苯醚甲環唑膠體金試紙條的研制及其應用

崔廷婷，朱亮亮，譚晨，王健，王兆芹，萬宇平*

1. 北京勤邦生物技術有限公司（北京 102206）；2. 北京市食品安全免疫快速檢測工程技術研究中心（北京 102206）；3. 河北北方學院（張家口 075000）

苯醚甲環唑（difenoconazole），又名惡醚唑，是一種廣譜高效的三唑類內吸性殺菌劑，能夠強烈地抑制細胞壁甾醇的生物合成，從而破壞細胞膜的結構和功能，最終阻止真菌生長[1-2]。其具有保護和治療作用，可以防治炭疽病、灰腐病、霜霉病、白粉病和葉枯病等常見病癥，被廣泛應用于谷物、水果、蔬菜、茶葉等作物[3]。但由于是直接噴灑在作物上，進而通過食用進入人體，可能會危害人體健康[4]，因此GB 2763—2021《食品安全國家標準食品中農藥最大殘留限量》中規定不同食品中苯醚甲環唑的殘留限量[5]。

已報道的檢測苯醚甲環唑的方法主要為氣相色譜法[6-7]、液相色譜法[8-9]及色譜-質譜聯用技術[10-12]等常規的儀器分析方法。這些方法均須在實驗室條件下操作，樣品前處理繁瑣費時，還需配備昂貴的儀器設備，檢測成本較高、耗時長、操作復雜，在實際應用中具有很大的局限性，難以滿足大量樣品現場快速檢測的需要。食品安全檢測朝著快速便捷的方向發展，試驗旨在建立一種簡單快速、適用于蔬菜中苯醚甲環唑殘留的膠體金免疫層析試紙條方法，以滿足大量樣品現場篩選和監控。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

苯醚甲環唑、腈菌唑、三唑醇、三唑酮、烯唑醇、氟環唑、己唑醇、戊唑醇、戊環唑、粉唑醇、丙環唑標準品（純度均≥98%，德國Dr. Ehrenstorfer GmbH公司）；牛血清白蛋白（BSA）、卵清蛋白（OVA）、Triton X-100、羊抗鼠IgG（美國Sigam公司）；碳酸鉀、吐溫-80、蔗糖、乙醇（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；硝酸纖維素膜（NC膜，德國Sartorius公司）；樣品墊、結合物釋放墊、吸水墊、PVC底板（上海捷寧生物科技有限公司）；膠體金溶液、苯醚甲環唑單克隆抗體、苯醚甲環唑半抗原-OVA偶聯物（北京勤邦生物技術有限公司實驗室自制）。

復溶緩沖液采用含BSA質量分數0.1%～0.3%、吐溫-80質量分數0.05%～0.2%、pH 7.2的0.02 mol/L磷酸鹽緩沖液；樣本提取液采用pH 7.0的0.02 mol/L磷酸鹽緩沖液。

1.2 儀器與設備

SBCJ磁力攪拌加熱器（河南圣亞儀器儀表有限公司）；TGL16C臺式高速冷凍離心機（湖南湘立科學儀器有限公司）；XYZ3060三維噴點平臺（美國Bio-Dot公司）；CTS300數控裁條機、ZQ2402微電腦自動斬切機（上海金標生物科技有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 苯醚甲環唑單克隆抗體-膠體金標記物的制備

磁力攪拌下，用0.2 mol/L碳酸鉀溶液調節膠體金溶液至pH 7.2，按每毫升膠體金溶液中加入25 μg抗體的標準向其中加入苯醚甲環唑單克隆抗體，繼續攪拌混勻30 min；靜置10 min后加入10% BSA，使其在膠體金溶液中的終濃度為1%，靜置10 min；按12 000 r/min、4 ℃離心40 min，棄上清液，沉淀用復溶緩沖液洗滌2次，用體積為初始膠體金體積1/10的復溶緩沖液將沉淀重懸，置4 ℃備用。

