下調長鏈非編碼RNA HOXA-AS3靶向促進微小RNA-29b對結腸癌細胞LOVO凋亡和奧沙利鉑敏感性的影響

游 進, 張 佳, 徐 飛, 王志偉

(山東省青島市中心醫院 結直腸肛門外科, 山東 青島, 266042)

結腸癌是一種發病率較高的消化系統惡性腫瘤，手術切除、放化療等是目前臨床上常見的治療手段[1]。奧沙利鉑是常見胃腸消化系統惡性腫瘤的治療藥物，具有毒性低和高效的特點[2]。但奧沙利鉑對血液、神經等具有一定的毒副作用，這限制了奧沙利鉑的長期使用，提高腫瘤細胞奧沙利鉑敏感性對于腫瘤的治療具有重要意義[2]。長鏈非編碼RNA(lncRNA)的轉錄本長度超過200 nt, 其在真核生物細胞內存在，幾乎沒有編碼蛋白質的作用。lncRNA功能復雜，與染色質修飾、細胞分化、基因組印記、核內運輸、熱休克反應等有關[3]。lncRNA可以通過類似“miRNA海綿”或“miRNA隔離”作用調控微小RNA(miRNA)的表達[4]。研究[5]發現，lncRNA在腫瘤組織中異常表達, lncRNA不僅影響腫瘤細胞增殖、凋亡，還與腫瘤細胞抗腫瘤藥物敏感性有關，lncRNA可能是延長腫瘤患者生存時間的分子靶點。HOXA-AS3是與腫瘤有關的調節因子,HOXA-AS3促進膠質母細胞瘤細胞增殖，加快人肺腺癌細胞遷移，下調HOXA-AS3可增加非小細胞肺癌細胞順鉑敏感性[6-8]。目前HOXA-AS3在結腸癌細胞中的相關研究較少。本研究探討HOXA-AS3對結腸癌細胞增殖、凋亡和奧沙利鉑敏感性的影響及機制，為提高結腸癌患者奧沙利鉑敏感性提供參考思路。

1 材料與方法

1.1 材料

正常結腸上皮細胞NCM460購自弗元(上海)生物科技有限公司; siRNA control、HOXA-AS3siRNA、miR-29b mimics、mimics control、WT、MUT、inhibitor control、miR-29b inhibitor均由上海吉瑪制藥技術有限公司構建合成; 結腸癌細胞SW1116、HCT116購自上海瀚杭生物科技有限公司; Bax抗體購自美國Cell Signaling Technology; 結腸癌細胞LOVO購自武漢普諾賽生命科技有限公司; Bcl-2抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology; 結腸癌細胞SW620購自上海澤葉生物科技有限公司; 熒光素酶活性測定試劑盒購自美國GeneCopoeia。

1.2 實時聚合酶鏈反應方法檢測HOXA-AS3表達

用Trizol試劑提取結腸癌細胞LOVO、SW1116、HCT116、SW620和正常結腸上皮細胞NCM460中的總RNA, RNA樣品經過紫外分光光度計檢測OD260 nm/OD280 nm的比值為1.8～2.0, 將RNA保存在-80 ℃。在0.2 mL的PCR管內配制逆轉錄體系，將聚合酶鏈反應(PCR)管置于25 ℃孵育5 min, 42 ℃孵育30 min, 85 ℃孵育5 min, 然后放在4 ℃保存。以SYBR Green PCR master mix進行PCR反應，以為GAPDH為內參，根據2-△△Ct法計算HOXA-AS3表達水平。

1.3 細胞轉染和分組

利用Lipofectamine 2000在結腸癌細胞LOVO中分別轉染siRNA control、HOXA-AS3siRNA, 記為si-NC組和si-HOXA-AS3組。將轉染siRNA control、HOXA-AS3siRNA以后的結腸癌細胞LOVO分別用含有奧沙利鉑濃度為60 μg/mL的細胞培養液培養，記為L-OHP+si-NC組、L-OHP+si-HOXA-AS3組。設置常規培養的結腸癌細胞LOVO為control組。control組、si-NC組、si-HOXA-AS3組細胞培養48 h以后，按照1. 2中實時 PCR方法檢測HOXA-AS3表達。

