產γ-氨基丁酸酵母菌高密度培養條件優化

畢長富，曾思恒，何 娟，龔利娟，王風青，楊雷軍

（四川輕化工大學生物工程學院，四川 宜賓 644000）

引 言

γ-氨基丁酸（GABA）是一種非蛋白質氨基酸，是腦內主要的神經遞質抑制劑[1]。GABA 通過增加氧傳遞和血流量來改善腦細胞代謝，促進人體精神安定、血液循環，增加大腦氧氣供給等功能，并參與調節生長激素分泌、蛋白質生成、脂肪燃燒和降低血壓[2]。GABA 能抑制谷氨酸的脫氨反應，使谷氨酸轉化為尿素排出體外，使血氨降低，解除氨毒，增進肝功能[3]。它還具有抗氧化、抗抑郁、抗失眠和止痛作用，被用于非免疫性疾病、中風、神經紊亂和糖尿病控制以及癲癇、哮喘等病理的治療[4-5]。

隨著人們的生活質量越來越高，對傳統食品也提出了更深層次的要求，研發各種功能性食品已成為現下的一個研究熱點，GABA 作為一種功能性因子，被應用于各類食品當中。利用產GABA 生產菌株，發酵富含GABA 的發酵產品就是其研究方向之一。李婷等[6]通過植物乳桿菌發酵制備出了含有GABA 的乳酸菌飲料。Kantachote 等[7]將高產GABA的菌株用于發酵香腸的制作，以產GABA 的戊糖片球菌HN8 和那慕爾乳桿菌NH2 為混合發酵劑發酵豬肉香腸，得到的產品中GABA 含量達396.2 mg/100 g。EL-Fattah 等[8]利用濃縮乳清蛋白強化的脫脂乳粉發酵酸奶，在發酵劑中添加能賦予酸奶高粘特性和產GABA 混合菌后發現，酸奶中GABA 含量達1.64 mg/100 mL，是相應的只添加具有高粘性菌株處理組的4.56 倍。石洋華[9]利用高產GABA 的酵母菌KS45-180，釀造富含GABA 的保健梨酒，梨酒的酒精度為9.4 度、GABA 的含量達到101.42 mg/L，超過安琪酵母產量，口感類似于普通梨酒。對于發酵食品的制備，發酵劑是關鍵，直投式發酵劑屬于高效濃縮型發酵劑的一種，不需要經過菌種活化、增殖培養和逐級擴大培養過程，是一種可直接應用于生產的體積微小、活菌量高、活力強的新型發酵劑[10]。

本文通過單因素及響應面相關試驗對產GABA酵母菌HU-TS3進行增殖培養基成分及其培養條件優化，為制備直投式菌粉，研發各種富含GABA功性發酵食品提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

所選酵母菌HU-TS3 由四川輕化工大學生物工程學院生物發酵技術及應用試驗室分離篩選及保藏；葡萄糖（AR）購于成都市科倫化工試劑廠；可溶性淀粉（AR）、蔗糖、乳糖、溴甲酚綠（AR）均購于西隴科學股份有限公司；乙醛酸（AR）、琥珀酸（AR）購于成都市科隆化學品有限公司；普通蛋白胨、瓊脂粉（生化試劑）購于北京奧博星生物技術有限責任公司；酵母浸粉（生化試劑）購于山東西亞化學工業有限公司；PDA 培養基（生化試劑）購于北京三藥科技開發公司。

UV752N 紫外可見分光光度計，上海諾科儀器儀表有限公司；YXQ-LS-18SI 立式壓力蒸汽滅菌器，上海博訊實業有限公司醫療設備廠；FA2004N精密電子天平，杭州萬特衡器有限公司；BCM-1000A 生物潔凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司；H10-50133 生化培養箱，天津宏諾儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 培養基及培養條件

種子培養基：葡萄糖濃度為20 g/L、普通蛋白胨濃度為20 g/L、酵母浸粉濃度為10 g/L、pH 為自然條件，裝液量為50 mL/250 mL 三角瓶，在30 ℃、180 r/min恒溫搖床中震蕩培養24 h。

