產氫菌XY-18在低溫條件下的產氫性能研究

徐葉　姜霽珊　黃志雄　郭鐵蘭　 孫奧　秦智

摘? 要： 利用間歇實驗對產氫菌XY-18和產氫菌XY-72進行了產氫性能相關實驗，比較了兩者的產氣量、產氫量、細胞干重、pH值和葡萄糖利用率等指標.研究結果表明：在溫度為20 ℃的條件下，產氫菌XY-18累計產氣量為4 333 mL?L，累計產氫量為3 946 mL?L，細胞干重為1.53 g?L，最佳產氫pH值范圍為4.5～4.9，葡萄糖利用率為96%. 結合對產氫量、細胞干重量和pH值等參數的綜合分析發現，產氫菌XY-18是一株能夠在低溫條件下具有較好產氫能力的厭氧產氫菌.

關鍵詞： 生物制氫; 低溫產氫; 間歇實驗; 產氫性能

中圖分類號：? Q 939.9????? ?文獻標志碼： A??? 文章編號： 1000-5137（2022）01-0064-06

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In this paper， the hydrogen-producing bacteria XY-18 and hydrogen-producing bacteria XY-72 were used to carry out hydrogen-producing experiments at the temperature of 20 ℃. The gas production， hydrogen production， cell dry weight， pH and glucose utilization rate of both were detected. The results showed that the total gas production of XY-18 was 4 333 mL?L， the total hydrogen production was 3 946 mL?L， the cell dry weight was 1.53 g?L， the optimal pH range was 4.5-4.9， and the glucose utilization rate was 96% at the temperature of 20 ℃. Combined comprehensive analysis of parameters including hydrogen production， cell dry weight and pH value showed that hydrogen-producing bacteria XY-18 is a low-temperature anaerobic hydrogen-producing bacteria that can produce hydrogen under at low temperature.

biological hydrogen production; low-temperature hydrogen production; batch experiment; hydrogen production performance

0? 引 言

氫氣是一種理想的清潔能源，氫氣的有效利用是解決能源短缺問題的方案之一.厭氧發酵微生物制氫技術可以有效地利用藻類生物質、纖維素、葡萄糖、淀粉等多種原料，與化學和物理方法相比，具有成本低、易于實施、制氫速度較快等優點.厭氧發酵微生物制氫法通過生物轉化進行生物制氫，是一種可用于工業化生產的制氫技術，近幾年成為最有效的制氫方法之一.

溫度是影響厭氧發酵微生物制氫速率的重要因素.根據不同厭氧菌的最適生長溫度，可將其分為超高溫產氫菌、嗜熱產氫菌、中溫產氫菌、低溫產氫菌等.目前，國內外研究主要關注了高溫、中溫對厭氧產氫菌產氫性能的影響.1） 高溫產氫菌的產氫溫度范圍一般在40～65 ℃.例如，戊糖發酵產氫菌W16在溫度為55～60 ℃時具有較好的生長和產氫效果，并在溫度為60 ℃時，產氫量達到最大值2.0 mol H（每mol 木糖）;厭氧發酵產氫菌 CBS-Z可生長的溫度為40～90 ℃，最適溫度為74 ℃.2） 中溫度產氫菌的產氫溫度范圍一般在25～40 ℃.例如，在培養溫度為40 ℃時，厭氧發酵木糖產氫菌FSC-15的產氫量最大;菌株Fanp3在溫度為15～35 ℃時，隨著溫度的升高，氫氣產量逐漸增加，最大產氫速率為39.0 mL?h （每g葡萄糖）;ECU-15在37 ℃時可獲得最佳產氫量2.07 mol H（每mol葡萄糖）;HE1在甘油質量濃度為50 g?L，溫度為35 ℃時，可獲得最佳產氫量為0.345 mol H（每mol甘油）.3） 低溫菌研究主要集中在發酵飼料、乳類食品、環境污水處理、食物保藏等方面.然而，目前對低溫產氫菌的篩選、產氫條件以及產氫機理的研究較少.

我國東北地區常年低溫，利用中高溫發酵進行生物制氫耗能巨大.因此，篩選在低溫條件下具有較高產氫能力的厭氧產氫菌，并將其應用于生物制氫生產過程具有重要意義.本研究選取經低溫馴化的產氫菌XY-18與常溫篩選的產氫菌XY-72的兩株菌株，通過間歇實驗，在溫度為20 ℃的條件下，比較分析了兩者的產氫量、pH值、細胞干重和葡萄糖利用率等參數，確定了產氫菌XY-18在低溫條件下的產氫能力和低溫耐受性，為后續開展深入研究提供參考.

1? 材料與方法

菌種來源

在實驗室厭氧發酵反應器馴化活性污泥，當其良好的產氫量達到穩定時，收取活性污泥，放置于低溫條件下培養，經過3～5代分離、純化、篩選，獲得低溫菌株XY-18，經16SrDNA測序和數據庫比對，鑒定為.同時，用同樣的方法，在常溫條件下篩選獲得常溫菌株XY-72，并鑒定為.