1.3.1 四甲基偶氮唑藍(MTT)實驗檢測細胞增殖: 提前配制5 mg/mL的MTT溶液，過濾除菌后，放在4 ℃備用。將結腸癌細胞LOVO按照1×104個細胞/mL種植到96孔板內，每個孔內添加150 μL的細胞培養液，根據control組、si-NC組、si-HOXA-AS3組、L-OHP+si-NC組、L-OHP+si-HOXA-AS3組的分組方法處理培養，放在37 ℃常規培養48 h以后，在每個孔中添加20 μL的MTT溶液，繼續孵育4 h。吸棄孔中的液體，添加150 μL的二甲基亞砜溶液，孵育10 min后，用酶聯免疫檢測儀分析每個孔的OD值。細胞增殖活性用OD值表示。

1.3.2 流式細胞術檢測細胞凋亡: 根據control組、si-NC組、si-HOXA-AS3組、L-OHP+si-NC組、L-OHP+si-HOXA-AS3組的分組處理方法處理培養48 h以后，將細胞制備成單細胞懸浮液，每個檢測樣本含有5×105～1×106個細胞，離心，棄掉上清溶液，繼續添加195 μL的Annexin V-FITC結合緩沖液，混合后，添加5 μL的Annexin V-FITC, 室溫孵育10 min。離心，棄掉上清，添加190 μL的Annexin V-FITC結合緩沖液，繼續加入10 μL的PI, 混合后，放在避光條件下結合10 min。利用流式細胞儀檢測凋亡變化。

1.3.3 Western blot方法檢測Bax、Bcl-2蛋白表達: 根據control組、si-NC組、si-HOXA-AS3組、L-OHP+si-NC組、L-OHP+si-HOXA-AS3組的分組處理方法處理培養48 h以后，吸棄孔中的液體，加入磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次細胞，繼續添加RIPA溶液，超聲間斷破碎20 min。4 ℃, 12 000 g離心10 min, 將上清溶液轉移到EP管中，用BCA方法測定蛋白樣品的濃度。在蛋白樣品中按照體積比為4∶1的比例，添加5×Loading Buffer溶液，沸水浴5 min。選擇12 %的下層膠和5 %的上層膠進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。每個孔內加40 μg的蛋白樣品。在上層膠中設置80 V的電壓，在分離膠中設置120 V的電壓電泳，等到溴酚藍移動到凝膠的底部位置，結束電泳。裁剪PVDF膜，以100 V的電壓轉膜2 h。把PVDF膜浸泡在含有5%脫脂奶粉的洗膜緩沖液(TBST)中，室溫，搖床80 r/min離心1 h, 以TBST洗滌3次，每次5 min。將PVDF膜放在Bax、Bcl-2、GAPDH(內參)一抗稀釋液內, 4 ℃孵育過夜。將PVDF膜置于辣根過氧化物酶標記的二抗中，在室溫結合2 h。提前配制好ECL發光試劑，滴加至PVDF膜上，以ChemiDocXRS+顯像系統掃描條帶，Quantity One分析條帶的灰度值，以灰度值根據內參GAPDH分析Bax、Bcl-2蛋白表達水平。Bax、Bcl-2一抗均按照1∶1 000稀釋，二抗按照1∶2 000稀釋。

1.4 HOXA-AS3靶基因預測和鑒定

用生物信息學軟件starbase分析HOXA-AS3可能的靶miRNA，然后利用熒光素酶報告系統分析二者的靶向關系。在結腸癌細胞LOVO中分別將miR-29b mimics(miR-29b)、mimics control(miR-NC)和WT(含HOXA-AS3結合位點的熒光素酶報告載體)、MUT(含突變以后HOXA-AS3結合位點的熒光素酶報告載體)共轉染，繼續培養48 h以后，利用熒光素酶活性測定試劑盒分析細胞熒光素酶活性的變化。control組、si-NC組、si-HOXA-AS3組細胞培養48 h以后，按照1.2中實時 PCR方法檢測miR-29b表達，U6為內參。

1.5 miR-29b inhibitor對下調HOXA-AS3影響細胞增殖、凋亡影響

在結腸癌細胞LOVO中將HOXA-AS3siRNA、inhibitor control和HOXA-AS3siRNA、miR-29b inhibitor共轉染，記為si-HOXA-AS3+Anti-miR-NC組和si-HOXA-AS3+Anti-miR-29b組。同時將共轉染HOXA-AS3siRNA、inhibitor control和HOXA-AS3siRNA、miR-29b inhibitor后的結腸癌細胞LOVO以給予奧沙利鉑濃度為60 μg/mL的細胞培養液培養，命名為L-OHP+si-HOXA-AS3+ Anti-miR-NC組和L-OHP+si-HOXA-AS3+ Anti-miR-29b組。細胞培養48 h以后，根據1.3.1中MTT方法檢測細胞增殖，根據1.3.2中流式細胞術檢測細胞凋亡，根據1.3.3中Western blot方法檢測Bax、Bcl-2蛋白表達。

