煙草黑脛病拮抗菌的篩選鑒定與防病促生作用研究

王亞月，賈方方，李俊營，許躍奇，閻海濤，何曉冰，劉冬梅，常 棟*

煙草黑脛病拮抗菌的篩選鑒定與防病促生作用研究

王亞月1，賈方方1，李俊營2，許躍奇2，閻海濤2，何曉冰2，劉冬梅1，常 棟2*

（1.商丘師范學院生物與食品學院，植物與微生物互作河南省高校重點實驗室，河南 商丘 476000；2.河南省煙草公司平頂山市公司，河南 平頂山 467000）

為獲取優良黑脛病生防菌株，從大連海域生長的海綿中分離到一株具有高拮抗活性的放線菌DL157，根據培養和顯微形態、生理生化數據及16S rRNA序列分析，鑒定DL157菌株為淺紫鏈霉菌（）。菌株DL157在平板對峙、盆栽試驗與大田試驗中均表現出較高的抑菌活性，抑制率分別為60.28%、69.2%和83.5%。DL157菌株可以通過分泌蛋白酶、纖維素酶和幾丁質酶破壞煙草疫霉菌菌絲細胞壁結構，致使其細胞壁受損，原生質滲漏，進而表現出抑制作用。DL157菌株可以促進煙草種子萌發和幼根伸長，提高萌發煙草種子可溶性蛋白含量與淀粉酶活性。此外，DL157菌株具有遺傳穩定性，經過50次傳代培養，依然保持較高抑菌活性。綜上，淺紫鏈霉菌DL157具有開發為煙草黑脛病生防制劑的潛力。

煙草黑脛??；淺紫鏈霉菌；生防；促生

煙草黑脛?。═obacco black shack）是威脅煙草產量與質量的一種嚴重的土傳性真菌病害，其病原菌為煙草疫霉菌（var.），該病極易在高溫、高濕環境下流行爆發，典型癥狀為植株矮化，葉片自下而上凋萎發黃，根部和莖部萎縮、壞死，莖髓部呈碟片狀[1]。在某些病害嚴重的地塊，其發病率高達75%以上，造成生產上大量減產，甚至絕收，給我國煙草產業帶來重大威脅[1-2]。

生產上，煙草黑脛病的防治包括農業防治、化學防治與生物防治措施。農業防治通常采取間套作、輪作方式或者使用抗病品種。然而，其他種類植物的引入可能會降低煙葉品質[3-5]，如大豆與茼蒿的引入雖然可提高煙葉中總氮和煙堿的含量，卻降低了總糖含量[3]?？篃煵莺诿劜》N質性狀是由多基因控制，其轉育難度極大，且多為中抗或耐病品種，高抗品種甚少?；瘜W防治通常使用化學藥劑如甲霜靈、氟吡菌胺、霜霉威鹽酸鹽、烯酰嗎啉以及丁吡嗎啉等[6-9]，然而長時間大面積重復施用同一種藥劑，容易使病原菌產生抗藥性，防治效果逐漸降低，同時也會造成環境污染及農藥在煙葉中的殘留。生物防治通過微生物產生抗生素等抗菌物質來抑制病原菌的生長，無毒害、無殘留、對環境友好，有利于維護生態平衡，保護物種多樣性，促進綠色生態煙草農業發展，在煙草病害防治中備受關注[1,10-11]。

煙草黑脛病的發生與根際土壤微生物有著緊密聯系，土壤中有益菌群數量的降低以及有害菌群數量的增加都會增加病害發生率。微生物菌劑可以提高土壤酶活性、改變土壤微生物菌群、改良土壤養分環境，從而調控土壤微生物群，改變其功能多樣性，進而抑制作物病蟲害[12-13]。目前已開發的微生物菌劑生防菌多分離自陸生環境，因此導致其在鹽含量高的土壤中較難存活和發揮生物防治功能。海洋環境由于其壓強高、含鹽量高、營養成分少、溫度低等特點，使得生活在其中的放線菌的生理生化特征和代謝途徑與陸生放線菌有所差異，是新型農用抗生素的重要來源，在農業生產中開發前景廣闊[14-15]。

