動物源性食品中16種β-受體激動劑高靈敏檢測與膳食暴露評估

牛秀麗 王君 孫世琨 蘇阿龍 劉煜

摘 要：為有效開展食品安全風險評估，對β-受體激動劑（瘦肉精）進行有效監管，本研究以超高效液相色譜-串聯質譜（UPLC-MS/MS）聯用法建立了動物源性食品中16種痕量β-受體激動劑的檢測方法。經酶解、提取、固相萃取凈化，采用多反應監測（MRM）同時捕集16種目標分子母離子-子離子離子對，7.5 min內實現高效、準確分離測定。16種目標物加標回收率為64.5%～112.3%，日間精密度0.62%～1.37%，保留時間偏差為0.010～0.042，檢出限為0.05～0.84 ?g/kg，定量限為0.17～2.76 ?g/kg。應用本方法完成261批動物源性食品的安全風險監測，實現快速準確的批量篩選，發現21批樣品中殘留11種β-受體激動劑。依據風險監測研究結果對β-受體激動劑進行膳食暴露評估，發現當同一動物組織中同時含有多種受體激動劑，總含量超過1.08 ?g/kg時將增加健康風險。

關鍵詞：β-受體激動劑;痕量檢測;膳食暴露評估;萊克多巴胺

Abstract： In order to effectively carry out food safety risk assessment and effectively supervise for the β-agonists， a method for the detection of 16 trace β-agonists in animal-derived food was established by ultra-high performance liquid chromatography- tandem mass spectrometry （UPLC-MS/MS）. After enzymatic hydrolysis， extraction， and solid-phase extraction purification， 16 target molecular precursor ion-product ion ion pairs were simultaneously captured by multiple reaction monitoring （MRM）， and accurate separation and determination were achieved within 7.5 minutes. The recovery rates of 16 target compounds were 64.5%～112.3%， the inter-day precision was 0.62%～1.37%， the retention time deviation was 0.010～0.042， the detection limit was 0.05-0.84 ?g/kg， and the quantification limit was 0.17～2.76 ?g/kg. Using this method， the safety risk monitoring of 261 batches of animal-derived food was completed. Fast and accurate batch screening was achieved， and 11 β-receptor agonists were found in 21 batches of samples. Dietary exposure to beta-agonists was assessed based on the results of risk surveillance studies. Increased health risk was found when multiple receptor agonists were present in the same animal tissue at a total level of more than 1.08 ?g/kg.

Keywords： β-receptor agonist; trace detection; dietary exposure assessment; ractopamine

“瘦肉精”是指腎上腺素受體激動劑類（β-興奮劑），主要包括鹽酸克侖特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇等。β-興奮劑類既不是獸藥，也不是飼料添加劑，其可有效促進動物的肌肉生長，提高動物酮體的瘦肉率并使其增重。β-興奮劑易蓄積在動物體內，食用含有殘留腎上腺素受體激動劑的動物源性食品會造成人體的急性或慢性中毒，嚴重者會有生命危險，威脅生命安全。從對食品安全的管控和消費者健康角度出發，國內禁止使用“瘦肉精”類藥物用于食品動物的飼養生產過程，但在動物飼養過程中“瘦肉精”仍屢禁不止[1-4]，2021年3月15日，央視“3·15”晚會再次曝光了“瘦肉精羊”事件。

對于β-受體激動劑的分析技術，國內外相關研究通常采用液相色譜-質譜聯用法[5-6]、氣相色譜-質譜聯用法[7]、毛細管電色譜耦合質譜法[8]、高效液相色譜法[9]、免疫分析法[10]、毛細管電泳法[11]、電化學傳感器方法[12-13]和表面增強拉曼光譜法[14]等。由于液相色譜-串聯質譜法準確度高、無假陽性、檢出限低、重現性好和無需衍生等特點，β-受體激動劑類藥物殘留檢測國家標準主要采用液相色譜-質譜聯用法。然而，由于腎上腺素受體激動劑品種多、化學結構和性質各異、待測組分復雜，殘留水平一般較低和煩瑣冗長的樣品前處理過程一直干擾著檢測結果的準確性，因此需要更高效靈敏的前處理技術和檢測技術實現對其準確快速的測定。本研究利用固相萃取處理與超高效液相色譜-串聯質譜技術，實現對16種β-受體激動劑的準確、快速、定量檢測分析，并開展受體激動劑膳食暴露研究。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑

