乳清蛋白源降糖肽的酶法制備及工藝優化

范堯珠，張璐，曹加彪，李倩茹，王雪峰

云南農業大學食品科學技術學院（昆明 650201）

糖尿病是主要由遺傳及環境兩類因素共同作用，導致體內胰島素分泌不足或胰島素作用受限而引起代謝紊亂，以及后續氧化還原平衡破壞，以高血糖為特征的一種終身慢性全身代謝疾病[1]，與癌癥、心血管疾病并稱為世界三大疑難雜癥[2]。到2008年，糖尿病影響世界上約4%的人群，并且根據國際糖尿病聯盟（International Diabetes Federation，IDF）在2015年的預測，這一數字到2025年將增加到5.4%[3]。隨著人民生活水平的提高，營養物質攝入過剩，工作節奏加快和不健康飲食習慣的形成，糖尿病的防治問題引起廣泛關注。

對于糖尿病的治療主要可從2個方面入手：一方面可以通過肌肉注射降低血糖水平的激素，另一方面可以服用降血糖藥物[4]。胰島素自被發現后，就成為治療糖尿病的主要手段，但是，胰島素不能口服，只能通過肌肉注射的方式降低患者血糖水平，對患者不免造成一些不便。口服的阿卡波糖、米格列醇、伏格列波糖等降糖藥物不僅可能會對人體的肝臟、腎臟產生潛在危害，而且會由于長時間的給藥造成治療成本過高[5-7]。因此，研究安全且有效的降糖藥物已成為全世界關注的焦點[8]。具有降血糖功效的天然產物——植物源降糖多肽，因來源廣泛、副作用小等優勢逐漸成為研究和開發降糖藥物的熱點[9]。降糖肽與其他小分子降糖物質相比，用藥劑量更小，活性更高，且代謝終產物為易吸收的氨基酸[10]。苦瓜多肽、發酵大豆多肽、黑豆多肽等[11-15]被證明有降糖功效。研究發現一些降糖肽相對于臨床藥物的效果來說與之相近，甚至有更好效果[16]。

試驗以前期對乳清水進行超濾、透析、冷凍干燥技術等獲得的乳清蛋白粉為原料，通過酶法制備乳清蛋白肽，以α-葡萄糖苷酶抑制率為評價指標，對酶解溫度、酶解pH、酶解時間、液料比4個因素進行單因素試驗和響應面法優化分析，確定最佳工藝條件。此次試驗為乳清蛋白源降糖肽等高附加值產品的研發提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗原材料

乳清蛋白（由乳清水提取，在-80 ℃冰箱中保存備用）。

1.1.2 主要試驗器材、試劑

木瓜蛋白酶、α-葡萄糖苷酶（上海源葉生物科技有限公司）；對硝苯基-α-D吡喃半乳糖苷（PNPG，上海寶曼生物科技有限公司）；氯化鈉、PBS緩沖液（天津市鳳船化學試劑科技有限公司）；鹽酸[重慶川東化工（集團）有限公司]。

純水機[奧豪斯儀器（常州）有限公司]；高速冷凍離心機（北京中興偉業儀器有限公司）；電子天平、pH計[奧豪斯儀器（常州）有限公司]；電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學儀器有限公司）；酶標儀（Thermo Fisher Scientific）；-80 ℃冰箱（長虹美菱股份有限公司）；超濾杯（上海軒儀儀器設備有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 乳清蛋白源降糖肽的制備

乳清蛋白源降糖肽的制備參考王雪峰等[17]的方法，并稍作修改。將乳清水過濾、透析冷凍干燥后，提取出蛋白質，再用木瓜蛋白酶對其進行水解，得到的乳清源蛋白多肽用α-葡萄糖苷酶對其生物活性進行分析研究。

1.2.2 乳清蛋白的提取

用10 mol/L NaOH溶液將乳清水原料調節pH為7.5，加入12 mL 1 mol/L的CaCl2溶液在60 ℃水浴鍋中攪拌15 min，在高速冷凍離心機中離心35 min（4 000 r/min、4 ℃），取上清液進行粗濾、微濾以及超濾（10 kDa），取上層超濾液透析24 h，進行冷凍干燥，取得乳清蛋白。

1.2.3 酶解制備乳清蛋白降糖肽工藝過程

稱取0.1 g乳清蛋白凍干粉，加入純水，液料比為30∶1 mL/g，勻漿5 min，加入0.004 g木瓜蛋白酶，將酶解液放入50 ℃水浴中鍋中酶解5 h，酶解過程中保持pH 7.0，酶解結束后，在95 ℃條件下水浴5 min以滅酶，以4 000 r/min離心30 min，測定乳清蛋白肽對α-葡萄糖苷酶的抑制率。