本研究以煙草黑脛病的生物防治為主要目標，從大連海域生長的海綿中分離篩選獲得1株對煙草黑脛病防治效果較高的拮抗菌，通過微觀形態、生理生化特性、16S rRNA基因序列分析對其進行分類鑒定，研究該菌株對煙草黑脛病的防治效果，以期為煙草黑脛病的生物防治提供優良的菌種資源。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 拮抗菌種與病原菌的獲得 拮抗菌DL157菌株從大連海域新鮮海綿中分離獲得，純化后菌株于20%甘油中保存，?80 ℃保藏備用。煙草黑脛病病原菌分離于河南省平頂山市煙田的黑脛病患病煙株，保存于河南省植物與微生物互作平臺高校重點實驗室[16]。

1.1.2 培養基與主要試劑 ISP2培養基：麥芽浸粉10 g，酵母粉4 g，葡萄糖4 g，加去離子水至1 L，調pH至7.2。胡蘿卜固體培養基：胡蘿卜200 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，加去離子水至1 L，自然pH。PDA培養基：200 g馬鈴薯，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，加去離子水至1 L，調pH至7.2。無機鹽淀粉培養基：可溶性淀粉10 g，(NH4)2SO42 g，CaCO33 g，MgSO4?7H2O 1 g，K2HPO41 g，NaCl 1 g，瓊脂20 g，加去離子水至1 L，調pH至7.2。燕麥瓊脂培養基：燕麥片20 g，微鹽溶液1 mL，瓊脂20 g，加去離子水至1 L，調pH至7.2。查氏培養基：蔗糖30 g，FeSO4?7H2O0.01 g，NaNO32 g，K2HPO41 g，MgSO4?7H2O 0.05 g，KCl 0.5 g，瓊脂20 g, 加去離子水至1 L，調pH至7.2。營養瓊脂培養基：蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，NaCl 5 g，瓊脂20 g，加去離子水至1 L，調pH至7.2。全脂牛奶培養基：葡萄糖4 g，瓊脂 2 g，加去離子水95 mL，滅菌后降至60 ℃時，加入5 mL無菌全脂牛奶，混合并調節pH至5.6。

1.2 拮抗活性測定

1.2.1 室內平板對峙試驗 采用平板對峙法測定DL157菌株對煙草黑脛病的抑菌活性。將煙草黑脛病病原菌在胡蘿卜培養基平板上活化，用打孔器在菌落邊緣打取菌塊（半徑5 mm），接種到胡蘿卜培養基平板中央，在菌塊4周離中心25 mm處對稱接種3 μL拮抗菌液（約1.0×108cfu/mL），倒置，每個處理重復3次，5 d后觀察抑菌結果，并測量其抑菌半徑，計算抑菌率[17]。

1.2.2 盆栽防效試驗 將DL157菌株接種于ISP2液體培養基中，于28 ℃、140 r/min振蕩培養5 d，稀釋制成拮抗菌液（孢子濃度約1.0×108cfu/mL），采用灌根法每盆接種200 mL拮抗菌液，7 d后接種煙草黑脛病病原菌200 mL（孢子濃度約為1.0×108cfu/mL），此后每7 d接種拮抗菌液1次，共接種3次；對照組CK用清水處理，對照組CK1使用58%甲霜·代錳鋅可濕性粉劑600倍每株200 mL處理；對照組CK2以旺泰寶微生物菌劑（有效成分為哈茨木霉菌與棘孢木霉菌，菌含量≥2億/g）可濕性粉劑600倍每株200 mL處理；對照組CK3以碧苗復合微生物菌肥（有效成分為高活性微生物菌、次生代謝物及腐植酸）進行處理。每處理8株，各處理重復3次，接種14 d后開始調查發病情況。煙草黑脛病分級參照中華人民共和國煙草行業標準（GB/T 23222—2008）進行[17]。

1.2.3 大田防效試驗 大田防效試驗在平頂山市白龍廟村進行，該煙區自2018年來黑脛病頻繁發生，且為主要病害。煙株于2021年5月1日移栽，20 d后接種拮抗菌液孢子濃度約1.0×108cfu/mL，每株灌根200 mL，對照組CK、CK1、CK2與CK3設置同1.2.2。由于大田煙株生育期比盆栽煙株長，故將大田接種時間間隔定為15 d，共灌根3次。每處理50株，共重復3次。接種14 d后開始調查發病情況。