儀器：超高效液相色譜-串聯質譜聯用儀（Q TRAP 5500 AB Sciex Instruments）;均質器（SilentCrusher M，德國海道夫公司）;渦旋混合器（VORTEX 3，德國IKA）;超速離心機（Sorvall LYNX6000，Thermo Scientific）;氮吹儀（N-EVAP-45，Organomation）;恒溫搖床（MaxQ 420 HP，Thermo Scientific）;正壓固相萃取儀（SPE，J2 Scientific）;超聲波清洗器（Elmasonic P120H，Elma）;超純水系統（Thermo Scientific）;-40 ℃冰箱（HYCD-282，青島海爾）;電子天平（XSE 105DU，梅特勒托利多）。

標準樣品：沙丁胺醇（99.9%）、特布他林（99.0%）、鹽酸克倫特羅（99.0%）、鹽酸萊克多巴胺（96.1%）、西馬特羅（99.9%）、鹽酸多巴胺（99.0%）、馬布特羅鹽酸鹽（>98.0%）、氯丙那林（99.6%）、非諾特羅（99.0%）、馬噴特羅鹽酸鹽（>98.0%）和酒石酸福莫特羅（98.2%），上述11種標準樣品均購自Dr.Ehrenstorfer GmbH公司;鹽酸溴布特羅（99.0%）和苯乙醇胺A（99.0%）購自天津阿爾塔科技有限公司，鹽酸妥布特羅（99.0%）和苯氧丙酚胺鹽酸鹽（98.0%）購自Bepure公司，鹽酸齊帕特羅（98%）購自南京生利德生物科技有限公司。

試劑：β-葡萄糖醛甙酶/芳基硫酸酯酶（10 000 units/mg，MERCK）;甲酸、甲醇、乙腈（MERCK色譜純試劑），其他試劑均為分析純;固相萃取柱：MCX強陽離子交換SPE柱（60 mg，3 mL，Waters）。

1.2 試驗方法

1.2.1 β-受體激動劑標準溶液配制

準確稱取適量沙丁胺醇、特布他林、鹽酸克倫特羅、鹽酸萊克多巴胺、西馬特羅、鹽酸多巴胺、馬布特羅鹽酸鹽、氯丙那林、非諾特羅、馬噴特羅鹽酸鹽、酒石酸福莫特羅、鹽酸溴布特羅、苯乙醇胺A、鹽酸妥布特羅、苯氧丙酚胺鹽酸鹽和鹽酸齊帕特羅標準品，用甲醇溶解并分別配制成100 ?g/mL的單一物質β-受體激動劑儲備液，避光保存于-18 ℃冰箱內，有效期12個月。準確移取0.5 mL上述16種單一物質標準儲備液至50 mL容量瓶中，用甲醇稀釋定容，配制成1.0 ?g/mL 16種β-受體激動劑混合標準儲備液。工作液現用現配，使用前用流動相（0.1%甲酸-乙腈，96∶4，V/V）由混標儲備液逐級稀釋，配制成濃度范圍為1.42～276 ?g/kg的混合標準工作液。

1.2.2 儀器分析

（1）色譜條件。Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 ?m）;柱溫：40 ℃;樣品室溫度：4 ℃;進樣體積：5.0 ?L;流動相A：0.1%（V/V）甲酸水溶液;流動相B：乙腈;流速：0.30 mL/min;梯度洗脫條件：0.00～2.00 min，4% B;2.00～10.0 min，4%～65% B;10.00～10.11 min，65%～4% B。

