SPE凈化-UPLC-MS/MS法測定食品中二氫槲皮素

公丕學，劉桂亮，廉貞霞，薛霞，王駿，劉艷明*

1. 山東省食品藥品檢驗研究院（濟南 250101）；2. 山東省特殊醫學用途配方食品質量控制技術研究中心（濟南 250101）；3. 山東省藥學科學院（濟南 250101）

二氫槲皮素（dihydroquercetin，DDQ）是一種存在于多種植物中的天然二氫黃酮醇類化合物（化學結構式見圖1），在落葉松中含量較高[1-3]。近年來，在水果中也發現DDQ的存在[4-7]，特別是在葡萄、橘子和西柚中[4,6]。DDQ因具有抗腫瘤、抗氧化、抗輻射、抗病毒、抗心血管系統疾病[8-9]、改善毛細血管微循環、改善腦部血液循環、抗血小板凝聚等作用[10-11]，用于治療腦梗及其后遺癥、腦血栓、心臟冠狀動脈等疾病[12-13]，因此將其開發為食品添加劑、保健食品和藥品等相關產品，具有極大的研發價值和廣闊的市場前景[8,10,13-14]。鑒于二氫槲皮素在嬰幼兒、兒童（14歲及以下）、孕婦、哺乳期婦女人群中的食用安全性資料不足，從風險預防原則考慮，上述人群不宜食用。DDQ最大推薦食用量為100 mg/d，在食品領域中，主要是當作活性添加劑，在增加食品保質期的同時還能保留原本的味道，并且有一定預防疾病的作用。歐盟已批準落葉松來源的DDQ為新食品原料，俄羅斯已批準DDQ作為食品原料和食品添加劑使用。2020年國家衛生健康委通過DDQ作為新食品原料在飲料（20 mg/L），發酵乳和風味發酵乳（20 mg/kg），可可制品、巧克力和巧克力制品（70 mg/kg）中[15]等食品中使用并規定最大添加量，但是國內還未建立針對食品中DDQ的食品國家安全標準，因此有必要建立食品中DDQ的定量檢測方法。

圖1 DDQ結構式

測定DDQ的方法主要有高效液相色譜法[16-17]、熒光法[18]、液相色譜串聯質譜法[5,19]及分光光度法[20]。高效液相色譜方法靈敏度低，分析時間長，降低檢測效率；熒光分析方法靈敏度高，當食品基質復雜時易受干擾，定量準確性差；分光光度法存在靈敏度低，定量結果不準確等問題；液相色譜串聯質譜法樣品前處理步驟簡單，選擇性好，靈敏度高，定性定量準確。DDQ測定方法針對的基質多是水果[6]、植物[14]和中藥[16]等。針對食品復雜性和多樣性，通常選用的提取凈化方式有超聲微波法[14,21]、SPE柱凈化[22-23]和QuEChERS（quick，easy，cheap，effective，rugged and safe）基質分散固相萃取[24-25]。試驗選取發酵乳和可可制品國家允許添加食品基質為研究對象，對樣品預處理條件和儀器條件進行優化選擇。采用甲醇-2%乙酸（1∶1，V/V）混合溶劑提取，HLB SPE柱凈化，高效液相色譜串聯質譜法快速測定批量食品中DDQ。

試驗旨在建立準確快速測定食品中DDQ含量的液相色譜串聯質譜方法，為制定食品中DDQ的檢測提供參考，為企業和監管部門提供行之有效的準確定性定量檢測方法。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與裝置

ACQUITYTMUPLC超高效液相色譜儀及Xevo TQ-S質譜分析儀配有電噴霧（ESI）離子源（美國Waters公司）；MS-3旋渦混合器（德國IKA公司）；超聲波清洗器（寧波新芝生物科技股份有限公司）；3-18k高速冷凍離心機（德國SIGMA公司）；Milli-Q超純水儀（美國Millipore公司）；溫控氮吹儀（美國Organomation公司）。

1.2 主要材料與試劑

DDQ標準品（CAS 480-18-2，純度＞98%，上海安譜公司）；甲醇（色譜純，德國Merck公司）；乙腈、甲酸、乙酸（色譜純，德國Merck公司）；ACQUITY UPLC HSS T3（1.8 μm，2.1 mm×100 mm，美國Waters公司）；ACQUITY UPLC BEH C18（1.8 μm，2.1 mm×100 mm，美國Waters公司）；ACQUITY UPLC HILLIC（1.8 μm，2.1 mm×100 mm，美國Waters公司）；Hypersil Hypercarb（3 μm，2.1 mm×100 mm，美國Thermo Scientific公司）；Bond Elut C18（C18，500 mg/6 mL，美國agilent公司）；Waters OASIS HLB（HLB，200 mg/6 mL，美國Waters公司）；Waters Oasis PRiME HLB（PRiME HLB，200 mg/6 mL，美國Waters公司）；發酵乳、可可制品（均購自當地市場）。