1.3 菌株鑒定

1.3.1 生理生化特征 參照《放線菌系統分類技術》[18]進行生理生化指標測定。

1.3.2 16S rRNA鑒定 使用takara基因組提取試劑盒提取DL157基因組DNA，以16S rRNA通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和R1492（5'-CGGC-TACCTTGTT ACGAC-3'）進行PCR。反應體系50 μL：PremixTap酶25 μL、模板1 μL、引物27f 1 μL、引物1492r 1 μL、重蒸水22 μL。PCR條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，30個循環；72 ℃延伸10 min。將PCR產物經純化后送天津金唯智測序。將測得序列在NCBI Genbank在線Blast，下載具有登錄號的相關同源序列，借助于MEGA5軟件以鄰位法構建系統進化樹。

1.4 DL157菌株抑菌機理初步研究

1.4.1 DL157菌株對病原菌菌絲形態的影晌 分別挑取在正常培養基上和平板對峙試驗中培養3 d的煙草疫霉菌邊緣菌絲于無菌離心管中，PBS緩沖液（pH 7.2，0.1 mol/L）沖洗，離心收集菌絲，用2.5%丙二醛固定2 h，PBS緩沖液洗滌3次后，依次用10%、30%、50%、75%、85%、90%與100%的乙醇分別脫水15 min，鋨酸熏3 ｈ，置于銅網噴金，于掃描電鏡下觀察[19]。

1.4.2 DL157菌株拮抗活性因子檢測 將DL157菌株接種于ISP2液體培養基中，于28 ℃、140 r/min振蕩培養5 d，12000 r/min，4 ℃離心10 min，獲得發酵液上清；離心沉淀用50 mmol/L KH2PO4- K2HPO4緩沖液（pH 7.5）重懸，置于冰浴中超聲，條件為300 W，工作5 s，間隙5 s，120個循環。12000 r/min離心30 min，收集上清，獲得細胞粗提物。

參照寧爽[20]蛋白酶活性測定方法，運用全脂牛奶平板法檢測DL157菌株發酵液上清與細胞粗提物蛋白酶活性：在全脂牛奶平板中央打孔，每孔分別各自加入20 μL發酵液上清與細胞粗提物，密封，25 ℃靜置7 d，加入10%三氯乙酸固定2 h后，運用考馬斯亮藍G-250染色過夜，乙醇-冰乙酸脫色，通過計算菌落直徑與透明圈直徑的比值，定性比較發酵液上清與細胞破碎液蛋白酶活性高低，比值越低，蛋白酶活性越高。幾丁質酶與纖維素酶活性分別運用試維素酶活性檢測試劑盒（上海原鑫生物，YX-SH-TQ22025）與幾丁質酶活性檢測試劑盒（上海原鑫生物，YX-W-B917）進行檢測。

1.5 DL157菌株對煙草生長的影響

1.5.1 DL157菌株對煙草種子萌發的影響 分別用DL157菌株培養液原液、10倍稀釋液與100倍稀釋液浸泡煙草種子24 h，于無菌培養皿中，25 ℃恒溫培養箱內培養，第3天開始每隔12 h記錄一次發芽數（以根長等于種子的長或者芽長等于種子長的1/2為發芽標準)），記錄到第6天結束。芽發齊后，轉移到光照培養箱培養，3 d后測量根長，根長為從根基部到最長根尖端的長度。以無菌水處理為對照，每處理50粒種子，3個重復。

1.5.2 DL157菌株對種子萌發時可溶性蛋白含量和總淀粉酶活性的影響 分別用DL157菌株培養液原液、10倍稀釋液與100倍稀釋液浸泡煙草種子24 h后，將種子置于無菌培養皿中，對照煙草種子采用無菌水處理，3個重復。25 ℃恒溫培養箱靜置，于發芽后第9天取0.5 g發芽種子，加入5 mL磷酸緩沖液（pH 6.9），充分磨勻，靜止30 min后，將勻漿液轉移至離心管，4 ℃、12000 r/min離心10 min，收集所有上清，備用?？扇苄缘鞍缀窟\用考馬斯亮藍法檢測，磷酸緩沖液作為空白處理[22]。淀粉酶活性運用3，5-二硝基水楊酸法測定，磷酸緩沖液作為空白處理[21]。

1.6 DL157菌株傳代的抑菌穩定性研究

拮抗菌株于ISP2培養基上傳代培養，每48 h轉接１次，連續傳代50次，每個處理3個平行。平板對峙試驗測定初代菌株與傳代菌株對煙草疫霉菌的抑菌效果，根據抑菌帶寬度變化分析傳代對拮抗菌抑菌效果的影響。