（2）質譜條件。離子化方式：電噴霧（ESI）離子源;正離子多反應監測（MRM）掃描;氣簾氣：35 psi;碰撞氣：Medium;噴霧電壓：5 500 V;霧化溫度：550 ℃;霧化氣：55 psi;輔助加熱氣：50 psi。試驗所用脫溶劑氣為高純氮氣，碰撞氣為高純氬氣，使用前調節各氣體流量以使質譜靈敏度達到檢測要求。

1.2.3 樣品制備

稱取2 g（精確到0.01 g）樣品于50 mL離心管中，加入8 mL乙酸鈉溶液，再加50 ?L β-葡萄糖醛甙酶/芳基硫酸酯酶，充分混勻，37 ℃水浴水解12 h。水解完成后高速冷凍離心10 min，轉數22 000 r/min，冷凍離心溫度-10 ℃。離心完畢，取出離心管去除油脂層，將上清液全部轉移至潔凈離心管中，再次高速冷凍離心去除油脂層。最后，準確移取4 mL上清液轉移至50 mL離心管中，加入10 mL飽和氯化鈉溶液和10 mL異丙醇-乙酸乙酯（6+4）混合溶液充分提取;提取完成后7 000 r/min離心10 min，轉移全部有機相，40 ℃水浴下氮氣吹干，加入5 mL乙酸鈉緩沖液，超聲至充分溶解，待凈化。

MCX固相萃取柱先用3 mL甲醇和3 mL水活化，將上述殘渣溶液全部過柱，然后依次用3 mL水、3 mL 2%甲酸水溶液和3 mL甲醇淋洗，氮氣加壓抽干。用5 mL 5%氨水-甲醇溶液洗脫。收集洗脫液，在40 ℃水浴下氮氣吹干，殘余物用流動相1.0 mL溶解后，渦旋混勻，過0.22 ?m微孔濾膜，供UPLC-MS/MS測定。

2 結果與分析

2.1 16種β-受體激動劑檢測質譜參數的確定

利用針泵進樣將16種β-受體激動劑的混合標準溶液注入質譜儀中優化質譜參數。目標物進入電噴霧離子源后，均能夠形成穩定的加合離子，以ESI正離子模式對激動劑藥物進行母離子確認及子離子全掃描。本方法根據待測目標物的保留時間，采用分段掃描的方式對不同藥物的特征離子進行數據采集，以提高靈敏度。16種β-受體激動劑的保留時間及定性、定量離子、去簇電壓和碰撞能量等質譜條件見表1。

2.2 方法學驗證

移取1.0 ?g/mL的β-受體激動劑混合標準儲備液，用流動相（乙腈-0.1%甲酸水溶液，4∶96，V/V）配制成系列濃度的混合標準溶液，以各組分的濃度與其定量離子峰面積進行線性回歸。由表2可知，各受體激動在1.42～276 ?g/kg濃度范圍內呈良好的線性關系（R>0.991），檢出限為0.05～0.84 ?g/kg、定量限為0.17～2.76 ?g/kg。

回收率及精密度試驗以空白豬肉為待測樣品，準確稱取3份豬肉空白樣品，添加低、中、高3個不同水平的16種β-受體激動劑混合標準溶液，進行前處理，測定目標化合物。16種β-受體激動劑在3個添加水平下的回收率為64.5%～112.3%。同一濃度樣品日間精密度相對標準偏差為0.62%～1.37%，保留時間偏差為0.010～0.042。本方法從選擇性、靈敏性、穩定性等方面均適用于動物源性食品中16種β-受體激動劑高靈敏檢測，滿足國內外法規對β-受體激動劑殘留檢測要求的執行限量。