厭氧培養方法

菌株培養中的全部實驗操作基本采用了改進的hungate厭氧技術.

培養基

本實驗采用LM-1培養基：葡萄糖20 g?L、牛肉膏2 g?L、胰蛋白胨4 g?L、酵母浸粉1 g?L、磷酸二氫鉀1.5 g?L、氯化鈉4 g?L、六水合氯化鎂0.1 g?L、七水合硫酸亞鐵0.1 g?L、L-半胱氨酸0.5 g?L、微量元素液10 mL?L、維生素液10 mL?L、刃天青0.000 2 g?L.將瓊脂粉15 g添加到1 L液體培養基中獲得固體培養基.將配制好的培養基放入滅菌鍋中，設置121 ℃，20 min滅菌.

實驗裝置

本實驗用間歇實驗裝置進行研究，間歇實驗裝置如圖1所示.

分析方法

1.5.1 產氣量和產氫量的測定

使用間歇實驗裝置（圖1）測量厭氧發酵產氫菌的產氣量.將產氫菌XY-18和產氫菌XY-72按1%的接種量接入100 mL培養基中，置于恒溫振蕩培養器中，20 ℃，120 r?min振蕩培養，每1 h測定產氣量.測定過程中，水準瓶液面與氣體計量管液面持平，以保證測定數值的準確性.氫氣量測量采用氣相色譜法.

1.5.2 pH值和細胞生物量的測定

從間歇實驗裝置的取樣口取出5 mL發酵液，使用pH計測定其pH值.將5 mL發酵液在12 000 r?min條件下離心5 min，棄上清液，用生理鹽水洗2次，105 ℃烘干至恒重，用分析天平稱量其質量，即為細胞干重.

1.5.3 葡萄糖含量的測定

采用北京盒子生工科技有限公司生產的葡萄糖含量檢測試劑盒（GOPOD Format）測定.葡萄糖氧化酶（GOD）催化葡萄糖氧化為葡萄糖酸，并釋放出HO.過氧化物酶（POD）催化HO氧化4-氨基安替比林偶聯酚，生成紅色醌類化合物.實驗過程中，通過測定產物在505 nm的吸光度變化，定量葡萄糖含量.

2? 結果和分析

隨培養時間變化的累計產氣量

低溫產氫菌XY-18和常溫產氫菌XY-72在溫度20 ℃條件下的產氣量隨培養時間的延長逐漸上升（圖2）.產氫菌XY-18在培養13 h后開始產氣，13～72 h內產氣量明顯增加，72 h后產氣量趨于穩定，96 h內累計產氣量達到4 333 mL?L;而產氫菌XY-72在培養17 h后開始產氣，隨后各相同時間段的產氣量均低于XY-18（圖2）.在培養60 h后，產氫菌XY-18累計產氣量比XY-72高252.3%，甚至產氫菌XY-18在培養60 h后的累計產氣量比產氫菌XY-72在培養96 h后累計產氣量高496 mL?L;在培養96 h后，產氫菌XY-18的累計產氣量比產氫菌XY-72的累計產氣量高1 873 mL?L（圖2）.由此可知，產氫菌XY-18更適合應用于低溫條件下的厭氧發酵.

隨培養時間變化的累計產氫量和產氫效率

圖3（a）為低溫產氫菌XY-18和常溫產氫菌XY-72隨培養時間的累計產氫量情況.產氫菌XY-18在培養20 h后進入產氫階段，在24 h內累計產氫量只有46 mL?L;24～72 h內累計產氫量為2 564 mL?L;72～96 h內產氫較緩慢，累計產氫量為285 mL?L.產氫菌XY-72在培養24 h后開始產氫，同時間段其累計產氫量均低于產氫菌XY-18，如圖3（a）所示.產氫菌XY-18在44 h內的累計產氫量比產氫菌XY-72在76 h內的累計產氫量高60 mL?L;產氫菌XY-18在64 h內的累計產氫量比XY-72培養96 h時的累計產氫量高126 mL?L;在72 h時，產氫菌XY-18累計產氫量比產氫菌XY-72高1 675 mL?L，如圖3（a）所示.

產氫菌XY-18和產氫菌XY-72的產氫效率隨著時間先上升，然后達到穩定狀態，如圖3（b）所示.產氫菌XY-18在20 h內的產氫效率為0.03 mol H/mol葡萄糖，而產氫菌XY-72在20 h內不產氫;產氫菌XY-18在48 h內的產氫效率達到最高（0.69 mol H/mol葡萄糖），比產氫菌XY-72產氫效率高0.07 mol H/mol葡萄糖;在20～72 h內產氫菌XY-72的產氫效率均低于產氫菌XY-18，如圖3（b）所示.由此可見，在溫度20 ℃下，產氫菌XY-18比產氫菌XY-72產氫能力強.產氫菌XY-18在溫度為20 ℃時的產氫時間更長，產氫量更高，產氫效果更好.