1.3 標準溶液配制

稱取適量的DDQ標準品，用甲醇配成1 mg/mL標準物質儲備液，-18 ℃保存3個月。用初始流動相乙腈-0.1%甲酸（1∶9，V/V）將DDQ儲備液稀釋成質量濃度為0.01，0.02，0.05，0.10，0.20，0.50和1.00 μg/mL標準系列溶液，供UPLC-MS/MS測定。

1.4 樣品前處理

準確稱取2.0 g樣品至50 mL離心管，加入25 mL混合提取溶劑甲醇-2%乙酸（1∶1，V/V），渦旋5 min，超聲提取20 min，用提取溶劑定容至50 mL，以8 000 r/min離心5 min，取5 mL清液用20 mL水稀釋混合均勻后，過HLB SPE柱凈化（上樣前SPE柱依次用6 mL甲醇，6 mL水活化），控制流速約1.0 mL/min，上樣完成后用5 mL水淋洗，8 mL甲醇洗脫，收集洗脫液在45 ℃水浴中氮吹至近干，用5 mL初始流動相復溶，超聲溶解5 min后，渦旋1 min后，過0.22 μm微孔有機濾膜，濾液供UPLC-MS/MS測定。

1.5 試驗條件

1.5.1 色譜條件

色譜柱，ACQUITY UPLC HSS T3（1.8 μm，2.1 mm× 100 mm）；柱溫40 ℃；流速0.3 mL/min；進樣量1.0 μL；流動相A乙腈、B 0.1%甲酸。流動相梯度：0～2 min，10% A；2～5 min，10%～95% A；保持1 min，95% A；6～6.5 min，95%～10% A；保持1.5 min，10% A。

1.5.2 質譜條件

離子源，采用電噴霧離子源（ESI）；掃描方式，采用負離子掃描；檢測方式，采用MRM檢測；毛細管電壓2.2 kV，錐孔電壓45 V，離子源溫度150 ℃，脫溶劑氣溫度450 ℃，錐孔氣流速150 L/h，碰撞氣流速0.15 mL/min；脫溶劑氣流速850 L/h。DDQ的關鍵質譜參數見表1所示。

表1 化合物優化的關鍵質譜參數

1.5.3 基質效應評價

在液相色譜質譜聯用技術中基質效應（matrix effect，ME）普遍存在，主要是由于樣品基質溶液中共萃取物與目標分析物在離子源上存在離子競爭效應，通常有離子增強和離子抑制兩種作用[26]。不含DDQ的樣品基質按樣品前處理方法處理，獲得空白基質溶液，用基質空白溶液稀釋標準溶液，用初始流動相稀釋標準溶液與空白基質溶液稀釋相同濃度DDQ標準液的響應值進行比較，評估DDQ的基質效應，可通過式（1）計算。

式中：A為標準溶液中分析物的峰面積；B為樣品處理液中分析物的峰面積。ME接近100%時，表現為無基質效應；大于100%時，表現為基質增強；反之，則為基質抑制。

2 結果與討論

2.1 樣品預處理條件優化

2.1.1 提取溶劑的優化

以發酵乳和可可制品為試驗對象，分別考察甲醇與2%乙酸不同比例混合提取溶劑對DDQ提取效率的影響。0，25%，40%，50%，60%，75%和100% 7種不同比例提取溶劑對不同基質的提取效率如圖2所示。結果表明，不同比例提取溶劑對發酵乳提取效率接近，對可可制品中的DDQ提取效率不同。提取可可制品中DDQ時，水相比例升高時，DDQ回收率提高，水相比例達到50%時提取回收率最高，水相比例繼續提高時DDQ提取效率降低。發酵乳中DDQ用不同比例提取溶劑提取時，提取效率接近，推測是因為發酵乳中蛋白含量可能由于甲醇和酸溶液的加入，致使蛋白沉淀變性，因此基質共萃取物對DDQ提取影響較小。然而可可制品基質比發酵乳基質更復雜，當用甲醇或酸溶液單獨作為提取溶劑時，DDQ很難從可可制品中提取出來，但體系中甲醇和2%乙酸水同時存在時，對基質中的脂肪、蛋白質等雜質有沉淀作用，降低共萃取物的含量，從而提高對DDQ的提取效率，但甲醇-2% HAc（50%，V/V）時，提取效率最高。因此選擇甲醇-2% HAc（50%，V/V）作為最優提取溶劑。