1.3.2 試紙條的制備與組裝

在NC膜上包被T線（苯醚甲環唑半抗原-OVA偶聯物，質量濃度1 mg/mL，包被量0.9 μL/cm）和C線（羊抗鼠IgG，質量濃度200 μg/mL，包被量0.9 μL/cm），包被好后于37 ℃過夜干燥；在結合物釋放墊上噴涂苯醚甲環唑單克隆抗體-膠體金標記物制成金標墊，0.01 mL/cm，噴好后37 ℃干燥1 h。將NC膜、樣品墊、金標墊、吸水墊及PVC底板組裝后切成3 mm寬的小條，裝在特制的塑料卡中，置于錫箔袋中，加干燥劑密封保存。試紙條的結構見圖1。

圖1 試紙條剖面結構示意圖

1.3.3 膠體金免疫層析條件優化

1.3.3.1 包被原和二抗包被液的選擇

將包被原和羊抗鼠IgG分別用1#～4#包被液（表1）稀釋后，用點膜儀噴涂到NC膜上形成T線和C線，組裝試紙條檢測陰性西藍花樣品，比較顯色情況，選擇C、T線顯色最合適的包被液作為包被原和二抗最佳包被液。

表1 包被液的優化

1.3.3.2 金標墊和樣品墊封閉液的選擇

將樣品墊、結合物釋放墊分別用1#～5#溶液（表2）浸潤后，37 ℃干燥；用噴膜儀將苯醚甲環唑單克隆抗體-膠體金標記物均勻噴涂到已封閉的結合物釋放墊上，制成金標墊。將不同封閉液處理的金標墊和樣品墊組合，與噴有包被原和二抗的NC膜、吸水墊組裝試紙條，檢測陰性西藍花樣品，比較顯色情況，選擇C、T線顯色和層析速度最合適、沒有背景色的試紙條對應的封閉液作為金標墊和樣品墊最佳封閉液。

1.3.4 樣品處理及檢測

取新鮮樣品擦去泥土，剪碎成小于1 cm見方的碎片；稱?。?.00±0.05）g樣品至離心管中，加入6 mL樣本提取液，上下振蕩30 s，靜置1 min，上層清液即為待檢液。取70 μL待檢液垂直滴加于試紙條加樣孔中，反應10 min判定結果。結果判定示意圖見圖2。

圖2 結果判定示意圖

1.3.5 試紙條性能指標的確定

1.3.5.1 檢測限

在空白新鮮西藍花中添加苯醚甲環唑標準品，分別至質量濃度為0，0.1，0.2，0.5和1.0 mg/kg，用試紙條進行檢測，每個濃度重復2次，根據結果確定試紙條檢測限。

1.3.5.2 準確性

取空白新鮮西藍花、彩椒、大白菜、黃瓜、菜豆、洋蔥樣品，各10份，分別添加苯醚甲環唑標準品至質量濃度大于等于檢測限，用試紙條進行檢測，計算假陽性率和假陰性率。

1.3.5.3 特異性

分別向空白西藍花樣品中添加其他常見的三唑類殺蟲劑（腈菌唑、三唑醇、三唑酮、烯唑醇、氟環唑、己唑醇、戊唑醇、戊環唑、粉唑醇、丙環唑）至質量濃度10 mg/kg，用試紙條進行檢測，每種藥物重復2次，根據結果判定試紙條特異性。

2 結果與分析

2.1 包被原和二抗包被液的優化

由表1可知，包被液中添加物不同會影響C、T 線呈色，4#包被液處理的顯色清晰，色澤好，因此選用4#包被液，即0.02 mol/L pH 7.4 PB+2%乙醇混合溶液作為包被原和二抗的最佳包被液。