2 結 果

2.1 煙草疫霉病拮抗菌株的篩選與抑菌作用

2.1.1 平板對峙試驗抑菌效果 從大連海域海綿中分離獲得的6株拮抗菌，對煙草疫霉菌病原菌的抑制率達20%～60%。其中，菌株DL157拮抗效果最高，該菌株對煙草黑脛病的抑菌直徑達（48.22± 0.83）mm，抑制率達（60.28±1.04）%（圖1）。

2.1.2 盆栽與大田防效 在盆栽試驗中，與對照CK相比，化學藥劑甲霜錳鋅、生防菌肥碧苗和生防菌劑旺泰寶與DL157菌液處理的煙株發病率分別降低28.2、27.4、10.4、48.4百分點，病情指數分別降低24、2.5、4.1、39.6；且經DL157處理后的煙株發病率和病情指數均低于甲霜錳鋅、碧苗和旺泰寶。DL157防效分別是甲霜錳鋅、碧苗與旺泰寶的1.6、15.7與9.6倍（表1）。

在大田中，與CK相比，甲霜錳鋅、碧苗、旺泰寶與DL157菌液處理的煙株發病率和病情指數均降低，發病率分別降低4.7、4.8、5.4、8.6百分點，病情指數分別降低2.2、3.2、3.3、5.6；且經DL157處理后的煙株發病率和病情指數均低于甲霜錳鋅、碧苗和旺泰寶。DL157防效分別是甲霜錳鋅、碧苗與旺泰寶的2.5、1.8和1.7倍（表1）。

2.2 菌株DL157的鑒定

2.2.1 形態特征 菌株DL157菌落為圓形，邊緣不整齊，表面干燥有褶皺，白色粗糙不透明，菌落中央凹狀突起，氣生菌絲發達（圖2）。顯微鏡下觀察，菌絲長直，孢子呈卵圓與橢圓形（圖3）。

圖1 DL157菌株對煙草疫霉菌的拮抗效果

表1 DL157菌株盆栽和大田防效

注：表中每列數據后不同字母代表差異顯著（≤0.05），下同。

Note: value within each column of the same cultivar not marked by the same lowercase letters signifies significant difference (≤0.05), the following tables are the same.

圖2 DL157菌株菌落形態

圖3 DL157菌株顯微鏡觀察圖

2.2.2 培養特征 表2為菌株DL157在查氏瓊脂培養基、無機鹽淀粉培養基、酵母膏麥芽汁培養基、燕麥瓊脂培養基、PDA培養基、營養瓊脂培養基上的生長特征。在不同培養基中，氣生菌絲與基內菌絲生長狀態不同，產生的可溶性色素亦不同。

表2 菌株DL157在不同培養基上的培養特征

2.2.3 生理生化特征 如表3所示，菌株DL157能夠利用葡萄糖、乳糖、半乳糖、蔗糖等碳源，但不能利用羧甲基纖維素鈉。根據《伯杰氏細菌鑒定手冊》與《放線菌的分類和鑒定》，結合DL157在不同培養基上的形態與顯微鏡下觀察的結果，初步確定DL157菌株為鏈霉菌（）。

2.2.4 分子鑒定 將測得的序列經blast比對，下載具有登錄號的相關同源序列，借助于MEGA5軟件以鄰位法構建系統進化樹（圖4），結果表明該菌株與EGI125菌株同聚一支，且同源性達99%，進一步確定DL157菌株為淺紫鏈霉菌（）。

表3 菌株DL157生理生化特征

注：“+”陽性；“–”陰性。

Note: “+”, positive; “–“, negative.

圖4 DL157菌株16S rRNA基因序列系統發育樹

2.3 DL157菌株抑菌機理

2.3.1 DL157菌株對病原菌菌絲形態的影響 如圖5所示，經掃描電鏡觀察，正常生長的煙草疫霉菌絲形態飽滿，細胞壁光滑，胞質均勻透明，分枝正常（圖5A和5B），而平板對峙培養中受抑制菌落邊緣的菌絲形態與對照相比發生很大的變化，菌絲出現纏繞，扭曲集結，不正常分枝增多，皺縮（圖5C和5D），部分菌絲細胞壁不完整（圖5E），原生質滲漏，菌絲細胞畸形生長（圖5F），說明DL157菌株或其分泌物對病原菌菌絲的生長產生了不利影響。

注：A（×1000）與B（×5000）為正常菌絲；C（×2000）與D（×10000）為受抑制菌絲扭曲集結形態；E為受抑制菌絲細胞壁裂解狀態（×5000）；F為受抑制菌絲畸形生長（×10000）。