2.3 實際樣品檢測

采集動物源性食品樣品豬肉160批，豬肝臟31批，牛肉27批，羊肉26批，羊腎臟5批，豬心臟12批，總計261批。按照本文前處理方法與超高效液相色譜-串聯質譜聯用分析技術對采集樣品進行測定，檢測到21批樣品中有β-受體激動劑的存在，總體檢出率約為8.05%，其他240批樣品未檢出β-受體激動劑。其中檢測到11種β-受體激動劑的殘留及含量分別為：萊克多巴胺0.17～4.48 ?g/kg、多巴胺2.98～3.04 ?g/kg、馬布特羅2.99 ?g/kg、非諾特羅1.78 ?g/kg、苯乙醇胺A 36.23 ?g/kg、齊帕特羅3.40～6.08 ?g/kg、溴布特羅4.74～5.37 ?g/kg、福莫特羅0.54 ?g/kg、氯丙那林3.34 ?g/kg，沙丁胺醇和特布他林有檢出但低于定量限0.17 ?g/kg和0.55 ?g/kg。結果表明動物飼養過程中存在喂食β-受體激動劑類物質情況，僅1批豬肉樣品中苯乙醇胺A含量較高，個別肌肉及腎臟組織中存在受體激動劑多殘留現象，未檢測到克倫特羅、妥布特羅、西馬特羅、苯氧丙酚胺和馬噴特羅的存在。圖1顯示了實際樣品中檢測到11種受體激動劑殘留的選擇離子流圖。

2.4 指紋特征研究

圖2a為空白樣品圖譜，圖2b、2c、2d分別為豬肌肉、豬心樣品和有受體激動劑檢出的豬心樣品的總離子流圖譜。研究發現，相同樣品前處理條件與采集分析過程，動物的肌肉樣品與腎臟樣品譜圖完全不同，在豬心樣品5.0 min出現一未知物高峰，而對于肌肉樣品是不存在的，如圖2b、2c所示。因此，對于未知樣品可利用樣品譜圖的相似性明確判定動物食品的組織部位，從而更有效的監測受體激動劑的殘留部位。通過圖2c和2d指紋譜對比可清晰確認受體激動劑組分的存在，例如，圖2d中3.15 min、3.02 min出現兩個峰對應物質為沙丁胺醇和特布他林。該指紋特征能夠為動物源性食品中受體激動劑檢測明確判定提供重要參考價值，

2.5 食品安全膳食評估

2.5.1 受體激動劑膳食暴露量評估依據

本研究根據所測得食物樣品中β-受體激動劑污染水平和居民的食物消費量數據計算得到每人每日膳食暴露量[15-16]。計算公式為：

式中：D-每人每日膳食暴露量，?g/（kg bw·d）;C-某類食物中β-受體激動劑含量，?g/kg;F-某類食物的消費量，g/d;W-體重，kg，體重按《2002年中國居民營養與健康狀況調查報告》中的中國標準人體重63 kg計。

將獲得的每人每日膳食暴露結果與食品添加劑聯合專家委員會（JECFA）進行的風險評估結果得出的每日允許攝入量（ADI）值進行比較，得出暴露量占ADI值的百分比，安全性分析計算為：

占ADI值=D/ADI×100%

2.5.2 受體激動劑理論最大暴露量評估

以JECFA采用的動物性食品每日允許攝入量計算克倫特羅、沙丁胺醇和萊克多巴胺的理論暴露量。由于我國β-受體激動劑類藥物如萊克多巴胺、克倫特羅、沙丁胺醇等在所有動物食品中不得檢出，在屠宰環節萊克多巴胺、克倫特羅、沙丁胺醇等允許檢出為0.50 ?g/kg。因此，本研究風險暴露評估以克倫特羅和沙丁胺醇ADI值0.004 ?g/（kg bw），萊克多巴胺ADI值1 ?g/（kg bw）為基準，以屠宰環節受體激動劑克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇為例，對理論暴露污染物進行評估。屠宰環節對肌肉及脂肪未明確規定視為不得檢出，本研究假設對肌肉、脂肪按方法最低檢出濃度的1/2進行處理取值，即0.25 ?g/kg，未檢出樣品也按照方法最低檢出濃度的1/2進行處理取值，理論暴露量計算結果見表3。