2.2 金標墊和樣品墊封閉液的優化

在金標墊和樣品墊的封閉過程中，常選用一定的BSA和蔗糖封閉玻璃纖維膜的孔隙，減少非特異性吸附，同時還加入表面活性劑以利于層析反應的進行[13]。選擇5種封閉液處理玻璃纖維膜，制備金標墊和樣品墊，觀察不同封閉液處理的試紙條C、T線顯色和試紙條背景色情況，結果見表2。

表2 封閉液的優化

封閉液中加入蔗糖，能使C、T線顯色變深，不含蔗糖的1#和3#封閉液處理的C、T線顯色較淺；另外，封閉液中加入表面活性劑Triton X-100能有效減弱背景色，如3#，4#和5#封閉液中含有0.05% Triton X-100，無背景色，而其他封閉液處理的大都有背景色。4#封閉液處理的金標墊和樣品墊C、T線顯色合適，且無背景色，因此選用4#封閉液，即0.02 mol/L pH 7.4 PB+0.5% BSA+0.05% Triton X-100+2.5%蔗糖混合溶液作為金標墊和樣品墊的最佳封閉液。

2.3 檢測限

由圖3可知：隨著苯醚甲環唑質量濃度的增加，T線顯色逐漸變淺；直至濃度0.5 mg/kg時，T線顯色明顯弱于C線顯色，檢測結果呈陽性。因此，可判定此次研究開發的膠體金試紙條的檢測限為0.5 mg/kg。

圖3 苯醚甲環唑試紙條檢測限結果

2.4 準確性

用試紙條檢測空白蔬菜樣品及添加苯醚甲環唑至0.5 mg/kg的加標陽性蔬菜樣品各60份，結果顯示：空白蔬菜樣品的檢測結果中出現2個陽性，假陽性率為3.33%；苯醚甲環唑添加濃度0.5 mg/kg的陽性蔬菜樣品檢測結果全為陽性，假陰性率為0。由于膠體金免疫層析法是通過肉眼觀察判斷T線與C線顏色的變化來確定樣本陰陽性，具有一定主觀性，可能會出現假陽性問題[14]。

2.5 特異性

由表3可知，苯醚甲環唑試紙條檢測與其具有類似功能或結構的農藥時，結果均為陰性，即與其他三唑類殺蟲劑無交叉反應，具有較好的特異性。

表3 苯醚甲環唑試紙條特異性結果

3 結論

試驗以膠體金標記苯醚甲環唑單克隆抗體，在優化包被原和二抗包被液、金標墊和樣品墊封閉液等免疫層析條件下，基于競爭抑制反應原理，研制苯醚甲環唑快速檢測試紙條，并應用于蔬菜檢測中。該試紙條對西藍花、彩椒、大白菜、黃瓜、菜豆、洋蔥等蔬菜中苯醚甲環唑的檢測限為0.5 mg/kg，可滿足GB 2763—2021[5]中規定的最大殘留限量；該試紙對其他三唑類殺蟲劑無交叉反應，可特異性地檢測蔬菜中苯醚甲環唑的殘留；假陽性率為3.33%，假陰性率為0，檢測時間＜15 min，適用于基層實驗室大批量樣本檢測及田間地頭的現場快速檢測。

在試紙條應用過程中發現，由于膠體金免疫層析法是通過肉眼觀察判斷T線與C線顏色的變化來確定樣本陰陽性，容易受產品熟悉程度及試驗人員經驗的影響，可能會出現假陽性問題，因此后續研制中可以通過匹配膠體金讀數儀來進行準確定量。但考慮到免疫檢測的固有屬性，仍不能完全排除假陽性的出現，因此對于檢測結果中出現的陽性樣本，還需要用國家標準中規定的儀器方法進行確證。而且GB 2763—2021中規定有最大殘留限量的食品種類較多，試紙條僅調試西藍花、彩椒、大白菜、黃瓜、菜豆、洋蔥6種蔬菜，樣本量較小，可在后續應用中擴大樣本種類和數量，以更好地應用于食品中農藥殘留的監控。