2.3.2 DL157菌株拮抗活性因子 在DL157菌株發酵液上清與細胞粗提物中均檢測出蛋白酶、幾丁質酶與纖維素酶活性，且發酵液上清酶活性均高于細胞粗提物，分別是其8、1.7和1.1倍（表4）。

2.4 DL157菌株對煙草生長的影響

2.4.1 DL157菌株對煙草種子萌發的影響 煙草種子經水和DL157菌株發酵原液、10倍稀釋液與100倍稀釋液浸種處理后，隨著時間的延長，發芽率均呈現遞增趨勢，其中第3天發芽率最高（圖6）。與水浸種處理（CK）相比，煙草種子經DL157菌液浸種處理后發芽率均有所提高，其中經原液處理的煙草種子發芽率最高，第1、2、3天發芽率分別為66.7%、74.7%與85.3%，與CK相比分別提高1.3、1.3和1.4倍。如圖7所示，煙草種子經DL157菌株發酵原液、10倍稀釋液與100倍稀釋液浸種處理后，根長分別為0.80、0.77和0.65 cm，與對照組相比分別提高2.1、2.0和1.7倍。綜上可知，DL157不同濃度培養液浸種處理對煙草種子萌發和幼根的伸長有一定的促進作用。

表4 拮抗因子活性

注：37 ℃條件下，每小時催化底物產生1 mg產物所需要的酶量定義為為1個活力單位U。

Note: At 37 ℃, the amount of enzyme required to produce 1 mg of product from the catalytic substrate per hour is defined as 1 U.

注：圖中不同字母代表不同處理間差異顯著（p≤0.05），下同。

圖7 DL157菌株對煙草種子萌發根長的影響

2.4.2 DL157菌株對種子萌發時可溶性蛋白含量和總淀粉酶活性的影響 如圖8所示，煙草種子經DL157菌株發酵原液、10倍稀釋液與100倍稀釋液浸種處理后，其幼苗可溶性蛋白含量分別為18.3、10.0和7.6 mg/g，與CK相比，原液與10倍稀釋液分別提高2.5與1.4倍，而100倍稀釋液處理與對照相當。表明DL157發酵液濃度較高時可以提高萌發煙草種子可溶性蛋白含量，濃度較低時不能提高。

圖8 DL157菌株萌發煙草種子可溶性蛋白含量的影響

煙草種子經DL157培養液浸種處理后，其淀粉酶活性變化不一。與對照組水浸種處理相比，原液處理后淀粉酶活性降低10%，10倍稀釋液與100倍稀釋液處理后淀粉酶活性分別提高1.1倍與1.4倍（圖9）。

注：25 ℃條件下，每分鐘催化底物產生1 μmol產物所需要的酶量定義為1個活力單位U。

2.5 DL157菌株傳代穩定性

拮抗菌株DL157經過50次傳代，抑菌率與第1代抑菌率相當（表5），表明經過多次傳代，菌種依然沒有退化，傳代次數并不影響拮抗菌株的抑菌穩定性。

表5 DL157菌株傳代穩定性

3 討 論

生物防治中，放線菌是一類具有重要經濟價值和實用價值的微生物，是抗生素的重要來源，由于其對生態環境影響小、污染少等特點，在植物病害防控中，應用較普遍，尤其是鏈霉菌屬。如從煙草根際土壤分離的魯薩鏈霉菌（）YY75菌株、高貴鏈霉菌（）YY124菌株、婁徹鏈霉菌（）LN204菌株、珊瑚鏈霉菌（）SX92菌株、金黃垂直鏈霉菌（）SX59菌株、波卓鏈霉菌（）F-7菌株、金黃垂直鏈霉菌（）SA74菌株與黃麻鏈霉菌（）AUH-1菌株在平板對峙試驗中對煙草疫霉菌的抑菌率都高于70%[22-25]；不產色鏈霉菌（）F8菌株對煙草黑脛病的盆栽防效達70.3%[26]，郝氏鏈霉菌（）MT35菌株的田間試驗防治效果高達75.3%[27]。放線菌種類多樣，分布于土壤、污水、海洋等生態環境中，不同生境來源的放線菌代謝功能各異。目前分離的用于煙草黑脛病防治的放線菌多從土壤中分離，且很多放線菌僅限于室內平板研究，僅有少數利用盆栽與大田試驗驗證。相比于陸生微生物，海洋惡劣的化學和物理條件更有利于生活在其中的微生物產生大量新分子，這些分子在多樣性、結構和功能特征方面表現出優良特性，是農用新型先導化合物的重要來源[28-29]。本文中DL157菌株分離自海洋環境，在田間試驗中防效高達83.5%，高于目前陸生來源放線菌的防治效果。DL157菌株可以通過分泌蛋白酶、纖維素酶和幾丁質酶破壞煙草疫霉菌菌絲細胞壁結構，致使細胞壁受損，原生質滲漏，進而表現出抑制作用，這與在不產色鏈霉菌（）F8菌株中觀察到的現象一致[26]，然而DL157菌株是否產生其他抑菌活性物質仍需進一步研究。