由表3可知，動物性食品中克倫特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇的總理論暴露量均小于相應的ADI值，分別占ADI值的63.44%、23.83%和59.54%，人體食入處于最大殘留限量水平的食品的暴露量均低于ADI值，相對比較安全。由此可見，食用殘留水平超過最大殘留限值并不意味著一定對消費者有直接的健康風險，僅當每日膳食攝入量超過ADI值時會對消費者帶來健康風險。

2.6 受體激動劑膳食暴露評估

歐洲食品安全局（EFSA）提出對具有遺傳毒性和致癌性的物質的風險描述采用暴露邊界值（Margin of Exposure，MOE）法，MOE是對動物或者人導致很小但可衡量作用的劑量與人或者動物的暴露量的比值。若物質導致不良作用的劑量與人群的攝入量越接近，即MOE值越低，表明對人群健康的危害越大。MOE按照公式計算如下：

MOE=BMDL10/D（2）

式中：MOE-暴露邊界值;BMDL10-某種物質使10%的受試動物發生不良反應的劑量（統計數據），?g/（kg bw·d）;D-某有害物質暴露量，/（kg bw·d）。

由于目前尚沒有一個國際通用標準用來判定MOE值達到何種水平方表明危害物質的膳食暴露不對人體產生顯著健康風險，風險評估結果的不確定性主要來源于數據資料的局限性和對毒理學、流行病學研究得到的客觀資料分析和解釋。因此，本研究BMDL10值擬采用克倫特羅每日容許攝入量ADI值0.004 ?g/（kg bw）來計算（1996年食品添加劑專家聯合委員會第四十七會議提出）;萊克多巴胺BMDL10值擬采用萊克多巴胺每日容許攝入量ADI值1 ?g/（kg bw）來計算（2006 年食品添加劑專家聯合委員會第六十六屆會議）;其他9種受體激動劑BMDL10值擬參考克倫特羅的每日容許攝入量ADI值0.004 ?g/（kg bw）來計算。

本研究共檢測動物食品肉類樣本261批，檢出11種受體激動劑殘留21批，檢出率8.05%，檢出的11種受體激動劑含量范圍為0.17～36.23 ?g/kg，根據聯合國糧農組織數據中國人均每天肉類食品消費量（2004年）155.46 g，假設內臟類食品消費量為肉類的1/2，即77.73 g，結合檢測結果評估動物肌肉及內臟食品中受體激動劑對人體健康的風險，結果見表4。

由表4可知，MOE值在0.031～6.450，隨著MOE值的增加，暴露風險降低，前期研究發現，同一動物組織可能同時存在多種受體激動劑的情況，總暴露量MOE值低至0.02，暴露風險較高。按照國際食品法典委員會克倫特羅ADI值為0.004 ?g/（kg bw），則動物食品中受體激動劑測定總含量控制在1.08 ?g/kg對于人體健康相對安全。當動物組織中受體激動劑含量高于1.08 ?g/kg時，持續攝入可能具有較大的健康風險。因此為降低健康風險，建議消費者購買經檢驗檢疫合格的動物食品。

3 結論

本研究采用固相萃取前處理，通過超高效液相色譜-串聯質譜技術建立了動物源性食品中16種β-受體激動劑殘留高靈敏、高選擇檢測方法。結果表明，在動物源性食品中檢測到多種受體激動劑殘留，進而確定動物飼養過程中可能存在喂食β-受體激動劑類藥物情況。進一步根據研究結果進行膳食暴露評估，表明持續攝入含受體激動劑動物食品將增加健康風險。本研究為加強生豬養殖、屠宰過程中違法使用不同種類“瘦肉精”的監管提供了可靠的技術支撐，也可為動物源性食品中獸藥殘留、激素殘留監控提供嶄新的思路和方法，可實現食品安全問題的早發現、早處理，全面提高動物源性食品中藥物殘留的安全監管能力。

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