1.2.4 單因素試驗

在其他條件一定的情況下，選擇初始pH（4，5，6，7，8和9）、酶解時間（2，3，4，5和6 h）、液料比（10∶1，20∶1，30∶1，40∶1和50∶1 mL/g）和酶解溫度（40，45，50，55和60 ℃）這4個因素作為單因素，研究每個因素對酶水解產物的α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響。其中，1個作為單個因子時，其他3個單個因子的固定水平為初始pH 7.0、酶解時間5 h、液料比30∶1 mL/g、酶解溫度50 ℃。

1.2.5 響應面法試驗

在單因素試驗基礎上，根據Box-Behnken中心組合試驗設計原理，設計四因素三水平的響應面試驗，以對α-葡萄糖苷酶抑制活性為指標，對酶解條件進行優化。因素水平表見表1。

表1 響應面分析因素及水平表

1.2.6α-葡萄糖苷酶抑制活性的測定

采用pNPG法測定α-葡萄糖苷酶抑制活性，參照Lordan等[18]的方法，并稍作修改。用20 mmol/L pH 6.8的磷酸鹽緩沖液（PB），將抑制α-葡萄糖苷酶與PNPG分別配制成200 U/mL和10 nmol/L的溶液，移取50 μL的樣品溶液和50 μL的α-葡萄糖苷酶溶液于96孔微量滴定板中，在37 ℃保溫10 min，加入50 μL PNPG溶液，用磷酸鹽緩沖液補充使各組體積相等，在37 ℃條件下充分反應1 h，加入50 μL 1 mol/L的Na2CO3溶液終止反應，使用酶標儀確定每個樣品在405 nm處的最大吸光度。α-葡萄糖苷酶抑制率計算如式（1）所示。

式中：Ac為對照組吸光度，PB+酶+pNPG+Na2CO3；Ab為空白組吸光度，PB+PB+pNPG+Na2CO3；As為樣品組吸光度，多肽+酶+pNPG+Na2CO3；An為樣品空白組吸光度，多肽+PB+pNPG+Na2CO3。

1.3 數據處理

采用Excel 2010對試驗數據進行整理，利用Design- Expert 8.0.6進行響應面分析、SPSS 24對數據進行方差顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 酶解單因素試驗

2.1.1 pH對酶水解產物活性的影響

pH對酶水解產物活性的影響見圖1。pH的影響起伏較小，pH 5時，酶水解產物對α-葡糖苷酶的抑制率最好，為28.99%。當pH 4或者pH＞5時，α-葡萄糖苷酶抑制率呈下降趨勢，這可能是因為木瓜蛋白酶在不適宜的環境導致酶的空間構造發生變化，使部分酶活性降低所致[19]。由此可見，最佳pH為5。

圖1 pH對酶水解產物活性的影響

2.1.2 酶解時間對酶水解產物活性的影響

從圖2可以看出，抑制率在約4 h達到峰值，比3 h的產物抑制率提高9%左右，α-葡萄糖苷酶的抑制率在4 h后，可能是由于底物中包含可溶性和不溶性蛋白，可溶性蛋白質的敏感肽鍵將在早期斷裂，而不敏感肽鍵將在后期斷裂。在5 h的酶水解之后，活性肽鍵被過度酶解，蛋白結構被破壞，因此酶產物的α-葡萄糖苷酶抑制率大幅降低[20]。因此，酶解時間應控制在4 h。

圖2 酶解時間對酶解產物活性的影響

2.1.3 液料比對酶水解產物活性的影響

液料比對酶解產物α-葡萄糖苷酶抑制率的影響見圖3。液料比30∶1 mL/g時，α-葡萄糖苷酶的抑制率達到最高點，說明此時液料比適當，水解產物對α-葡萄糖苷酶的抑制效果最好。液料比大于30∶1 mL/g時，抑制率呈現下降趨勢，可能是由于液料比增大，乳清蛋白水解產物在較多水中被稀釋，其功能因子被疏散，導致其對α-葡萄糖苷酶的抑制作用減弱。因此，最佳液料比為30∶1 mL/g。

圖3 液料比對酶解產物活性的影響

2.1.4 酶解溫度對酶水解產物活性的影響

酶解溫度對酶水解產物α-葡萄糖苷酶抑制率的影響見圖4。40～45 ℃間溫度不斷升高，α-葡萄糖苷酶的抑制率不斷上升，溫度到達45 ℃時，酶促水解產物的抑制活性達到最大值40.72%，溫度高于45 ℃后，則出現下降現象，這是因為酶的耐受值因溫度升高而受到影響，溫度升高可能會使酶部分變性，酶的活性受到抑制，即有活性的酶的量減少，影響酶解的速率[19]。因此，最佳酶解溫度為45 ℃。