4 結 論

本研究中分離的淺紫鏈霉菌DL157菌株對煙草黑脛病表現出較高防效，該菌株可以分泌蛋白酶、纖維素酶和幾丁質酶而影響煙草疫霉菌菌絲的生長。此外，DL157菌株可以促進煙草種子的萌發和幼根的伸長，提高萌發煙草種子中可溶性蛋白含量與淀粉酶活性，具有遺傳穩定性，為煙草黑脛病的生物防治提供優良的菌種資源。

[1] GUO D S, YUAN C H, LUO Y Y, et al. Biocontrol of tobacco black shank disease () byBa168[J]. Pesticide Biochemistry and Physiology, 2020, 165(104523): 1-10.

[2] 易龍，邱妙文，陳永明，等. 煙草黑脛病的生物防治研究進展[J]. 中國農學通報，2017，33（25）：146-151.

YI L, QIU M W, CHEN Y M, et al. Advances in biological control of tobacco black shank[J]. Chinese Agricultural Science Bulletin, 2017, 33(25): 146-151.

[3] 張得智. 輪作和間作對烤煙KRK26生長狀況及產質量的影響研究[D]. 長沙：湖南農業大學，2012.

ZHANG D Z. Studies on the effects of rotation and intercropping to growth yield and characteristics of cured tobacco variety KRK26[D]. Changsha: Hunan Agricultural University, 2012.

[4] 徐銳，陳明，王曉麗，等. 我國烤煙間套作種植效應研究進展[J]. 安徽農業科學，2020，48（1）：24-26.

XU R, CHEN M, WANG X L, et al. Progress of research on intercropping effect of flue-cured tobacco in China[J]. Journal of Anhui Agricultural Sciences, 2020, 48(1): 24-26

[5] 劉冰冰，郭書賢，陳興，等. 烤煙K326與香料植物間作模式下根際土可培養細菌多樣性及功能[J]. 微生物學通，2020，47（8）：2436-2449.

LIU B B, GUO S X, CHEN X, et al. Diversity and function of culturable rhizospheric bacteria of flue-cured tobacco K326 intercropped with five spice plants[J]. Microbiology China, 2020, 47(8): 2436-2449.

[6] 李文志，龍友華，莫飛旭，等. 噁唑菌酮·霜脲氰對煙草黑脛病病菌的室內毒力及田間防效[J]. 中國植保導刊，2020，40（7）：78-81.

LI W Z, LONG Y H, MO F X, et al. Control effects of famoxadone 22.5%+cymoxanil 30% WG on tobacco black shank[J]. China Plant Protection, 2020, 40(7): 78-81.

[7] 王忠宇，張承，張崇德，等. 18.7%烯?！み吝蝓ニ稚⒘煵莺诿劜〉姆乐涡Ч鸞J]. 農藥，2020，59（1）：65-67.

WANG Z Y, ZHANG C, ZHANG C D, et al. Control effects of dimethomorph pyraclostrobin 18.7% WG on tobacco black shank[J]. Agrochemicals, 2020, 59(1): 65-67.

[8] 任曉芬，亓文哲，程星凱，等. 氟菌·霜霉威對煙草黑脛病的防效及其對煙株生長的影[J]. 中國煙草學報，2018，24（4）：129-134.

REN X F, QI W Z, CHENG X K, et al. The control efficacy of fluopicolide · propamocarb hydrochloride to tobacco black shank and its effects on tobacco growth[J]. Acta Tabacaria Sinica, 2018, 24(4): 129-134.

[9] 李慧，姜濱，黃擇祥，等. 3種農藥在土壤-煙株系統中的遷移降解特征[J]. 中國煙草科學，2021，42（5）：63-68.

LI H, JIANG B, HUANG Z X, et al. The migration and degradation characteristics of three pesticides in the soil-tobacco plant system[J]. Chinese Tobacco Science, 2021, 42(5): 63-68.