1.6 統計學分析

2 結 果

2.1 HOXA-AS3在結腸癌細胞中高表達

與正常結腸上皮細胞NCM460相比(1.00±0.11), 結腸癌細胞LOVO(3.62±0.24)、SW1116(2.51±0.23)、HCT116(2.04±0.13)、SW620(1.69±0.15)中HOXA-AS3表達水平均升高，差異有統計學意義(P<0.05)。選擇表達水平最高的結腸癌細胞LOVO進行后續研究。

2.2 HOXA-AS3 siRNA轉染下調結腸癌細胞LOVO中HOXA-AS3表達水平

與control組(1.00±0.12)、si-NC組(0.98±0.09)比較, si-HOXA-AS3組(0.35±0.03)結腸癌細胞LOVO中HOXA-AS3表達水平降低，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.3 下調HOXA-AS3促進奧沙利鉑抗結腸癌細胞LOVO增殖和凋亡誘導作用

與control組、si-NC組比較, si-HOXA-AS3組結腸癌細胞LOVO增殖活性降低，凋亡率升高，細胞中Bax蛋白表達水平升高, Bcl-2蛋白表達減少。與si-HOXA-AS3組、L-OHP+si-NC組比較, L-OHP+si-HOXA-AS3組結腸癌細胞LOVO增殖活性降低，凋亡率升高，細胞中Bax蛋白表達水平升高, Bcl-2蛋白表達減少。下調HOXA-AS3促進奧沙利鉑抗結腸癌細胞LOVO增殖和凋亡誘導作用。見圖1、表1。

2.4 下調HOXA-AS3靶向促進miR-29b表達

利用生物信息學軟件預測得到HOXA-AS3和miR-29b結合位點(圖2A)。熒光素酶報告系統鑒定二者的靶向關系, WT和miR-29b mimics共轉染后的結腸癌細胞LOVO熒光素酶活性降低(圖2B)。與control組、si-NC組比較，si-HOXA-AS3組結腸癌細胞LOVO中miR-29b 表達水平升高(圖2C)。下調HOXA-AS3靶向促進miR-29b表達。

A: 以流式細胞術測定結腸癌細胞LOVO凋亡變化; B: 以Western blot方法測定結腸癌細胞LOVO中Bax、Bcl-2蛋白水平。圖1 下調HOXA-AS3對奧沙利鉑誘導結腸癌細胞LOVO凋亡和凋亡蛋白表達作用的影響

表1 下調HOXA-AS3和奧沙利鉑作用后結腸癌細胞LOVO增殖活性、凋亡率和細胞中Bax、Bcl-2蛋白水平

A: HOXA-AS3和miR-29b結合位點; B: 細胞熒光素酶活性變化,與MUT比較, P<0.05; C: HOXA-AS3 siRNA轉染以后結腸癌細胞LOVO中miR-29b表達變化比較,與control組比較, ?P<0.05; 與si-NC組比較, #P<0.05。圖2 下調HOXA-AS3靶向促進miR-29b表達

2.5 miR-29b inhibitor對下調HOXA-AS3影響結腸癌細胞LOVO的作用

與si-HOXA-AS3+Anti-miR-NC組比較, si-HOXA-AS3+ Anti-miR-29b組結腸癌細胞LOVO增殖活性升高，細胞凋亡率降低，細胞中Bax蛋白表達減少, Bcl-2蛋白表達增多。與L-OHP+si-HOXA-AS3+Anti-miR-NC組比較, L-OHP+si-HOXA-AS3+Anti-miR-29b組結腸癌細胞LOVO增殖活性升高，細胞凋亡率降低，細胞中Bax蛋白表達減少, Bcl-2蛋白表達增多。見圖3、表2。

A: miR-29b inhibitor對結腸癌細胞LOVO中miR-29b表達影響,與Anti-miR-NC組比較, ?P<0.05; B: 以Western blot方法測定結腸癌細胞LOVO中Bax、Bcl-2蛋白水平; C: 以流式細胞術測定結腸癌細胞LOVO凋亡變化。圖3 miR-29b inhibitor對下調HOXA-AS3影響結腸癌細胞LOVO凋亡和凋亡蛋白表達作用

