 二喹啉甲酸(BCA)試劑盒購自中國碧云天公司; 聚偏氟乙烯(PVDF)膜購自上海生工生物工程有限公司; 噻唑藍(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)購自美國Sigma公司; 蛋白質印跡法(Western blotting)細胞裂解液購自美國Promega公司; Transwell小室購自美國corning costar公司; 細胞凋亡試劑盒及流式細胞儀均購自美國BD公司; 酶標儀購自美國Biotek公司; CO2細胞培養箱購自美國Thermo公司。

1.3 細胞培養及轉染

取出保存在液氮罐中的A549細胞，迅速解凍后在CO2體積分數為5%、37 ℃細胞培養箱中，用含10%FBS的RPMI1640培養基培養細胞。取對數生長期細胞，轉染前1 d, 接種細胞于24孔細胞培養板，接種密度為3×104個/mL, 用含10% FBS的RPMI1640培養基培養，次日，觀察到細胞貼壁，且生長密度達60%～70%時，使用Opti-MEM培養基分別稀釋si-PAX2(轉染PAX2特異性siRNA，si-PAX2組)、si-NC(轉染陰性對照siRNA, si-NC組)和轉染試劑，設置加脂質體的為空白組, 5 min內將siRNA與轉染試劑混合，室溫靜置20 min, 將混合液加入培養板相應孔內，將細胞置于培養箱內常規培養, 6～8 h后，將轉染液棄去，加含10% FBS的RPMI1640培養基培養。具體操作步驟參照美國Invitrogen生產的Lipofectamie 2 000轉染試劑的操作說明。同法轉染miR-508-3p(轉染miR-508-3p模擬物, miR-508-3p組)、miR-NC(轉染模擬物陰性對照miR-NC，miR-NC組)、anti-miR-508-3p(轉染miR-508-3p抑制劑, anti-miR-508-3p組)、anti-miR-NC(轉染抑制劑陰性對照anti-miR-NC，anti-miR-NC組)、miR-508-3p+pcDNA-PAX2(共轉染miR-508-3p和PAX2過表達質粒pcDNA-PAX2, miR-508-3p+pcDNA-PAX2組)、miR-508-3p+pcDNA-NC(共轉染miR-508-3p和空白質粒pcDNA-NC，miR-508-3p+pcDNA-NC組)。48 h后采用定量聚合酶鏈反應(qPCR)法或Western blotting檢測轉染后的細胞miR-508-3p或PAX2表達。

1.4 qPCR檢測miR-508-3p、PAX2 mRNA表達

根據制造商的規程，使用TRIzol試劑提取組織或細胞總RNA。使用PrimeScript RT Reagent Kit合成互補DNA。使用SYBR Green qPCR Master Mix在ABI 7500系統上進行qPCR反應。使用的引物序列如下: miR-508-3p正向5′-CAAGCATGATTGTAGCCTTTTG-3′, 反向5′-TATC

GTTGTACTCCAGACCAAGAC-3′; U6小核RNA(snRNA)正向5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′, 反向5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。PAX2正向5′-CCTGGCCACACCATTGTTC-3′, 反向5′-TCACGTTTCCTCTTCTCACCAT-3′; GAPDH正向5′-CTCAAGATCATCAGCAATGCC-3′, 反向5′-GGTCATGAGTCCTTCCACGATAC-3′。使用2-ΔΔCt方法，以U6 snRNA和GAPDH作為內部對照分析miR-508-3p、PAX2mRNA相對表達水平。

1.5 Western blotting檢測蛋白表達

采用蛋白提取試劑盒提取組織或細胞總蛋白，以BCA法定量蛋白，蛋白于100 ℃變性8 min, 每孔道上樣等量蛋白，進行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE), 電泳結束后將蛋白轉膜至PVDF膜，膜置于5%脫脂奶粉溶液中封閉，室溫搖床上慢搖1.5 h, 根據預染marker將PVDF膜含PAX2、MMP-2、Bcl-2和Bax的部分依次剪下，放入一抗溶液中(稀釋倍數1∶1 000), 4 ℃孵育過夜, TBST緩沖液洗膜，隨后于二抗溶液中室溫孵育45 min, 洗膜，電化學發光(ECL)顯影，曝光拍照。用ImageJ軟件定量強度，內參為GAPDH。實驗重復3次。

