藍光殺菌技術在散裝肉制品銷售環節的研究與應用

厲建軍，張建梅，孫曉紅，侯世松

煙臺喜旺肉類食品有限公司（煙臺 264000）

散裝肉制品因其口感勁脆、口味清香、細嫩爽滑、滋味優美、風味獨特、食用方便，深受廣大消費者喜歡。肉品營養豐富，但是由于散裝肉制品在銷售環節多為裸露銷售，極易受到二次污染，從而引發食品安全問題。

傳統熱殺菌技術，能有效滅活有害微生物，確保食品安全性，但高熱會引發許多不良反應，導致食品品質劣變，例如肉品營養、感官品質下降等[1]。藍光殺菌是一種非熱殺菌技術，可以在不改變或最小限度影響肉及肉制品感官品質和營養特性的前提下，有效抑制腐敗微生物的生長和繁殖，延長貨架期。藍光殺菌具有多方面優點：首先它不需要添加外源光敏劑；其次可以更好地殺滅或減少細菌生物膜內的細菌，到目前為止，尚無文獻報道細菌對其產生了抵抗性；第三藍光安全性高，光束能夠局限在細菌感染的區域，不會影響其他的非感染部位；第四光照輻射強度可被較好地調整和監控，相對抗菌藥物而言安全性更高[2]。目前，藍光已經被臨床廣泛用于治療痤瘡，并取得了很好的療效[3]。

國內外對藍光的研究大部分集中在醫學領域，在食品領域的研究很少，試驗以低溫肉制品為研究對象，明確藍光殺菌的關鍵參數，及藍光殺菌在低溫肉制品中的應用效果。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛肉，煙臺喜旺公司；單增李斯特菌ATCC 19115，廣東環凱微生物科技有限公司；胰蛋白胨大豆酵母浸膏瓊脂（TSA-YE）、營養瓊脂、平板計數瓊脂，北京陸橋技術股份有限公司；三氯乙酸、鹽酸、甲基紅、亞甲基藍等，國藥集團化學試劑北京有限公司。

1.2 儀器與設備

PL-2001-L電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；HPX-9162MBE電熱恒溫培養箱（上海博迅實業有限公司醫療設備廠）；K9840定氮儀（山東海能科學儀器有限公司）；TU-1810D紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；WGZ-XT細菌濁度儀（杭州奇威儀器有限公司）；PHS-3C pH計（上海儀電科學儀器股份有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌種復蘇

復蘇菌種前應準備適合該菌種生長的培養基和培養設備，所有操作均應在符合生物安全保護及無菌的條件下進行。復蘇前準備：將微量移液器、無菌槍頭、胰蛋白胨大豆酵母浸膏瓊脂（TSA-YE）等試驗用品放入生物安全柜，常規紫外線滅菌15 min，實驗者戴好口罩、帽子，然后使用75%酒精的脫脂棉球對生物安全柜操作臺進行再次消毒，雙手戴好實驗專用丁腈手套，并用75%酒精消毒。復蘇時首先拉開鋁蓋，用浸過75%酒精的脫脂棉球擦凈丁基膠塞及西林瓶，然后吸取液體培養基0.5～1 mL，滴入西林瓶內，輕輕振蕩，使凍干菌體溶解呈懸浮狀，用微量移液器取10～100 μL菌體懸浮液接種于TSA-YE平板培養基中，將接種后的培養基平板放入36 ℃培養箱中培養24～48 h即可形成菌落，觀察菌落的生長情況。菌落形成后，將培養基平板放入2～8 ℃冰箱中保存以備用[4]。

1.3.2 關鍵參數的確定

保存有單增李斯特菌落的TSA-YE培養基平板取出，用酒精燈火焰對接種環進行滅菌后，使用無菌接種環挑取單個菌落加入裝有10 mL PBS的無菌離心管中，混合均勻制成菌懸液。用細菌濁度儀測量細菌濁度為0.1 MCF時，此時相當于菌液濃度為1×108CFU/mL，使用PBS將單增李斯特菌液進行稀釋，然后將10ul 濃度為 1×106CFU/mL的單增李斯特菌菌液用無菌接種環均勻涂布于TSA-YE培養基中。

移去涂布后的TSA-YE平板的蓋子，用波長為450～ 470 nm的藍光照射平板4 h，藍光功率密度為 80 mW/cm2，5個平板的光源距離分別設20，25，30，35和40 cm，為了防止光照射過程中產熱而影響試驗結果，需將平板置于超凈臺中并予以通風。光照結束后，所有平板都放入36 ℃培養箱中培養24 h。然后取出平板，計算各個平板內的菌落數。確定最佳光源距離。

