設計優化微波輔助法提取草石蠶中水蘇糖

欒凱雯，賀夢瑤，劉佳欣，湯興楠，朱建星，張萬忠

沈陽化工大學制藥與生物工程學院（沈陽 110142）

水蘇糖是在唇形科、豆科、玄參科等多種植物中存在的功能性低聚糖，其中在草石蠶中含量最高。水蘇糖分子式為C24H42O21，分子量666.59，屬于低聚半乳糖，被譽為“超強雙歧因子”，被廣泛用于食品、醫藥等領域[1-2]。 水蘇糖對腸道有益菌如雙歧桿菌、乳桿菌有特異性的增殖作用[3]，每天攝入0.5～3 g水蘇糖即有效果[4]。水蘇糖能增加機體對礦物元素的吸收，被認為與盲腸中的L-乳酸的提高有關[5]。

微波輔助提取法具有快速高效、節省溶劑、工藝簡單、應用面廣泛等特點[6-10]。此次試驗采用微波輔助法對干品草石蠶中水蘇糖進行提取，借助響應曲面以水蘇糖提取率為響應值，對微波輔助提取草石蠶中水蘇糖的工藝進行優化（微波功率、微波時間、微波溫度和料液比），得到最優的提取條件。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

草石蠶干品（亳州市康易飲生物科技有限公司）；蒸餾水；水蘇糖標準品（純度98%，廣東深圳潤慧生物科技有限公司）；乙腈（色譜純，德國SIMARK）。

GB1302型電子精密天平（梅特勒托利多儀器公司）；Agilent1200高效液相色譜儀；Mars6微波消解儀[培安CEM微波化學（中國）技術中心]；小型高速粉碎機（北京興時利和科技發展有限公司）；SHZ-D(Ⅲ)循環水式真空泵（鞏義市予華儀器責任公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 水蘇糖標準溶液的配制

稱取100 mg水蘇糖標準品溶于10 mL容量瓶中，加入蒸餾水溶解定容到10 mL，此時得到10 mg/mL的標準品溶液，將此標準溶液逐級稀釋成8，6，4和2 mg/mL的標準溶液，經孔徑0.45 μm微孔膜過濾后待用。

1.2.2 水蘇糖標準曲線的繪制

將過膜后不同濃度的水蘇糖標準品分別利用高效液相法[11-14]進行分析，進樣量均為20 μL，每種濃度標準品重復進樣3次，取平均值，以水蘇糖的濃度（X，mg/mL）與它們對應的峰面積（Y）進行線性回歸，繪制水蘇糖的標準曲線，得到水蘇糖標準曲線Y= 58 017.1X-43 538.4，R2=0.999 5。

1.2.3 色譜條件

色譜柱，TIANHE Kromasil NH2柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為V乙腈∶V水=70∶30；流速1 mL/min，柱溫40 ℃，進樣量20 μL。

1.3 水蘇糖的提取工藝及提取率測定

草石蠶干品粉碎過0.150 mm（100目）篩，得到草石蠶干品粉末，稱取若干份草石蠶粉末，以微波輔助法提取，抽濾得到上層溶液后過膜進樣，計算草石蠶中水蘇糖含量。水蘇糖提取率按式（1）計算。

式中：n為稀釋倍數；V為提取液體積，mL；Q為提取液水蘇糖含量，mg/mL；W為干粉質量，g。

1.4 單因素試驗

選擇料液比（1∶10，1∶15，1∶20，1∶25和1∶30 mg/mL）、提取溫度（40，50，60，70和80 ℃）、提取時間（2，4，6，8和10 min）、微波功率（200，300，400，500和600 W）進行單因素試驗，考察其對草石蠶中水蘇糖提取率的影響。

1.5 響應面優化試驗

在單因素試驗基礎上，根據Box-Behnken試驗設計原理，采用Design-Expert軟件，以水蘇糖提取率為影響值進行響應曲面優化，響應面因素和水平見表1。

表1 響應面因素和水平表

1.6 數據分析

通過SPSS 17.0軟件統計進行數據方差分析，p＜ 0.01表示差異具有顯著統計學意義，試驗結果用作圖軟件Origin 9.0繪圖。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 料液比對水蘇糖提取率的影響