隨培養時間的生物量變化

產氫菌XY-18和產氫菌XY-72在溫度20 ℃下的生物量隨培養時間發生變化，如圖4所示.產氫菌XY-18在培養12 h后細胞干重增加量為0.42 g?L;在12～44 h內細胞干重明顯增加，從0.42 g?L上升到1.44 g?L，這段時間包括對數期和穩定期的初期，說明此時間段菌體生長較快，菌量迅速增加;在44～72 h內，細胞干重在1.44～1.53 g?L范圍內波動;在培養了72 h后，XY-18的細胞干重達到了最大值1.53 g?L;而在72～96 h內，細胞干重從1.53 g·L降至1.02 g·L.產氫菌XY-18比產氫菌XY-72更早進入產氫階段，產氫菌XY-72在相同時間段的細胞干重均低于產氫菌XY-18，產氫菌XY-18培養35 h后的細胞干重比產氫菌XY-72培養72 h后大0.16 g·L，如圖4所示.因此，從生物量變化看，產氫菌XY-18更適合在低溫條件下生長.

發酵過程中的值變化

在溫度為20 ℃時，產氫菌XY-18和XY-72的pH值會隨培養時間發生變化（圖5）.在相同初始pH值和溫度的培養條件下，產氫菌XY-18的pH值隨著培養時間增加，先減小后增大，而產氫菌XY-72的pH值變化趨勢則是逐漸減?。▓D5）.產氫菌XY-18在培養后pH值開始減小，19 h時，降至5.0，這比產氫菌XY-72提早很多;在19～52 h pH值為4.5;在培養52 h后，pH值突然上升，在72 h時，pH值為4.9;在發酵終止時，pH值為4.8（圖5）.通常情況下，產氫菌發酵過程中培養基的pH值過低，這不利于菌體的生長和產氫.因此，及時調節培養基pH值，有利于確保菌體的生長和產氫.當pH值穩定在4.5～4.9時，此時產氫菌XY-18的產氫效果比XY-72的產氫效果好.這表明，產氫菌XY-18生長和發酵產氫的最適pH范圍是4.5～4.9.

葡萄糖利用率

產氫菌XY-18和產氫菌XY-72在20 ℃下的葡萄糖利用率情況如圖6所示.在發酵產氫過程中，培養基的初始葡萄糖質量濃度為10 g?L.在培養96 h后，產氫菌XY-18發酵液的葡萄糖質量濃度降至0.04 g?L，產氫菌XY-72發酵液的葡萄糖濃度降至0.09 g?L.產氫菌XY-18的葡萄糖利用率為96%，比產氫菌XY-72的高5%.由此可見，產氫菌XY-18比產氫菌XY-72更適合在20 ℃下產氫發酵.

3? 結 論

本研究在不同溫度條件下通過分離純化獲得了不同的產氫菌，并對其產氫性能進行對比研究.研究發現：在以葡萄糖為底物，溫度為20 ℃，初始pH值為6.7和厭氧的條件下，產氫菌XY-18最終累計產氫量比XY-72高1 386 mL·L culture，產氫菌XY-18連續培養72 h獲得最大生物量1.53 g?L;不同菌株的產氫對pH值的要求不同，產氫菌XY-18最佳產氫pH值范圍在4.5～4.9，XY-72最佳產氫pH值為5.3～5.5.通過分析產氫量、pH值、生物量等指標得出，產氫菌XY-18具有以下優點：1） 可以在較低的溫度生長產氫;2） 有效利用葡萄糖發酵產氫.綜合分析得出，產氫菌的產氣量與其生物量有關，還受到發酵環境的制約.產氫菌XY-18在低溫條件下的產氫性能較好，為后續開展低溫條件的發酵產氫研究提供了理論依據，為將來應用于低溫處理有機廢水提供了可能性.

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（責任編輯：顧浩然，郁慧）

收稿日期： 2021-11-11

基金項目： 上海植物種質資源工程技術研究中心項目（17DZ2252700）;上海市協同創新中心項目 （ZF1205）

作者簡介： 徐 葉（1994—），女，碩士研究生，主要從事環境微生物方面的研究. E-mail： 1548271452@qq.com

* 通信作者： 秦 智（1974—），女，教授，主要從事環境微生物技術方面的研究. E-mail： qinzhi@shnu.edu.cn

引用格式： 徐葉， 姜霽珊， 黃志雄， 等. 產氫菌XY-18在低溫條件下的產氫性能研究 [J]. 上海師范大學學報（自然科學版），2022，51（1）：64-69.

?XU Y， JIANG J S， HUANG Z X， et al. Research on the hydrogen production performance of cryogenic hydrogen-producing bacteria XY-18 at low temperature conditions [J]. Journal of Shanghai Normal University（Natural Sciences），2022，51（1）：64-69.