將涂布后的TSA-YE平板的蓋子打開，光源距離設為30 cm，分別給予0，0.5，1，2，3和4 h的藍光照射，其余操作同上。確定最佳光照時間。

1.3.3 驗證試驗

在0～10 ℃銷售冷柜上方日光燈旁固定藍光燈，牛肉正常陳列，每天取樣進行檢測，檢測項目為感官、菌落總數、pH、TBARS、TVB-N。同時進行對照試驗，試驗在相同的條件下重復3次。

1.3.4 指標測定

1.3.4.1 感官品質評定

依據GB 2726《食品安全國家標準 熟肉制品》，由10名具有食品專業背景的技術研發及工藝人員組成感官評定小組，從組織結構、質地口感、外觀色澤、風味滋味四個方面對上述產品進行逐一評價，并匯總票數[5]。對感官分值進行統計分析，根據分析結果對產品進行評價。具體評分標準與測試方法如表1所示。

表1 產品感官評分項目與評分標準

1.3.4.2 菌落總數的測定

參照GB 4789.2—2016食品安全國家標準食品微生物菌落總數測定中的方法測定。

1.3.4.3 pH 的測定

準確稱取5.0 g肉樣，加入50 mL蒸餾水，剪碎后按6 000 r/min分散30 s，勻漿用pH計在室溫下直接測定[6]。

1.3.4.4 脂質過氧化（TBARS）的測定

使用丙二醛（MDA）測定試劑盒，其原理是MDA作為脂質過氧化的終產物，與硫代巴比妥酸反應形成加合物，通過532 nm吸光度定量。首先收集500 μL菌懸液，并在4 ℃和8 000 r/min下離心5 min。將細胞沉淀重懸在500 μL PBS中，立即浸入液氮中，2 min后取出在冰上解凍；將解凍液在4 ℃和8 000 r/min離心5 min，取100 μL上清到1.5 mL離心管，再加入200 μL MDA工作溶液混合；最后，將反應混合物用沸水加熱15 min，冷卻至室溫，以6 000 r/min離心10 min，取200 μL上清液檢測532 nm處的吸光度[6]。

1.3.4.5 揮發性鹽基氮（TVB-N）的測定

參照GB/T 5009.228—2016自動凱氏定氮法進行測定。

1.3.4.6 單增李斯特菌的測定

參照GB 4789.30—2016第二法進行測定。

1.4 數據處理

試驗中每組數據均進行3次重復，使用IBM SPSS Statistics 26進行數據的統計分析，并對試驗數據采用單因素方差分析（ANOVA）進行分析。當p＜0.05 時，認為組間差異顯著。

2 結果與分析

2.1 藍光殺菌技術關鍵參數的確定

2.1.1 藍光光源距離對殺菌效果的影響

圖1顯示，藍光殺菌可顯著殺滅單增李斯特菌，與空白對照組比較，光源距離40 cm的藍光能夠殺滅小部分單增李斯特菌（p＞0.05）。從 35 cm光源距離開始，隨著距離的縮短，存活的單增李斯特菌數目越來越少，20 cm光源距離的藍光幾乎將全部的單增李斯特菌殺滅（p＜0.05）。

圖1 藍光光源距離對殺菌效果的影響（*p＜0.05）

2.1.2 藍光照射時間對殺菌效果的影響

由圖2可以看出，0.5 h和1 h藍光照射能夠殺滅小部分單增李斯特菌（p＞0.05）。從2 h藍光照射開始，隨著照射時間的增加，存活的單增李斯特菌數目越來越少，4 h照射時間的藍光幾乎將全部的單增李斯特菌殺死（p＜0.05）。

圖2 藍光照射時間對殺菌效果的影響（*p＜0.05）

2.1.3 藍光殺菌關鍵參數的確定

在對光源距離、照射時間進行單因素試驗的基礎上，使用正交設計優化二因素三水平得到最優組合，以菌落數為評價指標進行分析。最佳參數的試驗因素與水平如表2所示。

表2 藍光殺菌關鍵參數確定正交試驗因素水平表

極差值（R）反映的是因素對檢測指標的影響程度，R值越大表明對殺菌效果的影響越大。由表3數據可以看出，藍光照射時間對殺菌效果的影響較大。根據K值確定最優組合，光源距離和光照時間的水平分別為1和3時菌落數最低，即藍光殺菌的最佳參數為光源距離20 cm、照射時間4 h。