1.6 MTT法檢測細胞增殖活力

胰酶消化對數生長期A549細胞，制備成細胞懸液，并調整濃度為1×104個/mL, 按照5×103個/孔接種細胞于96孔板，每孔加100 μL, 每個樣本設置5個平行孔，于培養48 h吸掉培養液，每孔中加10 μL MTT溶液，溫育4 h, 中加150 μL DMSO, 平板搖床上搖勻后，采用酶標儀于490 nm處測定光密度(OD)值。

1.7 Transwell小室檢測細胞侵襲能力

將Transwell小室置于24孔板內，向每孔中加100 μL已配置好的基質膠工作液，來回晃動培養板，及時將氣泡去除，使基質膠均勻包被在小室的上室，于培養箱中常規培養1 h。用胰酶消化經si-PAX2處理48 h的A549細胞，制備成單細胞懸液，計數。小室上室中加300 μL細胞懸液(5×105個細胞)，相應的每孔下室中加600 μL含FBS的完全培養基，然后放入培養箱中常規培養。24 h后，取出Transwell小室，使用棉簽輕輕擦掉上室內細胞、液體及基質膠。用甲醇固定, 0.1%結晶紫染色, 15～20 min后，用PBS緩沖液將多余結晶紫洗去，風干。倒置顯微鏡下觀察小室外底膜上染色后呈現的陽性細胞，拍照。顯微鏡下隨機選擇5個視野，取均值，實驗重復3次。

1.8 流式細胞術檢測細胞凋亡率

以1×105個/孔密度接種對數生長期A549細胞于6孔細胞培養板中, 24 h吸棄原有培養基，轉染si-PAX2, 48 h后，用胰酶消化細胞，消化終止后將細胞轉移至流式管，離心，收集細胞。加500 μL結合緩沖液重懸細胞，然后加5 μL 碘化丙啶(PI), 混勻，再加入5 μL 膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC), 混勻，室溫避光孵育15 min, 以流式細胞術儀檢測分析。實驗重復3次。

1.9 雙熒光素酶活性檢測

分別構建含有miR-508-3p結合位點的PAX2-3′UTR-野生型(WT)及突變型(MUT)報告基因載體，在A549細胞中轉染miR-508-3p和PAX2-3′UTR-WT及MUT報告基因載體。48 h后收集細胞采用雙熒光素酶報告基因檢測系統檢測熒光素酶活性。

1.10 統計學分析

2 結 果

2.1 肺癌組織中miR-508-3p、PAX2mRNA、PAX2蛋白表達水平和相關性分析

與癌旁組織比較，肺癌組織中miR-508-3p相對表達水平降低,PAX2mRNA相對表達水平和PAX2蛋白表達水平升高，差異有統計學意義(P<0.05); PAX2蛋白表達水平與miR-508-3p表達水平呈顯著負相關(P<0.05)。見圖1。

A: miR-508-3p相對表達水平柱狀圖; B: PAX2 mRNA相對表達水平柱狀圖; C: PAX2蛋白表達水平柱狀圖; D: PAX2蛋白Western blotting條帶圖; E: PAX2蛋白與miR-508-3p的相關性分析圖。與癌旁組織比較, ?P<0.05。圖1 miR-508-3p、PAX2 mRNA、PAX2蛋白表達水平和相關性分析

2.2 轉染miR-508-3p對肺癌A549細胞增殖活力、侵襲能力和細胞凋亡的影響

與空白組比較, miR-508-3p組miR-508-3p、Bax表達水平和細胞凋亡率均升高, MMP-2、Bcl-2蛋白表達水平和增殖活力(OD值)、侵襲能力均降低，差異有統計學意義(P<0.05); miR-NC組與空白組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。由此提示，轉染miR-508-3p可抑制肺癌A549細胞增殖活力和侵襲能力，誘導細胞凋亡。見圖2、表1。