[10] 李苗苗，張家韜，崔傳斌，等. 三株芽孢桿菌的生防特性研究[J]. 中國煙草科學，2020，41（4）：80-89.

LI M M, ZHANG J T, CUI C B, et al. Study on biocontrol characteristics of threestrains[J]. Chinese Tobacco Science, 2020, 41(4): 80-89.

[11] 李小杰，李成軍，姚晨虓，等. 拮抗煙草疫霉菌的木霉菌株篩選鑒定及防病促生作用研究[J]. 中國煙草科學，2020，41（3）：65-70.

LI X J, LI C J, YAO C X, et al. Screening, identification of antagonisticspp. against tobacco black shank and its growth promotion effect on tobacco[J]. Chinese Tobacco Science, 2020, 41(3): 65-70.

[12] 李苗苗，王曉強，王東坤，等. 生防菌復配對煙草黑脛病的防治效果研究[J]. 中國煙草科學，2020，41（2）：32-38.

LI M M, WANG X Q, WANG D K, et al. Effect of biocontrol agents mixture on control of tobacco black shank[J]. Chinese Tobacco Science, 2020, 41(2): 32-38.

[13] 張維，刁朝強，李斌，等. 復配拮抗菌FP246對煙草黑脛病和根際土壤微生物群落功能多樣性的影響[J]. 煙草科技，2019，52（7）：10-17.

ZHANG W, DIAO C Q, LI B, et al. Effects of combinatory antagonistic bacteria FP246 on tobacco black shank and functional diversity of rhizosphere soil microbial communities[J]. Tobacco Science and Technology, 2019, 52(7): 10-17.

[14] JAGANNATHAN S V, MANEMANN E, ROWE S, et al. Marine actinomycetes, new sources of biotechnological products[J]. Marine Drugs, 2021, 19(7): 365-394.

[15] KONG Q. Marine microorganisms as biocontrol agents against fungal phytopathogens and mycotoxins[J]. Biocontrol Science and Technology, 2017, 28(1): 1-17.

[16] 常棟，顧建國，賈方方，等. 煙草黑脛病不同植物源生防菌的篩選及防效測定[J]. 中國煙草學報，2020，26（3）：84-90.

CHANG D, GU J G, JIA F F, et al. Screening and control efficacy of different plant-derived biocontrol bacteria against tobacco black shank disease[J]. Acta Tabacaria Sinica, 2020, 26(3): 84-90.

[17] 國家煙草專賣局. 煙草病蟲害分級及調查方法：GB/T 23222—2008[S]. 北京：中國標準出版社，2008.

State Tobacco Monopoly Administration. Grade and investigation methods of tobacco diseases and insect pests: GB/T 23222—2008 [S]. Beijing: Standards Press of China, 2008.

[18] 關統偉，張小平，高貝樂，等. 放線菌系統分類技術[M]. 1版，北京：化學化工出版社，2016.

GUAN T W, ZHANG X P, GAO B L, et al. Classification technology of actinomycetes[M]. 1st Edition. Beijing: Chemical Industry Press, 2016.

[19] 陳娟妮，魯梅，丁偉，等. 納米氧化鋅對煙草疫霉菌的抑菌作用研究[J]. 植物醫生，2021，34（2）：34-40.

CHEN J N, LU M, DING W, et al. Study on the antifungal effect of zinc oxide nanoparticles on[J]. Plant Doctor, 2021, 34(2): 34-40.

[20] 寧爽. 內生假單胞菌BTa14、Bar25促生抗病作用及機理的研究[D]. 煙臺：煙臺大學，2016.

NING S. Study on the growth-promoting, disease-resistance effects and mechanisms of endophyticBTa14 and Bar25[D]. Yantai: Yantai University, 2016.

[21] 董國菊. 熒光假單胞菌P-72-10菌株對煙草黑脛病的生防機理研究[D]. 北碚：西南大學，2012.

DONG G J. Study on the biocontrol mechanism ofP-72-10 against tobacco black shank disease[D]. Beibei: Southwest University, 2012.

[22] 陳奇園，丁鑰琪，趙世民，等. 洛陽煙區煙株根圍抗煙草疫霉放線菌的篩選與鑒[J]. 煙草科技，2019，52（1）：22-28.

CHEN Q Y, DING Y Q ZHAO S M, et al. Screening and identification of antagonistic actinomycetes againstfrom rhizospheric soils in Luoyang tobacco-growing areas[J]. Tobacco Science & Technology, 2019, 52(1): 22-28.