篩選培養基：葡萄糖濃度為20 g/L、普通蛋白胨濃度為20 g/L、酵母浸粉濃度為10 g/L、溴甲酚綠濃度為0.1 g/L、琥珀酸濃度為2 g/L、乙醛酸濃度為2 g/L、瓊脂濃度為20 g/L，在37 ℃條件下恒溫培養48 h。

高密度培養基礎培養基：葡萄糖濃度為20 g/L、普通蛋白胨濃度為20 g/L、酵母浸粉濃度為10 g/L、味精濃度為10 g/L，pH 為自然條件，裝液量為50 mL/250 mL 三角瓶，在37 ℃、150 r/min 恒溫搖床中震蕩培養。

1.2.2 酵母菌HU-TS3菌株活化

將酵母菌HU-TS3 斜面菌株，采用平板劃線法接種到種子培養基和篩選培養基平板上，在30 ℃恒溫培養箱中培養2 d，觀察菌落形態。挑取培養基上單菌落接種到液體種子培養基中，在30 ℃、180 r/min恒溫搖床中震蕩培養24 h，得到種子液。

1.2.3 酵母菌HU-TS3生長曲線測定

按3%的接種量，將種子液接種于10 mL/50 mL三角瓶中，在30 ℃、180 r/min 恒溫搖床中培養，從0 h 開始，每隔2 h 取樣，在560 nm 處測定吸光度（OD）[11]，測得的吸光度要保證在0.2～0.8[12]之間。以培養時間為橫坐標，吸光度值為縱坐標繪制酵母菌HU-TS3生長曲線。

1.2.4 酵母菌HU-TS3 增殖培養基及條件優化單因素試驗

選取可溶性淀粉、葡萄糖、蔗糖、果糖、糊精5種碳源進行單因素試驗，檢測560 nm處的OD值以確定最佳碳源種類，接著設置碳源濃度為25、30、35、40 g/L與45 g/L進行單因素試驗[13]，以確定最佳濃度。

設置普通蛋白胨濃度依次為10、15、20、25 g/L與30 g/L[14]，酵母浸粉濃度依次為5、10、15、20 g/L 與25 g/L，分別進行單因素試驗，檢測560 nm 處的OD值以確定最佳氮源種類及濃度。

設置接種量依次為1%、2%、3%、4%(v/v)與5%(v/v)[15]，培養基初始pH 為4、5、6、7、8、未調[15]，培 養時間設置為12、24、36、48 h 與60 h[16]，裝液量 為5 mL/250 mL、10 mL/250 mL、15 mL/250 mL、20 mL/250 mL 與25 mL/250 mL，分別進行單因素試驗，檢測560 nm 處的OD值以確定最佳接種量、初始pH、培養時間及裝液量。

1.2.5 響應面相關試驗設計

依據單因素試驗的結果利用Plackett-Burman設計篩選對酵母菌HU-TS3 增殖影響顯著因子，采用n= 12 的Plackett-Burman 設計（因素水平值見表1），選取6個因素，其中，高水平“1”是低水平“-1”的1.5～2.0 倍。對于試驗結果，分別計算各因素的效應，并進行t檢驗，選擇置信度大于95%的因素作為顯著因素進一步考察。

表1 Plackett-Burman設計因素水平

依據Plackett-Burman 設計試驗結果，選取P＜ 0.1 的因素，如果因素呈現正效應，就從低水平往上增加；呈現出負效應，則從高水平往下減少；其他影響不顯著的取最優水平進行試驗，每個顯著因子的步長根據單因素試驗的結果確定。

確定最顯著因素的最優水平，逼近最大產區后，進行響應面中心組合試驗設計（因素水平設計見表2），以試驗結果擬合建立描述響應量（OD560nm）與自變量（影響菌體增殖的顯著因素）關系的多項式回歸模型，再對擬合方程進行規范性分析，尋找回歸模型的穩定點，得到最大OD560nm時顯著因素的最優水平，并進行試驗驗證。