2.3 si-PAX2對肺癌A549細胞增殖活力、侵襲能力和細胞凋亡的影響

與si-NC組比較, si-PAX2組PAX2、MMP-2、Bcl-2表達水平降低, Bax表達水平、凋亡率升高，增殖活力和侵襲能力降低，差異有統計學意義(P<0.05), 提示使用設計合成的PAX2特異性siRNA轉染48 h, 可抑制肺癌A549細胞增殖活力和侵襲能力，誘導細胞凋亡。見圖3、表2。

2.4 miR-508-3p對PAX2的靶向調控作用

Starbase預測結果顯示, miR-508-3p含有PAX2的互補序列，見圖4A。雙熒光素酶活性檢測和Western blotting檢測結果顯示，與miR-NC組比較, miR-508-3p組轉染PAX2-3′UTR-WT的A549細胞熒光素酶活性降低, PAX2表達水平降低，差異有統計學意義(P<0.05); miR-508-3p組轉染PAX2-3′UTR-MUT的A549細胞熒光素酶活性與miR-NC組比較，差異無統計學意義(P>0.05); anti-miR-508-3p組PAX2表達水平高于anti-miR-NC組，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖4B、表3、表4。由此提示, miR-508-3p可靶向PAX2基因，調控PAX2蛋白表達水平。

2.5 PAX2逆轉miR-508-3p對肺癌A549細胞增殖活力、侵襲能力、細胞凋亡的影響

與miR-508-3p+pcDNA-NC組比較, miR-508-3p+pcDNA-PAX2組PAX2、MMP-2、Bcl-2表達水平升高, Bax表達水平、細胞凋亡率降低，增殖活力和侵襲能力升高，差異均有統計學意義(P<0.05), 表明PAX2可以逆轉miR-508-3p對肺癌A549細胞增殖活力、侵襲能力及細胞凋亡的影響。見圖5、表5。

A: 3組miR-508-3p相對表達水平(與空白組比較, ?P<0.05); B: 3組細胞凋亡情況的流式細胞儀檢測結果; C: 3組細胞侵襲情況的Transwell檢測結果; D: 3組MMP-2、Bcl-2和Bax蛋白Western blotting條帶圖。圖2 轉染miR-508-3p對肺癌A549細胞增殖活力、侵襲能力、細胞凋亡的影響

表1 空白組、miR-NC組、miR-508-3p組蛋白表達、細胞增殖活力、侵襲能力和細胞凋亡結果比較

A: 2組細胞凋亡情況的流式細胞儀檢測結果; B: 2組細胞侵襲情況的Transwell檢測結果; C: 2組PAX2、MMP-2、Bcl-2和Bax蛋白Western blotting條帶圖。圖3 si-PAX2對肺癌A549細胞侵襲能力和蛋白表達的影響

表2 si-NC組、si-PAX2組蛋白表達、細胞增殖活力、侵襲能力和細胞凋亡結果比較

A: PAX2與miR-508-3p結合的starbase預測圖; B: 4組PAX2蛋白Western blotting條帶圖。圖4 miR-508-3p靶向調控PAX2的預測圖和PAX2蛋白表達水平

表3 miR-NC組、miR-508-3p組雙熒光素酶活性檢測結果

表4 4組PAX2蛋白表達水平比較

3 討 論

miR-508-3p是多種腫瘤的重要調節因子，研究[10]報道, miR-508-3p模擬物可抑制卵巢癌細胞增殖、遷移和侵襲。miR-508-3p在三陰性乳腺癌組織和細胞中表達顯著降低，miR-508-3p過表達通過上調鋅指E-盒結合同源異形盒-1(ZEB1)顯著抑制三陰性乳腺癌細胞的侵襲能力[11]。本研究結果發現, miR-508-3p在肺癌中同樣低表達，其過表達具有抑制肺癌細胞增殖、侵襲以及促進凋亡的作用，提示miR-508-3p作為肺癌的腫瘤抑制因子參與肺癌進展。