3 討 論

近些年來，基因在腫瘤中的作用已經引起人們的廣泛重視，其不僅參與調控腫瘤細胞生長，還與腫瘤細胞放化療敏感性等有關，尋找有效的分子靶點以提高腫瘤患者治療效果意義重大。lncRNA在多種生物體內表達，并通過調控細胞增殖、凋亡、衰老、分化等過程影響疾病進程，是很多疾病治療的潛在靶點[9]。腫瘤中lncRNA的表達譜與正常組織和細胞差異較大，而這些差異表達的lncRNA參與影響腫瘤細胞惡性生物學行為的調控過程, lncRNA也逐漸成為分子靶向治療的熱點研究領域[10]。既往研究[11]顯示，下調HOXA-AS3, 可降低肺癌細胞A549增殖能力，抑制裸鼠移植瘤生長。本研究發現,HOXA-AS3在結腸癌細胞中的表達水平高于正常結腸細胞，并且下調HOXA-AS3后的結腸癌細胞增殖活性降低，細胞凋亡率升高，細胞中促凋亡蛋白Bax表達水平升高，抗凋亡蛋白Bcl-2表達水平降低，說明HOXA-AS3在結腸癌中可能發揮促進作用，而靶向抑制HOXA-AS3可能是未來結腸癌治療的途徑。

表2 下調HOXA-AS3和奧沙利鉑作用后結腸癌細胞LOVO增殖活性、凋亡率和細胞中Bax、Bcl-2蛋白水平

鉑類抗腫瘤作用極強，奧沙利鉑屬于第三代鉑類衍生物，其以二氨基環己烷代替了順鉑的2個氨基[12]。鉑類藥物雖然已經在抗腫瘤領域的應用超過了40年，但是對其具體的抗腫瘤機制還不明確[12]。結腸癌是常見消化系統惡性腫瘤，奧沙利鉑在結腸癌治療中廣泛使用。基礎研究[13]顯示，奧沙利鉑能夠體外誘導結腸癌細胞凋亡，降低細胞增殖活性。雖然奧沙利鉑的毒性小于順鉑，但其對神經系統等有一定的副作用，這使得奧沙利鉑不能被長期應用于臨床，提高腫瘤患者奧沙利鉑敏感性是亟待解決的問題[14]。研究[7]發現,HOXA-AS3能夠通過與下游基因相互作用，降低非小細胞肺癌細胞順鉑敏感性。本研究發現,HOXA-AS3siRNA能夠增強奧沙利鉑對結腸癌細胞增殖抑制和凋亡促進作用，下調HOXA-AS3進一步加強了奧沙利鉑抗結腸癌作用，下調HOXA-AS3可提高結腸癌細胞奧沙利鉑敏感性，這對于提高結腸癌患者奧沙利鉑敏感性有重要意義。

lncRNA在人體內的作用極為廣泛，這與其作用機制有關, lncRNA可通過與miRNA互補結合，影響miRNA的表達，進而調控下游信號通路或進行基因的激活[15-17]。已經發現的HOXA-AS3的下游靶miRNA有多個，如miR-455、miR-29c[6, 18]。利用生物信息學軟件和熒光素酶報告系統鑒定HOXA-AS3和miR-29b為靶向關系，并且下調HOXA-AS3靶向促進結腸癌細胞中miR-29b的表達水平，推測HOXA-AS3作用機制可能與miR-29b有關。miR-29b定位在染色體7q32.3, 在很多正常組織中均有表達，與腫瘤的發生和轉移有關[19-20]。miR-29b在結腸癌中表達下調，上調miR-29b抑制癌細胞增殖能力，可提高奧沙利鉑敏感性[21]。逆轉實驗顯示下調miR-29b可減弱下調HOXA-AS3對結腸癌細胞增殖、凋亡和奧沙利鉑敏感性的作用，這進一步提示下調HOXA-AS3可通過靶向促進miR-29b表達抑制結腸癌細胞增殖，誘導細胞凋亡，提高奧沙利鉑敏感性，這為研究HOXA-AS3在腫瘤中的作用機制提供了參考依據。

綜上所述，下調HOXA-AS3通過靶向促進miR-29b抑制結腸癌細胞增殖，促進細胞凋亡，并提高細胞奧沙利鉑敏感性，這對于分子靶向治療腫瘤和提高腫瘤患者奧沙利鉑敏感性具有重要意義。但本研究尚未具體分析HOXA-AS3調控miR-29b的下游機制，這部分內容將在后續研究中進行探討。