[23] 黃大躍. 煙草疫霉生防菌的篩選及鑒定[J]. 現代農業科技，2020（18）：104-106.

HUANG D Y. Screening and identification of biocontrol bacteria aganst[J]. Modern Agricultural Science and Technology, 2020(18): 104-106.

[24] YANG Y, ZHANG S W, LI K T. Antagonistic activity and mechanism of an isolatedstain AUH-1 against phytopathogenic fungi[J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2019, 35(145): 1-9.

[25] 陳倩倩，邊傳紅，康業斌，等. 一株農用拮抗放線菌的分離與鑒定[J]. 中國煙草學報，2018，24（6）：134-139.

CHEN Q Q, BIAN C H, KANG Y B, et al. Isolation and identification of a strain of agricultural antagonistic actinomycete[J]. Acta Tabacaria Sinica, 2018, 24(6): 134-139.

[26] 王靜，孔凡玉，張成省，等. 放線菌F8對煙草黑脛病的拮抗作用及其產酶活性[J]. 中國煙草科學，2013，34（2）：49-53.

WANG J, KONG F Y, ZHANG C S, et al. Antagonism effect and enzyme-producing comparison ofF8 against tobacco black shank[J]. Chinese Tobacco Science, 2013, 34(2): 49-53.

[27] 鄒朔飛，董祥立，李繼業，等. 煙草黑脛病拮抗鏈霉菌篩選及田間防效試驗[J]. 山地農業生物學報，2021，40（2）：49-53.

ZOU S F, DONG X L, LI J Y, et al. Screening of antagonisticstrain against tobacco black shankand control effect trialin field[J]. Journal of Mountain Agriculture and Biology, 2021, 40(2): 49-53.

[28] CAPISTRAN L L, RODRIGUEZ R Z, CERVANTES T C, et al. Efficiency of marine bacteria and yeasts on the biocontrol activity ofin ancho-type pepper seedlings[J]. Agronomy, 2020, 10(408): 1-12.

[29] EL-AMRAOUI B, EL-AMRAOUI M, COHEN N, et al. Antifungal and antibacterial activity of marine microorganisms[J]. Annales Pharmaceutiques Fran?aises, 2014, 72(2): 107-111.

Screening, Identification of a Bacterial Strain against Tobacco Black Shank and Its Growth-promoting Effects

WANG Yayue1, JIA Fangfang1, LI Junying2, XU Yueqi2, YAN Haitao2, HE Xiaobing2, LIU Dongmei1, CHANG Dong2*

(1. Key Laboratory of Plant-Microbe Interactions, Department of Biology and Food Science, Shangqiu Normal University, Shangqiu, Henan 476000, China; 2. Pingdingshan Tobacco Company of Henan Tobacco Monopoly Bureau, Pingdingshan, Henan 467000, China)

To acquire excellent bacterial strains against tobacco black shack (TBS) disease, an actinobacteria DL157 with high antagonistic activity was isolated from marine sponge. Strain DL157 was identified asby morphologic observation, physiological and biochemical characterization and 16S rRNA sequence analysis. High relative control efficiency was observed in plate test, pot test and field test, with the inhibition rates being 60.28%, 69.2% and 83.5%, respectively. The hyphae cell wall structure ofwere destroyed by strain DL157 through secreting protease, cellulase and pectinase, causing cell wall damage and protoplasm leakage. Therefore, the growth ofwas inhibited. The seed germination and root growth of tobacco were promoted by strain DL157. And the soluble protein content and amylase activity of germinated tobacco seeds were increased. Moreover, genetic stability was observed in strain DL157 which still maintained high antagonistic activities after 50 passages. In summary,DL157 has the potential to be applied as antimicrobial agents against TBS disease.

tobacco black shack disease;; biological control; growth promoting

10.13496/j.issn.1007-5119.2022.06.009

S435.72

A

1007-5119（2022）06-0060-08

河南省煙草公司平頂山市公司科技項目（PYKJ202101）；河南省青年人才托舉工程資助項目（2020HYTP024）；國家級青年人才托舉工程資助項目（2017QNRC001）

王亞月（1990-），女，講師，博士，主要從事農作物病害的生物防治、環境中有毒污染物的生物降解以及酶構效關系與酶分子進化研究。E-mail：wangyayue@sqnu.edu.cn。

，E-mail：cd411@outlook.com

2022-03-20

2022-08-16