圖2 提取溶劑比例對DDQ的影響

2.1.2 固相萃取柱的選擇

DDQ由于結構式中含有多個羥基基團，極性較強，易溶于水，在反相色譜中不易保留。食品基質含有糖類、脂肪、蛋白質等多種雜質，為準確測定出不同食品基質中DDQ含量，要降低共萃取物的提取效率，因此試驗選擇通過使用固相萃取方法提高雜質去除效果，提高靈敏度。選擇常用3種固相萃取柱C18、HLB、和PRiME HLB對DDQ的凈化效果進行試驗，結果如圖3所示。使用HLB固相萃取柱時回收率最高。PRiME HLB和C18固相萃取柱回收率低于80%，比HLB固相萃取柱提取回收率低，因此選擇HLB固相萃取柱用于后續試驗前處理樣品凈化步驟中，提高分析的靈敏度和準確度。

圖3 DDQ通過SPE柱的回收率

2.1.3 稀釋比例的優化

上樣溶液的有機相比例對化合物在HLB柱上保留效果有影響，提取溶液甲醇含量為50%，試驗用水按照0，1，2，3，4，5和6的不同稀釋比例將樣品提取溶液進行稀釋后上柱試驗，結果如圖4所示。比例低于4時，DDQ回收率低于80%，可能是由于低稀釋比例時甲醇含量高，不利于DDQ在固相萃取柱上保留，因此回收率偏低。稀釋比例為4時，DDQ回收率約95%，稀釋比例繼續增大時，回收率幾乎不變，但是上樣時間增長，不利于提高試驗效率。說明稀釋比例大于4時（稀釋比例為4時，甲醇比例為10%），DDQ能夠較好地吸附于HLB柱上，不會在上樣時因甲醇比例過高而損失。按照稀釋比例大于4時，甲醇含量在10%以下，目標化合物能在SPE上很好保留。因此將提取溶液與水按照1∶4（V/V）稀釋后進行固相萃取富集凈化，DDQ能夠吸附在固相萃取柱上不會損失。

圖4 提取液稀釋倍數在SPE柱上的回收率

2.1.4 洗脫體積的優化

在固相萃取凈化洗脫過程中，洗脫液體積以能夠完全洗脫最小體積為前提，根據DDQ回收率變化選擇最合適的洗脫液體積，洗脫液體積越小時，洗脫雜質越少，但是同時DDQ在固相萃取柱上保留需要進一步考察。試驗發現使用不同體積甲醇對DDQ洗脫時對目標物洗脫有影響。選擇甲醇體積0.5，1.0，2.0，5.0，8.0和10.0 mL進行考察，洗脫曲線如圖5所示。甲醇體積小于8 mL時，DDQ回收率隨甲醇體積增大而提高。體積8 mL時回收率達到90%左右，甲醇體積繼續增大時，回收率幾乎不變，說明DDQ幾乎完全從固相萃取柱上洗脫下來。但是增大甲醇體積，則會延長氮吹濃縮時間，降低試驗效率，同時會造成資源浪費和環境污染。綜合考慮，選擇洗脫液甲醇體積為8 mL。

圖5 洗脫體積對DDQ提取的影響

2.2 色譜條件的優化

從DDQ結構可以看出，不適合親水色譜柱分離分析，因此選擇使用反相色譜柱進行分析。在反相色譜柱上目標物的保留時間適宜，峰形更好，但是DDQ在BEH C18色譜柱上有拖尾和色譜峰展寬現象，同時DDQ響應值變低。HSS T3色譜柱在分離DDQ時有更好的峰形，響應值更高，因此采用HSS T3色譜柱進行分析檢測。

流動相的酸堿性會影響DDQ離子化效率，同時也會影響液相色譜峰峰形，試驗比較中性流動相（A乙腈-10 mmol/L乙酸銨）、堿性流動相（B乙腈-0.1%氨水（V/V））、酸性流動相（C乙腈-0.1%甲酸（V/V））3種不同pH流動相體系。在相同分離程序下，考察DDQ峰形及響應情況，試驗結果如圖6所示。在流動相B條件下的DDQ峰形要比其他2種流動相的峰形差，A和B峰形都很好，但是流動相A條件的質譜信號響應值低于流動相C條件，說明在流動相C條件下離子化效率比在流動相A條件下要高。因此選擇乙腈-0.1%甲酸作為流動相，色譜峰峰形好，靈敏度高。