1.3 數據處理

所有單因素試驗，都進行3組平行試驗并重復3次，數據的處理及作圖用Office 2016-Excel 工作表完成；響應面試驗設計及數據分析，采用Minitab19與Design Expert10軟件完成。

2 結果與分析

2.1 酵母菌HU-TS3菌株活化及特性觀察

將斜面酵母菌HU-TS3 用生理鹽水制成菌懸液，將其進行稀釋涂布和平板劃線，于30 ℃條件下恒溫培養48 h，觀察菌落形態。由圖1(a)可以觀察到單菌落呈乳白色，圓形，突起，邊緣齊整，表面光滑。由圖1(b)可以看出，菌落呈藍綠色，是因為當菌體合成GABA時，會與培養基中添加的乙醛酸、琥珀酸及溴甲酚綠發生專一性顯色反應，使其表現為藍綠色[17]。

圖1 菌落形態

2.2 酵母菌HU-TS3生長曲線

酵母菌HU-TS3 生長曲線如圖2 所示。由圖2可知，酵母菌HU-TS3 的對數生長期為4～12 h，在此時間段生長速率達到最大，菌體活力最好，所以選擇種子液培養時間為10 h。

圖2 酵母菌HU-TS3生長曲線

2.3 酵母菌HU-TS3增殖培養基優化

2.3.1 碳源種類及濃度對酵母菌HU-TS3 增殖的影響

碳源種類及濃度對微生物生長十分重要，碳不僅可作為細胞的基本骨架，還可作為化能異養型微生物的能源物質。由圖3(a)可知，與其他碳源相比，當葡萄糖作為碳源時，OD值最大，原因可能是葡萄糖作為單糖分子進入細胞內參與代謝合成比多糖更為容易，所以選擇葡萄糖作為酵母菌HU-TS3 增殖培養基的碳源[18]。當葡萄糖濃度為40 g/L 時，OD560nm最大（見圖3(b)）。

圖3 不同碳源和葡萄糖濃度對酵母菌HU-TS3增殖的影響

2.3.2 氮源濃度對酵母菌HU-TS3增殖的影響

氮源對微生物生長有著十分重要的影響，作為培養基中的主要成分，能夠很大程度上影響菌體的生長情況。由圖4 可知，當蛋白胨濃度為20 g/L、酵母浸粉濃為15 g/L 時，OD560nm達到最大，與董碩等[19]研究結果一致。

2.4 培養條件對酵母菌HU-TS3增殖的影響

2.4.1 接種量對酵母菌HU-TS3增殖影響

接種量的多少，影響著菌種生長調整期，也與菌種生長速率相關。接種量太少，生長速度相對降低，無法在培養基中快速成為優勢菌，雜菌快速生長而染菌；接種量過大，會造成短時間內培養基營養成分大量減少，導致菌體快速自溶。由圖5可知，當接種量為3%時，培養液OD560nm最大。

圖5 接種量對酵母菌HU-TS3增殖影響

2.4.2 初始pH對酵母菌HU-TS3增殖的影響

pH的高低會影響微生物體內酶的活性，同時還會影響培養基成分的理化性質與培養基成分吸收情況，從而影響菌株的生長代謝。由圖6可知，當初始pH 為6.00 時，培養液OD560nm達到最大，為20.05，與自然條件（pH = 5.87）下OD560nm值（19.83）相近。單藝等[20]在假絲酵母菌Y-2生長特性研究中發現酵母菌的最佳培養pH 值為5.50。綜上選定自然條件下的pH作為酵母菌HU-TS3增殖的最佳初始pH。

圖6 初始pH對酵母菌HU-TS增殖的影響

2.4.3 培養時間對酵母菌HU-TS3增殖的影響

培養時間的長短對菌體濃度有著顯著的影響，由圖7 可知，當培養時間達到36 h，培養液OD560nm達到最大，因此酵母菌HU-TS3 的高密度培養時間選擇36 h。