A: 2組細胞凋亡的流式細胞儀檢測結果; B: 2組細胞侵襲數量的Transwell檢測結果; C: 2組PAX2、MMP-2、Bcl-2和Bax蛋白Western blotting條帶圖。圖5 2組細胞凋亡、侵襲能力和蛋白表達結果

表5 2組蛋白表達、細胞增殖活力、侵襲能力及細胞凋亡情況比較

研究[12]顯示, miRNA通過靶向靶mRNA發揮細胞功能。本研究發現，肺癌組織中PAX2蛋白表達與miR-508-3p呈顯著負相關，且Starbase生物信息預測結果和雙熒光素酶報告實驗確定PAX2為miR-508-3p的下游靶基因，且miR-508-3p負調控PAX2蛋白表達。PAX2定位于人類10號染色體q24-25上，是一種重要的轉錄因子，在發育成熟組織中，異常表達的PAX2可呈現致癌作用[13-14]。近年來，相關研究[15-16]報道了PAX2在卵巢癌、急性髓性白血病等疾病中的表達水平，并發現PAX2在不同腫瘤中可能發揮不同作用。本研究收集43例患者的肺癌組織標本，采用Western blotting檢測組織中PAX2表達，結果顯示肺癌組織中PAX2表達水平顯著高于癌旁組織，與既往研究[4]結論一致。張麗萍等[17]研究顯示，用PAX2siRNA轉染子宮內膜癌HEC-1A細胞，可明顯抑制癌細胞增殖，促進細胞凋亡。UEDA T等[18]研究顯示, PAX2可通過對HGF的轉錄調控而增強前列腺癌細胞的侵襲能力。由此推測，抑制PAX2表達或可影響肺癌細胞生長。本研究用設計合成的PAX2特異性siRNA轉染肺癌A549細胞，轉染后的細胞PAX2表達水平顯著降低，進一步行生物學特性研究發現, PAX2表達被抑制后的A549細胞增殖能力和侵襲能力均顯著降低，凋亡率顯著升高。本研究還發現,PAX2可以逆轉miR-508-3p對A549細胞增殖活力、侵襲能力以及細胞凋亡的影響，提示miR-508-3p對肺癌細胞的抑制作用與下調PAX2表達有關。

基質金屬蛋白酶(MMP)是一個大家族，幾乎能降解細胞外基質中的各種蛋白成分，在腫瘤侵襲及轉錄過程中發揮著關鍵性作用[19-20]。MMP-2為MMP家族成員之一，是腫瘤侵襲轉移的標志分子，多項研究[21-22]表明，抑制MMP-2表達可降低肺癌細胞侵襲和轉移能力，但PAX2能否通過調節MMP-2影響肺癌細胞侵襲能力尚未明確。在細胞凋亡過程中, Bcl-2和Bax分別發揮抑凋亡作用和促凋亡作用，兩者可形成同源二聚體(Bcl-2/Bcl-2, Bax/Bax)或異源二聚體(Bcl-2/Bax), 從而促進或抑制細胞凋亡, Bcl-2和Bax是細胞死亡的關鍵調節因素[23-24]。多項研究[25-26]表明，調節肺癌細胞Bcl-2和Bax表達可影響癌細胞凋亡。本研究用miR-508-3p模擬物或PAX2特異性siRNA轉染肺癌A549細胞后，采用Western blotting檢測MMP-2、Bcl-2和Bax表達，結果顯示, MMP-2和Bcl-2表達降低, Bax表達升高。由此提示，過表達miR-508-3p或抑制PAX2表達可通過下調MMP-2、Bcl-2表達和上調Bax表達影響肺癌細胞侵襲能力和凋亡。

綜上所述, miR-508-3p在肺癌組織中低表達,PAX2在肺癌組織中高表達，過表達miR-508-3p通過靶向抑制肺癌A549細胞PAX2表達而降低細胞增殖和侵襲能力，誘導細胞凋亡，提示miR-508-3p和PAX2可能是肺癌治療的潛在靶標。