圖6 DDQ在不同流動相的總離子流圖（TIC）

2.3 質譜條件的優化

質譜試驗中通常選用ESI和APCI這2種電離方式，根據結構可以分析DDQ屬于極性較強的化合物，由于APCI電離方式適合檢測中等極性或者弱極性的化合物，因此選擇ESI電離方式更適合DDQ的檢測。

將質量濃度100 ng/mL的DDQ標準溶液注入三重四級桿質譜儀，分別在正負模式下進行母離子掃描，發現在負離子模式下響應強，通過結構分析，可能是因為DDQ含有易失去氫的羥基基團，使得在ESI-模式下進行母離子掃描，確定其準分子離子峰豐度最大條件，得到母離子質核比為303；調節質譜參數后進行子離子掃描，進一步優化碰撞電壓等質譜參數，選擇2個豐度較高的子離子，以豐度相對高的子離子303＞285作為定量離子，以豐度相對較低的子離子303＞125作為輔助定性離子，最終得到優化參數見1.5.2中表1所示。

2.4 基質效應評價分析

通過評估DDQ在不同食品基質中的基質效應，選擇合適的定量方式，在不含DDQ的處理溶液中加入與標準溶液相同濃度的標準物質。通過式（1）進行基質效應計算，當基質效應接近100%時，表現為無基質效應；大于100%時，表現為基質增強；反之，則為基質抑制。評價DDQ質量濃度10，50，100，500和1 000 ng/mL在發酵乳和可可制品基質中的基質效應，結果如圖7所示。DDQ在發酵乳基質中表現為基質增強效應，可可制品中為基質抑制效應。質量濃度10 ng/mL時，基質效應明顯，但質量濃度50 ng/mL以上時不同基質的基質效應變化不大，發酵乳為基質增強，可可制品則為基質抑制，因此DDQ濃度低時，受樣品基質影響較大，質量濃度大于50 ng/mL時，不同基質對不同濃度DDQ素影響不大，但定量結果也存在偏差，仍存在較強基質效應，不適合直接用標準溶液進行定量，因此選擇空白基質稀釋標準溶液外標法定量方式。

圖7 DDQ在不同基質中的基質效應

2.5 方法線性范圍和檢出限

用空白基質稀釋流動相將DDQ儲備液逐級稀釋得到質量濃度為10，50，100，200，500和1 000 ng/mL的系列標準溶液。將系列標準工作液按濃度從低到高的順序，按1.5試驗條件進行測定，以DDQ峰面積（y）為縱坐標對質量濃度（x）為橫坐標繪制標準曲線。DDQ在10～1 000 ng/mL之間線性關系良好，線性回歸方程為y=1 516.9x+443.2，線性相關系數為0.999 3，以信噪比約為3時計算得到DDQ的檢出限為0.040 mg/kg，以信噪比約為10時計算得到DDQ的定量限為0.125 mg/kg，樣品含量超過線性范圍時，需要稀釋到線性范圍內進行定量。

2.6 方法的回收率和精密度

以發酵乳和可可制品樣品為研究對象，進行添加回收率和精密度試驗。分別添加3個濃度水平，按照建立的試驗方法進行處理，每個添加水平平行測定6次，回收率和相對標準偏差計算結果見表2所示。DDQ平均回收率在87.2%～98.6%，測定結果表明相對標準偏差（RSD）為1.2%～4.3%。

表2 添加回收率與精密度（n=6）

2.7 實際樣品測定

用試驗建立的方法對市場上購買的20批次發酵乳和10批次可可制品進行DDQ檢測，檢測結果均為未檢出。可能由于在國內剛批準DDQ作為新食品原料在食品中添加使用，食品生產企業還沒有在食品中添加DDQ，所以樣品中都沒有檢出。

3 結論

通過對提取、凈化及流動相選擇等因素進行優化，建立適用于食品中DDQ的液相色譜串聯質譜定性定量檢測方法。針對不同食品基質，選擇提取溶劑，提高提取效率；優化固相萃取方法，提高凈化效果，提高方法的準確性及靈敏度；同時對DDQ在不同食品中的基質效應進行評價，選擇合適的定量方式。該方法線性范圍寬，靈敏度高、準確性好，適用于不同食品基質中DDQ的定性確證與定量檢測，可為標準制定和政府監管提供技術支持和數據積累。