圖7 培養時間對酵母菌HU-TS3增殖影響

2.4.4 裝液量對酵母菌HU-TS3增殖影響

裝液量是影響培養基溶氧的因素之一，對于三角瓶搖床培養，裝液量越少，溶氧越大。由圖8 可知，裝液量越大，培養液OD560nm越小。當裝液量為5 mL/50 mL 三角瓶時，酵母菌HU-TS3 培養液OD560nm最大，此時錐形瓶的裝液系數為0.10。劉梅等[15]研究發現，當裝液系數為0.11時，酵母菌的增殖效果顯著。因此，酵母菌HU-TS3 在三角瓶搖床高密度培養時的裝液系數選擇0.10。

圖8 培養時間對酵母菌HU-TS3增殖影響

2.5 響應面相關試驗

2.5.1 Plackett-Burman試驗設計

Plackett-Burman 試驗結果見表3，各因素的系數估計和效應評價見表4。由表4 可知，對酵母菌HU-TS3 培養液中OD560nm值有顯著影響(置信度大于95%，P＜ 0.05)的因素有3 個：葡萄糖、蛋白胨及酵母浸粉，且均呈現正效應。

表3 Plackett-Burman 試驗設計及響應值(n=12)

表4 Plackett-Burman 設計中各因素系數的估計及效應評價(α=0.05，置信度為95%)

2.5.2 最陡爬坡試驗確定中心點

由表5 可知，OD560nm最大區在第3 次試驗附近，以試驗3作為響應曲面試驗因素水平的中心點，即：葡萄糖濃度為50 g/L，蛋白胨濃度為30 g/L，酵母浸粉濃度為25 g/L。

表5 最陡爬坡試驗設計及結果

2.5.3 響應面設計確定最顯著因素的最優水平

利用Minitab 19 軟件對葡萄糖、蛋白胨和酵母浸粉設計3 因素3 水平的響應面中心組合試驗，試驗結果見表6，響應值的方差分析見表7。

表6 Box-Behnken試驗設計及結果

表7 響應值的方差分析

由表7 可知，所選擇的回歸模型的P值為0.0011，表明該整體模型具有可信度；失擬項的P值為0.1257，失擬項檢驗不顯著，模型選擇適當。一次項A、二次項A2、B2、C2對結果影響極顯著（P＜ 0.01）、交互項A×B對結果影響較顯著（P＜ 0.1）。調整后的R2= 94.16%，表明94.16%的酵母菌HU-TS3培養液的OD560nm變化可由此模型解釋。OD560nm（Y）對葡萄糖濃度（A）、蛋白胨濃度（B）和酵母浸粉濃度（C）的多元二次回歸方程為：

葡萄糖、蛋白胨、酵母浸粉3個因素兩兩交互作用對酵母菌HU-TS3 菌液OD560nm的影響如圖9 所示。由圖9 可知該方程有最大值，利用軟件分析計算，葡萄糖濃度為51.27 g/L、蛋白胨濃度為29.63 g/L、酵母浸粉濃度為25.08 g/L時，菌液OD560nm最大為34.4631。考慮實際操作可行性，將上述最優條件修正為葡萄糖濃度為51 g/L、蛋白胨濃度為30 g/L，酵母浸粉濃度為25 g/L。以此最優條件進行3次重復試驗，測得酵母菌HU-TS3菌液平均OD560nm為34.606，與預測擬合度達99.59%，表明優化模型可靠。

圖9 兩兩交互作用對酵母菌HU-TS3菌液OD560nm的影響

3 結束語

通過對產GABA 的酵母菌HU-TS3 進行高密度培養條件優化，在最佳的培養條件下活菌數達到8.1 × 109CFU/mL，為優化前的兩倍多。隨著人們生活水平的不斷提高，對食品的要求也越來越高，各種功能性發酵食品的研制，成為目前食品研發的熱點之一。利用產γ-氨基丁酸酵母菌發酵研制各種富含功能性因子γ-氨基丁酸的發酵食品也是趨勢之一。發酵成功與否關鍵因素在于菌株，直投式菌劑是目前各種發酵企業首選的接種方式，酵母菌HU-TS3高密度培養條件優化研究為大規模產γ-氨基丁酸酵母菌直投式菌體的制備提供了理論依據。