在提取溫度50 ℃、提取時間4 min、微波功率400 W的條件下，料液比對水蘇糖提取率的影響如圖1所示。隨著液體比例不斷增加，提取率不斷增加，料液比1∶25 mg/mL時達到最大值，因為隨著溶液體積分數增加，草石蠶干品與溶液得到充分接觸，使得水蘇糖溶解率增加。料液比超過1∶25 mg/mL時，水蘇糖的溶解度達到飽和，其他雜質溶出影響水蘇糖的溶出，使得提取率下降。故料液比1∶25 mg/mL最合適。

圖1 料液比對水蘇糖提取率的影響

2.1.2 提取溫度對水蘇糖提取率的影響

在料液比1∶25 mg/mL、提取時間4 min、微波功率400 W的條件下，提取溫度對水蘇糖提取率的影響如圖2所示。隨著提取溫度不斷增加，提取率不斷增加，提取溫度60 ℃時達到最大值，當溫度繼續增加時，水蘇糖得率不斷下降，可能是因為溫度短時間內迅速升高加速其他雜質大量溶出，阻礙水蘇糖的溶出。故提取溫度選擇60 ℃最合適。

圖2 提取溫度對水蘇糖提取率的影響

2.1.3 提取時間對水蘇糖提取率的影響

在提取溫度60 ℃、料液比1∶25 mg/mL、微波功率400 W的條件下，提取時間對水蘇糖提取率的影響如圖3所示。隨著提取時間增加，水蘇糖得率先增加后下降，在6 min時得率達到峰值，8 min時開始下降，可能是使用微波提取時間過長會引起水蘇糖結構的破壞，故提取時間6 min最合適。

圖3 提取時間對水蘇糖提取率的影響

2.1.4 微波功率對水蘇糖提取率的影響

在提取溫度60 ℃、提取時間6 min、料液比1∶25 mg/mL的條件下，微波功率對水蘇糖提取率的影響如圖4所示。微波功率對水蘇糖的提取影響較大，隨著微波功率增加，提取率大幅增加，400 W時達到最大值。原因可能是隨著微波功率增加，分子運動逐漸劇烈，增加了水蘇糖的溶出，微波功率繼續增大，微波產生的強烈作用使水蘇糖結構遭到破壞，提取率下降。故微波功率選擇400 W最合適。

圖4 微波功率對水蘇糖得率的影響

2.2 響應面優化試驗結果

2.2.1 回歸模型的構建及方差分析

水蘇糖提取設計方案及結果見表2，回歸方差分析見表3，擬合所得多元二次回歸方程：Y=41.23+ 0.51A-0.13B-0.23C+0.036D-1.18AB-0.70AC+7.500E-003AD+0.38BC+0.48BD+0.12CD-1.07A2-1.88B2-2.50C2-1.32D2。

表2 響應面試驗設計和試驗結果

由表3可知，該回歸模型達到極顯著水平（p＜ 0.01），失擬項不顯著，R2=0.916 0，表明該模型的擬合程度較好，水蘇糖的提取率可以用該模型進行分析和預測。通過對比表3中的F值可以得出，影響水蘇糖提取率的主次順序為A＞C＞B＞D，即提取功率＞提取溫度＞提取時間＞料液比。

表3 回歸模型方差分析表

2.2.2 各因素間的交互作用

根據回歸方程做出的各兩因素交互作用的響應面分析見圖5。微波功率（A）和提取時間（B）交互（AB）的影響顯著。

圖5 各兩因素交互作用響應面

2.2.3 最優條件的確定及驗證試驗

用Design-Expert 8.0.6軟件對二次多項式回歸方程進行計算，得到提取水蘇糖的最佳工藝條件：微波功率400 W、提取時間5.6 min、提取溫度60 ℃、料液比1∶25 mg/mL。水蘇糖提取率的理論最優值是41.35%。參照試驗條件進行驗證試驗，得到的水蘇糖提取率為41.18%，與理論值的相對誤差為0.17%，說明該方法具有一定可操作性。

3 結論

以響應曲面法來優化微波輔助法提取水蘇糖條件，確定最佳提取條件：提取時間5.6 min、提取溫度60 ℃、微波功率400 W，料液比1∶25 mg/mL，水蘇糖的提取率可達41.18%。綜上，利用響應曲面法對草石蠶中水蘇糖的提取工藝進行優化的方法是科學的，為從草石蠶中提取水蘇糖以及對水草石蠶中水蘇糖的開發利用提供了理論依據。