表3 正交試驗結果

考慮到實際操作的便捷性，在0～10 ℃銷售冷柜進行驗證時，選擇的最佳參數為光源距離30 cm、光照時間4 h。

2.2 藍光殺菌技術的驗證

2.2.1 藍光照射對產品感官的影響

由圖3可以看出，最優組合與對照組相比，感官評分均成下降趨勢。在儲存前3 d，感官評分無顯著差異（p＞0.05），最優組合在組織結構、質地口感、外觀色澤、風味滋味方面與對照組相差不大。3 d后，可能由于微生物增值等因素，導致對照組感官評分顯著降低（p＜0.05）。

圖3 藍光照射對產品感官的影響

2.2.2 藍光照射對菌落總數的影響

如圖4所示，菌落總數整體呈上升趨勢，藍光照射對菌落總數有抑制作用，在儲藏4 d時對照產品的菌落總數達到（4.91±0.09）lg CFU/g，最優組合的菌落總數為（3.90±0.07）lg CFU/g。至7 d時，對照產品的菌落總數達到（5.94±0.09）lg CFU/g，最優組合的菌落總數為（5.15±0.08）lg CFU/g。表明藍光照射可抑制菌落增殖。可能是因為藍光（BL）激發細胞內光敏劑如糞卟啉，這種光吸收過程導致能量轉移，產生高能單線態氧（1O2）；1O2半衰期很短，會迅速產生活性氧物質（reactive oxygen species，ROS）；ROS隨后造成細胞內生物大分子如蛋白質、核酸損傷，因為含巰基的蛋白質[7]和核酸[8]的生物分子易于被ROS氧化；最終導致細胞死亡[9]。綜上，藍光照射可以達到一定的抑菌效果。

圖4 藍光照射對菌落總數的影響

2.2.3 藍光照射對pH的影響

牛肉在冷藏期間pH變化情況如圖5所示，隨著時間的延長，兩種產品的pH均呈現下降趨勢，原因可能是產品在貯藏過程中被乳酸菌污染，乳酸菌繁殖產酸；還可能脂肪酸化和糖原分解產酸[10]；因產品存放時間較短，pH變化不明顯。

圖5 藍光照射對pH的影響

2.2.4 藍光照射對TBARS的影響

從圖6可以看出，在儲藏期間，對照組與最優組合的TBARS值變化趨勢均與時間呈正相關，兩組的TBARS值均呈上升趨勢，這可能是由于不飽和脂肪酸在氧的作用下發生了脂質氧化，其生成的醛和酮使得TBARS值升高[11]。貯存過程中，最優組合與對照組的TBARS值無顯著差異（p＞0.05），表明藍光照射對牛肉的脂質過氧化影響不大。

圖6 藍光照射對TBARS的影響

2.2.5 藍光燈照射對TVB-N的影響

由圖7可知，隨著時間的延長，兩組的TVB-N值均呈現上升的趨勢，并且對照組均顯著高于最優組合（p＜0.05），這可能是因為肉中蛋白質被降解為氨及胺類代謝產物的程度逐漸增大，使得揮發性鹽基氮值顯著升高[12]。對照組在第4天時TVB-N值高達（7.89±0.06）mg/100 g，而最優組TVB-N值僅為（5.37±0.04）mg/100 g，說明最優組對牛肉的TVB-N值的增長有抑制作用。直到第7天最優組的TVB-N值僅為（18.6±0.59）mg/100 g，而對照組已達到（24.8±0.49）mg/100 g，這表明藍光照射有效抑制了產胺類微生物的生長，這與測定的菌落總數趨勢相一致。因此，與對照組相比，最優組合有較好的保鮮效果。

圖7 藍光照射對TVB-N的影響

3 結論

通過正交試驗獲得了藍光殺菌的最優組合，結果表明使用藍光照射后產品的保鮮效果增強，最優組合為藍光光源距離30 cm、照射時間4 h。牛肉在0～10 ℃冷藏第7天時，其感官評分、菌落總數對數值、pH、TBARS和揮發性鹽基氮（TVB-N）分別為（68.3± 0.05）分，（5.62±0.05）lg CFU/g，（5.76±0.02），（2.71±0.03）mg/100 g和（18.6±0.59）mg/100 g，均顯著優于對照組（p＜0.05），最優組合能有效抑制牛肉腐敗變質，保持產品新鮮度。

由于藍光波長短，穿透深度比較淺，無法對食品的內部進行殺菌，但在一些散裝即食食品的銷售中進行應用，可以有效地抑制售賣過程微生物增殖，具有較好的保鮮效果。本研究中發現，待處理樣品粗糙度、表面疏水性等性質均會影響藍光殺菌的效果，但未見其相關研究報道，有待進一步研究。