圖4 酶解溫度對酶解產物活性的影響

2.2 響應面法優化酶解工藝研究

2.2.1 響應面法試驗分析結果

由Design-Expert 8.0.6軟件設計的四因素三水平的響應面試驗，結果如表2所示。

表2 響應面分析方案及試驗結果

通過該軟件對試驗數據進行二次多元回歸擬合，得出Y=36.60+1.64A+0.77B-0.27C+2.199D+2.46AB-0.53AC-1.51AD-3.46BC-2.71BD+0.91CD-10.75A2-9.00B2-8.67C2-4.39D2。

為檢驗回歸方程的有效性，對回歸模型進行方差分析，結果見表3。

根據表5可知該模型p＜0.01，說明用木瓜蛋白酶酶解乳清蛋白制備降糖肽的α-葡萄糖苷酶抑制率的回歸方程模型極其顯著，同時失擬差p為0.374 8＞0.05，不顯著，說明所得回歸方程與實際擬合中非正常誤差所占比例較小，該模型具有合理性，回歸模型擬合程度良好，試驗誤差小，能夠準確地分析和預測制備乳清蛋白源降糖肽的工藝，具有一定的實踐指導意義。因此，該模型可用于分析和預測整體試驗結果。

由表3中F值可知，4個因素對酶水解產物抑制活性的影響順序為D＞B＞A＞C，其中酶解溫度和酶水解時間更為重要，故酶解溫度和時間對酶解產物速率抑制活性具有更大作用。在所有平方項中，A2、B2和C2對降糖肽工藝影響達到極顯著水平（p＜0.01），D2的對降糖肽工藝影響達到顯著水平（p＜0.05）， 四因素相互作用影響相對較小。根據F值的大小，每種因素在木瓜蛋白酶對乳清蛋白酶解中，木瓜蛋白酶酶解乳清蛋白制備降糖肽影響α-葡萄糖苷酶抑制率的作用順序為酶解溫度＞酶解時間＞pH＞液料比。

表3 響應面回歸模型方差分析

2.2.2 響應面法試驗分析結果

使用Design-Expert 8.0.6軟件根據回歸方程做出響應面圖。由圖5可知，在選定的試驗條件之內，固定一個變量，α-葡萄糖苷酶抑制率的大小先隨著另一個變量升高而增大，在達到最高值后會隨著另一個變量升高而減小，規律符合單因素試驗結果。響應面和等高線的稀疏程度可直觀地反映酶解溫度、酶解時間、液料比、pH之間交互作用對乳清蛋白降糖肽的α-葡萄糖苷酶抑制率的影響，當等高線呈圓形時表示兩因素交互作用不顯著，而呈橢圓形或馬鞍形時則表示兩因素交互作用顯著。在所設計的4個影響因素中，酶解溫度對α-葡萄糖苷酶抑制率的影響最大，其次是酶解時間，然后是pH，液料比對α-葡萄糖苷酶抑制率的影響最小，4個因素之間的影響無顯著交互作用（p＞ 0.05）。

圖5 各因素交互作用的響應面圖及等高線圖

2.2.3 最優工藝條件確定和驗證

使用Design-Expert 8.0.6軟件分析回歸方程，確定最優工藝條件：酶解時間4.08 h、液料比29.77∶1 mL/g、酶解溫度46.05 ℃和pH 5.07。在此工藝條件下，酶水解產物的抑制率的預測值為36.9%。

考慮到試驗條件和其他問題的可行性，改良的酶解工藝條件為酶解時間4.1 h，液料比30∶1 mL/g，酶解溫度46 ℃，pH 5.1，在此條件下，鑒定并獲得乳清源蛋白降糖肽。為此，進行3個平行試驗（表4）。降糖肽對α-葡萄糖苷酶的抑制率為36.1%，接近預測值。證明響應面分析方法對于酶促水解過程的優化結果相對準確和可靠。

3 結論與討論

試驗以乳清蛋白為材料，在單因素試驗基礎上再結合響應面的優化，獲得酶法制備乳清蛋白降糖肽的最佳工藝條件：酶解時間4.1 h、酶解溫度46 ℃、pH 5.1、液料比30∶1 mL/g。在此條件下，酶解產物對α-葡萄糖苷酶的抑制率為36.1%，試驗表明，在此工藝條件下制備的乳清蛋白葡萄糖苷酶抑制劑降糖肽具有不錯的降血糖活性，同時乳清蛋白作為天然成分，相對于人工合成藥物，乳清蛋白源降糖肽的副作用較小。此外，還可進一步深入研究，包括對酶解產物進行分離純化、結構鑒定。此次試驗可為乳清蛋白功能性產品的開發提供參考依據。